Name: a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos a la instalación de imágenes CIFF, NCBS por el uso de los microscopios confocales apoyados por el DST - Centro de Nanotecnología (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos la financiación de la investigación de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco giratorio apoyado por DAE-PRISM 12-R & D-IMS-5.02.0202 (SPK y Gautam Menon), y HHMI-IECS número de subvención 55007425 (SPK). Las cepas HB101, PS3239 y wdIs51 fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). S.P.K. hizo jsIs609 en el laboratorio de Mike Nonet.

1. Fabricación del dispositivo de crecimiento e imagen
<ol><li>Fabricación de moldes SU8<ol><li>Diseñe patrones 1 (capa de flujo) y 2 (capa de control) utilizando formas rectangulares en un software de procesamiento de textos (o un software CAD de diseño asistido por computadora) e imprima las fotomáscaras con la ayuda de un trazador láser con un tamaño mínimo de característica de 8 μm en película basada en poliéster (Figura 1).</li>
		<li>Corte las obleas de s...

<ol>
	<li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy.">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435 (2010).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. 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The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).</li><li>C&#225;ceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+orienting+C.+elegans+using+geometry+at+microscale+for+high-throughput+visual+screens+in+neurodegeneration+and+neuronal+development+studies.">Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies.</a> PloS One. 7 (4), 35037 (2012).</li><li>Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing.">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li><li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics.">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant.">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying,+phenotyping,+and+long-term+live+imaging.">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192 (2015).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration.">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis,+Microscopy,+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans.">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device.">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li><li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics.">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li><li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development.">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biostable,+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices.">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li><li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices:+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells.">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li><li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials.">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li><li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+PDMS+(polydimethylsiloxane)+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes.">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve.">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PloS One. 7 (12), 51499 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+for+Caenorhabditis+elegans+vulval+cells.">Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells.</a> Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).</li><li>Fatouros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Tau+aggregation+in+a+novel+caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity.">Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).</li><li>Smith, C. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphogenesis:+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization.">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li><li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-16/JIP3+and+UNC-76/FEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport.">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response.">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

En este artículo, se ha descrito un protocolo para la fabricación y el uso de un dispositivo microfluídico simple para el cultivo de C. elegans con suministro constante de alimentos e imágenes de alta resolución de un solo animal durante su desarrollo. Este proceso de fabricación es simple y se puede hacer en un ambiente no estéril. Un entorno libre de polvo es crítico durante los pasos de fabricación. La presencia de partículas de polvo conduciría a un contacto inadecuado entre las dos superficies de...

Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un poderoso organismo modelo para estudiar la biología celular, el envejecimiento, la biología del desarrollo y la neurobiología. Ventajas como su cuerpo transparente, ciclo de vida corto, fácil mantenimiento, un número definido de células, homología con varios genes humanos y genética bien estudiada han llevado a C. elegans a convertirse en un modelo popular tanto para los descubrimientos de biología fundamental como para la investigación aplicada 1,2. Comprender los procesos biológicos y de desarrollo de las células a partir de la observación repetida a largo plazo de animales individuales puede resultar beneficioso. Convencionalmente, C. elegans se anestesia en almohadillas de agar y se obtiene una imagen bajo el microscopio. Los efectos adversos de los anestésicos sobre la salud de los animales limitan el uso de animales anestesiados para imágenes intermitentes repetidas y a largo plazo del mismo animal 3,4. Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas y su adaptación para la captura sin anestesia de C. elegans con riesgos insignificantes para la salud permiten obtener imágenes de alta resolución del mismo animal durante un período de tiempo corto y largo.
Los chips microfluídicos han sido diseñados para C. elegans'5 cribado de alto rendimiento 6,7,8, captura y dispensación9, cribado de fármacos 10,11, estimulación neuronal con imágenes de alta resolución 12 e imágenes de alta resolución del animal 12,13,14. También se han desarrollado láminas microfluídicas ultrafinas para la inmovilización en portaobjetos15. Se han realizado estudios a largo plazo de C. elegans utilizando imágenes de baja resolución de animales que crecen en cultivo líquido para observar el crecimiento, la dinámica del calcio, los efectos de los medicamentos en su comportamiento16,17,18,19, su longevidad y el envejecimiento20. Se han realizado estudios a largo plazo con microscopía de alta resolución para evaluar el desarrollo sináptico21, la regeneración neuronal 22 y la adición mitocondrial23. Las imágenes de alta resolución a largo plazo y el rastreo del destino y la diferenciación celular se han realizado en dispositivos multicanal24,25. Varios eventos celulares y subcelulares ocurren en las escalas de tiempo de varias horas y requieren atrapar al mismo individuo en diferentes puntos de tiempo durante su desarrollo para caracterizar todos los pasos intermedios en el proceso para comprender la dinámica celular in vivo. Para obtener imágenes de procesos biológicos como la organogénesis, el desarrollo neuronal y la migración celular, el animal necesita ser inmovilizado en la misma orientación en múltiples puntos de tiempo. Anteriormente hemos publicado un protocolo para imágenes de alta resolución de C. elegans durante más de 36 h para determinar dónde se agregan las mitocondrias a lo largo de las neuronas receptoras del tacto (TRN)23.
Este documento proporciona un protocolo para establecer una metodología basada en microfluídica para imágenes repetidas de alta resolución. Este dispositivo, con un solo canal de flujo, es el más adecuado para imágenes repetidas de un solo animal por dispositivo. Para mejorar el rendimiento y la imagen de muchos animales a la vez, se pueden conectar múltiples dispositivos a la misma línea de presión pero con conectores separados de tres vías que controlan un solo animal en cada dispositivo. El diseño es útil para estudios que exigen imágenes de lapso de tiempo de alta resolución, como procesos de desarrollo postembrionario, migración celular, transporte de orgánulos, estudios de expresión génica, etc. La tecnología podría ser limitante para algunas aplicaciones, como la vida útil y los estudios de envejecimