Name: a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы благодарим центр визуализации CIFF, NCBS за использование конфокальных микроскопов, поддерживаемых DST - Центром нанотехнологий (No. SR/55/NM-36-2005). Мы благодарим финансирование исследований от DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), вращающийся диск при поддержке DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK и Gautam Menon) и грант HHMI-IECS номер 55007425 (SPK). Штаммы HB101, PS3239 и wdIs51 были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). S.P.K. сделал jsIs609 в лаборатории Майка Нонета.

1. Изготовление устройства роста и визуализации
<ol><li>Изготовление пресс-форм SU8<ol><li>Проектирование шаблонов 1 (проточный слой) и 2 (контрольный слой) с использованием прямоугольных форм в программном обеспечении для обработки текстов (или программном обеспечении автоматизиров...

<ol>
	<li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy.">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435 (2010).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).</li><li>Steele, L. M., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+Anesthetic+Mechanisms:+The+C.+elegans+Model.">Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model.</a> Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).</li><li>C&#225;ceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+orienting+C.+elegans+using+geometry+at+microscale+for+high-throughput+visual+screens+in+neurodegeneration+and+neuronal+development+studies.">Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies.</a> PloS One. 7 (4), 35037 (2012).</li><li>Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+device+for+size+based+separation+of+C.+elegans+developmental+stages.">A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages.</a> Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li><li>Desta, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing.">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li><li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics.">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant.">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying,+phenotyping,+and+long-term+live+imaging.">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192 (2015).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration.">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis,+Microscopy,+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans.">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device.">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li><li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics.">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li><li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development.">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biostable,+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices.">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li><li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices:+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells.">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li><li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials.">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li><li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+PDMS+(polydimethylsiloxane)+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes.">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve.">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PloS One. 7 (12), 51499 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+for+Caenorhabditis+elegans+vulval+cells.">Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells.</a> Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).</li><li>Fatouros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Tau+aggregation+in+a+novel+caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity.">Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).</li><li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+and+cell-speci+fi+c+expression+pro+fi+ling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans.">Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusogen+EFF-I+controls+sculpting+of+mechanosensory+dendrites.">The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites.</a> Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).</li><li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neuron+fates+are+distinguished+by+a+transcriptional+switch+that+regulates+dendrite+branch+stabilization.">Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization.</a> Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).</li><li>Shrestha, B. R., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphogenesis:+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization.">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li><li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-16/JIP3+and+UNC-76/FEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport.">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response.">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

В данной работе описан протокол изготовления и использования простого микрофлюидного устройства для выращивания C. elegans с постоянным питанием и визуализацией высокого разрешения одного животного во время его развития. Этот процесс изготовления прост и может быть выполнен в несте...

Caenorhabditis elegans оказался мощным модельным организмом для изучения клеточной биологии, старения, биологии развития и нейробиологии. Такие преимущества, как прозрачное тело, короткий жизненный цикл, простота обслуживания, определенное количество клеток, гомология с несколькими человеческими генами и хорошо изученная генетика, привели к тому, что C. elegans стал популярной моделью как для открытий фундаментальной биологии, так и для прикладных исследований 1,2. Понимание биологических и эволюционных процессов клетки из повторяющихся долгосрочных наблюдений за отдельными животными может оказаться полезным. Условно C. elegans обезболивают на агаровых подушечках и визуализируют под микроскопом. Неблагоприятное воздействие анестетиков на здоровье животных ограничивают применение анестезируемых животных для длительной и повторной прерывистой визуализации одного и того же животного 3,4. Последние достижения в области микрофлюидных технологий и их адаптация к безанестезному отлову C. elegans с незначительной опасностью для здоровья позволяют получать изображения одного и того же животного с высоким разрешением в течение короткого и длительного периода времени.
Микрофлюидные чипы были разработаны для высокопроизводительного скрининга C. elegans'5 6,7,8, улавливания и дозирования 9, скрининга лекарств10,11, стимуляции нейронов с помощью визуализации высокого разрешения12 и визуализации животного с высоким разрешением 12,13,14. Также разработаны ультратонкие микрофлюидные листы для иммобилизации на слайдах15. Долгосрочные исследования C. elegans были выполнены с использованием изображений животных с низким разрешением, растущих в жидкой культуре, для наблюдения за ростом, динамикой кальция, влиянием лекарств на их поведение 16,17,18,19, их долголетием и старением 20. Долгосрочные исследования с использованием микроскопии высокого разрешения были проведены для оценки синаптического развития21, регенерации нейронов22 и митохондриального добавления23. Долгосрочная визуализация высокого разрешения и отслеживание судьбы и дифференцировки клеток были выполнены в многоканальных устройствах24,25. Несколько клеточных и субклеточных событий происходят в течение нескольких часов и требуют захвата одного и того же человека в разные моменты времени во время их развития, чтобы охарактеризовать все промежуточные этапы процесса для понимания клеточной динамики in vivo. Чтобы изобразить биологический процесс, такой как органогенез, развитие нейронов и миграция клеток, животное должно быть обездвижено в одной и той же ориентации в нескольких точках времени. Ранее мы опубликовали протокол для визуализации C. elegans с высоким разрешением в течение более 36 ч, чтобы определить, где митохондрии добавляются вдоль нейронов сенсорных рецепторов (TRNs)23.
В этой статье представлен протокол для создания методологии на основе микрофлюидики для повторного изображения с высоким разрешением. Это устройство с одним каналом потока лучше всего подходит для повторной визуализации одного животного на устройство. Чтобы улучшить пропускную способность и изображение многих животных одновременно, несколько устройств могут быть подключены к одной и той же линии давления, но с отдельными трехсторонними разъемами, управляющими одним животным в каждом устройстве. Дизайн полезен для исследований, которые требуют покадровых изображений с высоким разрешением, таких как постэмбриональные процессы развития, миграция клеток, транспорт органелл, исследования экспрессии генов и т. Д. Технология может быть ограниченной для некоторых применений, таких как исследования продолжительности жизни и старения, которые требуют параллельного роста и визуализации многих животных на поздней стадии. Для изготовления этого устройства использовался эластомер полидиметилсилоксана (PDMS) из-за его биостабильности26, биосовместимости 27,28, газопроницаемости 29,30 и перестраиваемого модуля упругости31. Это двухслойное устройство позволяет выращивать животных с непрерывной подачей пищи в микрофлюидном канале и улавливать отдельных C. elegans через мембранное сжатие PDMS с использованием газообразного азота. Это устройство является расширением ранее опубликованного устройства с преимуществом выращивания и визуализации одного и того же животного в микроканале под непрерывной подачей пищи3. Дополнительная изоляционная мембранная сеть и улавливающая мембрана шириной 2 мм обеспечивают эффективную иммобилизацию развивающихся животных. Устройство использовалось для наблюдения за развитием нейронов, развитием вульвы и дендритной арборизацией в сенсорных нейронах PVD. Животные растут без неблагоприятных последствий для здоровья в устройстве и могут быть многократно обездвижены, чтобы облегчить визуализацию субклеточных событий у одного и того же животного во время его развития.
Весь протокол разделен на пять частей. Часть 1 описывает изготовление устройства для чипа роста и визуализации. В части 2 описывается, как настроить систему давления для отклонения мембраны PDMS для иммобилизации и изоляции отдельных C. elegans. Часть 3 описывает, как синхронизировать C. elegans на пластине среды роста нематод (NGM) для визуализации устройства. Часть 4 описывает, как загрузить одно животное в устройство и вырастить животное внутри микрофлюидного устройства в течение нескольких дней. Часть 5 описывает, как обездвижить отдельное животное в нескольких точках времени, захватить изображения с высоким разрешением с использованием различных целей и проанализировать изображения с помощью Фиджи.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>Gauge 18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WW-30600-02</td>
			<td>Masterflex fitting with luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>EMCCD C9100-13no</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit board film</td>
			<td>Fine Line Imaging, Colorado, USA</td>
			<td></td>
			<td>The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Meta-Lab Scientific Industries, India</td>
			<td>MSI-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Blue stat microscopic cover glass</td>
			<td></td>
			<td>22mm x 10Gms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hi media</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris uni-core puncher 1mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Z708801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>&#160;IKA</td>
			<td>RCT B S 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 5 LIVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td>0.5-10 &#181;L micropipette tips are used for food supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-1</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2025</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-2</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2050</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Local Supplier</td>
			<td>Commercial nitrogen gas</td>
			<td>Cylinder volume of 7 cubic meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Curing solution)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>&#160;Sylgard curing solution</td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>&#160;PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor and blades</td>
			<td>Lister surgical Blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer (Base)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>Sylgard 184 base</td>
			<td>elastomer base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer, MA, USA</td>
			<td>[100] orientation, 4-inch diameter</td>
			<td>Small pieces (2 mm &#215; 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>SPS-Europe B.V., The Netherlands</td>
			<td>SPIN 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk microscope</td>
			<td>Perkin Elmer ultra-view VOX system</td>
			<td>CSU-X1-A3 N</td>
			<td>The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>Microchem, MA, USA</td>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>448931</td>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td>
			<td></td>
			<td>200 Watt and collimated UV light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) оказался ценной модельной системой для изучения биологических процессов развития и клеток. Понимание этих биологических процессов часто требует длительной и повторной визуализации одного и того же животного. Длительное время восстановления, связанное с обычными методами иммобилизации, выполняемыми на агаровых прокладках, оказывает пагубное влияние на здоровье животных, что делает неуместным повторное изображение одного и того же животного в течение длительных периодов времени. В этой статье описывается конструкция микрофлюидного чипа, метод изготовления, протокол культивирования C. elegans на чипе и три примера долгосрочной визуализации для изучения процессов развития у отдельных животных. Чип, изготовленный из полидиметилсилоксана и склеенный на покровном стекле, обездвиживает животных на стеклянной подложке с помощью эластомерной мембраны, которая отклоняется с помощью газообразного азота. Полная иммобилизация C. elegans обеспечивает надежную покадровую визуализацию клеточных и субклеточных событий без анестезии. Геометрия канала с большим поперечным сечением позволяет животному свободно перемещаться в пределах двух частично герметичных изоляционных мембран, позволяющих расти в канале с непрерывной подачей пищи. Используя этот простой чип, можно выполнить визуализацию явлений развития, таких как рост нейронного процесса, развитие вульвы и дендритная арборизация в сенсорных нейронах PVD, когда животное растет внутри канала. Долговременный чип роста и визуализации работает с одной линией давления, без внешних клапанов, недорогими жидкими расходными материалами и использует стандартные протоколы обработки червей, которые могут быть легко адаптированы другими лабораториями с использованием C. elegans.

Характеристика устройства: Устройство роста и визуализации состоит из двух слоев PDMS, связанных вместе (рисунок 1) с использованием необратимой плазменной связи. Слой потока (рисунок 1), который составляет 10 мм в длину и 40 мкм или 80 мкм в высоту, позволяет выращива...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Протокол описывает простую микрофлюидную конструкцию чипа и методологию микрофабрикации, используемую для выращивания C. elegans в присутствии непрерывного питания в течение 36 ч. Устройство для роста и визуализации также обеспечивает прерывистую долгосрочную визуализацию клеточных и субклеточных процессов с высоким разрешением в течение нескольких дней.

Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Основным преимуществом этой техники является то, что животное может свободно расти внутри устройства и может быть поймано в ловушку для изображения с высоким разрешением. Устройство может быть повторно использовано несколько раз. При изготовлении устройства чистота является наиболее важным фактором, чтобы иметь возможность изготовить пылевые устройства, чтобы избежать утечки во время работы устройства.Начать проектирование шаблона один для слоя потока и шаблон два для контрольного слоя с использованием прямоугольных форм в программном обеспечении для обработки текста и печать фотомаск с помощью лазерного плоттера с минимальным размером объекта восемь микрометров на пленке на основе полиэстера. Нарежьте кремниевые пластины на квадратные кусочки высотой 2,5 сантиметра и шириной. Очистите их 20%-ным гидроксидом калия в течение одной минуты и промойте пластины в деионизированной воде.Используйте одну пластину для потока, а другую для контрольного слоя. Высушите кусочки 14 P-S-I сжатым газообразным азотом с последующим обезвоживанием на конфорке при 120 градусах Цельсия в течение четырех часов. После охлаждения возьмите один кусок кремния, положите его на патрон спин-кодера и включите вакуум, чтобы удерживать пластину на месте.Нанесите приблизительно 20 микролитров гексаметилдисилана на кусок кремния и покройте его с помощью спинового кодера при 500 R-P-M в течение пяти секунд, а затем 3000 R-P-M в течение 30 секунд. Чтобы получить однородную толщину фоторезиста приблизительно 40 микрометров, специфичную для слоя потока, покройте кремниевую пластину примерно 1,5 миллилитрами отрицательного фоторезиста с помощью спинового кодера при 500 R-P-M в течение пяти секунд, а затем 2000 R-P-M в течение 30 секунд. Повторите покрытие кремниевого куска гексаметилдисиланом и отрицательным фоторезистом один для второй пластины, чтобы получить однородную толщину фоторезиста приблизительно 40 микрометров, специфичную для контрольного слоя.В качестве альтернативы, чтобы увеличить толщину проточного слоя примерно до 80 микрометров, для пожилых животных покрывают кремниевые пластины примерно 1,5 миллилитрами отрицательного фоторезиста два, используя спиновый кодер при 500 R-P-M в течение пяти секунд с последующим 2000 R-P-M в течение 30 секунд. Выпекайте оба ранее покрытых фоторезистом силиконовые кусочки на горячей плите при 65 градусах Цельсия в течение одной минуты, а затем 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. После охлаждения поместите мягкие обожженные силиконовые кусочки на стадию экспозиции U-V осветителя с поверхностью с покрытием фоторезиста, обращенной к U-V лампе.Подвергайте две части отдельно U-V в течение 15 секунд с помощью лампы мощностью 200 Вт через фотомаску с узорами один и два, чтобы получить слои потока и управления соответственно. Выпекайте два открытых силиконовых кусочка, как описано ранее, с покрытыми слоями, обращенными вверх. После охлаждения деталей разработайте узоры, замочив силиконовые кусочки в решении разработчика фоторезиста в течение 20 минут.Как только рисунок будет виден, промойте кусочки чистым изопропиловым спиртом и осторожно высушите феном с использованием газообразного азота. Держите силиконовые кусочки в осушителе с покрытой поверхностью вверх. Подвергайте куски воздействию силановых паров, наливая 50 микролитров чистого T-C-P-F-O-S на стеклянную горку.Поместите горку внутрь осушителя и высиживайте в течение двух часов. Сделайте P-D-M-S в пластиковом стаканчике, смешав эластомерную основу с отверждающим агентом и постоянно перемешивая в течение трех минут. Дегазируйте смесь P-D-M-S в адсорбаторе в течение 30 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха.Поместите контрольный слой кремниевых пластин в чашку Петри и вылейте слой смеси P-D-M-S толщиной пять миллиметров на кусочки кремния. После процесса заливки P-D-M-S повторите дегазацию смеси P-D-M-S. Поместите кремниевую пластину с проточным слоем лицом к спиннеру, применяя вакуумное давление от 200 до 500 миллиторров.Налейте примерно один миллилитр P-D-M-S на кремниевую пластину. Кодируйте его с помощью спин-коатера, чтобы получить слой толщиной около 80 микрометров. Выпекайте две кремниевые пластины со спин-покрытием P-D-M-S и разливайте слои P-D-M-S при 50 градусах Цельсия в конвекционной печи горячего воздуха в течение шести часов.После охлаждения куски отрежут слой P-D-M-S толщиной пять миллиметров от кремниевого куска вокруг контрольного слоя с помощью острого лезвия и отклейте его от кремниевой подложки. Пробите два отверстия диаметром около одного миллиметра с помощью перфоратора Harris в резервуаре блока P-D-M-S для подключения иммобилизационного канала и входов изоляционного канала к газовым линиям для прогибов мембраны P-D-M-S. Поместите силиконовый кусок со слоем P-D-M-S со спин-покрытием на первый рисунок с поверхностью с покрытием P-D-M-S, обращенной вверх на пластиковый лоток.Держите перфорированный блок P-D-M-S с рисунком два на лотке с формованной стороной вверх. Держите пластиковый лоток внутри плазмоочистителя и подвергайте две поверхности P-D-M-S воздействию воздушной плазмы мощностью 18 Вт в течение двух минут, применяя низкий вакуум. Выньте два обработанных плазмой блока и аккуратно свяжите блоки, прижав обработанные плазмой поверхности узоров один и два вместе.Выпекайте связанные узоры при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов в конвекционной печи горячего воздуха. Вынув склеенное устройство из печи, вырежьте его из кремниевой пластины с рисунком один и рисунком два и пробьете отверстия во входном и выходном резервуарах проточного слоя с помощью перфоратора Harris. Поместите склеенный блок P-D-M-S с проточным слоем, обращенным вверх, на пластиковый лоток и держите чистое покровное стекло на том же лотке.Подвергайте блоки в покровном стекле воздействию 18 Вт воздушной плазмы в течение двух минут. Отрегулируйте вакуумное давление, чтобы увидеть фиолетовую камеру. Поместите плазменный блок P-D-M-S на покровное стекло и выпекайте склеенную структуру в духовке при 50 градусах Цельсия в течение двух часов.Храните устройство в чистой камере для любого будущего эксперимента. Возьмите прибор, поставьте его на стереомикроскоп и прикрепите трубки. Подключите микрофлексную трубку к газовой линии сжатого азота и трехстороннему разъему на другом конце.Соедините трубки одного и двух из трехходовых соединителей с ловушкой в изоляционных мембранах соответственно. Подключите две микрофлексные трубки к двум выходным портам трехстороннего запорного крана. Соедините другой конец двух трубок с восьмимиллиметровой иглой 18 калибра.Заполните слой потока буфером M-9 с помощью микропипетки через входной порт. Заполните обе трубки деионизированной водой через конец, соединенный с иглой. Вставьте две иглы в перфорированные отверстия, соединяющие изолирующую и улавливающую мембрану.Откройте регулятор газообразного азота на 14 P-S-I и поверните трехсторонний клапан из трубчатого, чтобы протолкнуть воду в устройство через микрофлюидные каналы в слоях управления, а именно мембраны ловушки и изоляции. Снимите давление с помощью трехстороннего запорного крана, как только каналы будут заполнены водой и загрунтованы. Удалите пузырьки, протолкнув дополнительную среду через канал потока.На рисунке показаны изображения P-S-3-2-3-9, животного, растущего внутри микрофлюидного чипа и обездвиженного каждые восемь-10 часов для захвата флуоресцентных изображений. Вариация паттерна экспрессии представляет собой пример регуляции временных генов, когда один и тот же ген экспрессируется в разных клетках на разных стадиях развития. Визуализация индивидуального W-D-I-S-5-1 генотипа caenorhabditis elegans показывает менорообразную разветвленную дендритную архитектуру в каждом нейроне P-V-D, включающем первичные, вторичные третичные и четвертичные процессы на стадиях развития L-2, Late L-2, L-3 и L-4 соответственно.На рисунке здесь сравниваются P-V-D разработки и выращенные устройством животные, а также животные, выращенные на пластинах N-G-M. Количество S-P и Q-P на разных стадиях развития червя увеличивалось с возрастом. Caenorhabditis elegans лечили каплей трех миллимолярного левамизола, чтобы вызвать достаточный паралич, необходимый для визуализации с высоким разрешением.Значения S-P существенно не отличались при измерении у аналогичных стадийных животных, выращенных на пластинах N-G-M и изображенных с использованием трех миллимоляров левамизола на агаровом слайде. Кроме того, расстояние между двумя телами клеток P-V-C, одно из которых присутствует в хвосте, а второе вблизи вульвы, увеличивается по мере того, как они раздвигаются как у животных, выращенных в устройстве, так и у животных, выращенных на пластинах N-G-M. Рисунок представляет собой изображение нейронов сенсорных рецепторов высокого разрешения от животных, растущих внутри микрофлюидного устройства.Монтаж представляет весь нейронный процесс P-L-M-R в последовательных точках времени, выделяя митохондрии и нейронный процесс. График представляет собой общую длину нейронального процесса, которая, как наблюдалось, увеличивается с наклоном 10,4 микрометра в час. Микро-изготовленное устройство использует тонкую мембрану P-D-M-S, отклоняемую в присутствии газообразного азота высокого давления, для иммобилизации и удержания C-элеганцев на месте для визуализации с высоким разрешением.Эта процедура может позволить продольные исследования клеточных и субклеточных процессов у С-элегансов, которые нуждаются в прерывистых наблюдениях в течение длительного периода времени.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Простой микрофлюидных устройства для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация<em&gt; C. Элеганс</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; И данио рерио

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; &#39;Передвижение

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Микрофлюидных Изготовление Чип и метод для выявления гриппа

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Долгосрочный Прижизненные Иммунофлуоресценции Визуализация тканей компонентов матрицы с эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Микрожидкостных чип для МСПМС ввода пробы

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-орган Chip - Микрожидкостных Платформа для долгосрочных Multi-ткани сокультивирования

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Долгосрочный живых изображений устройства для улучшения экспериментальных манипуляций личинок данио рерио

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...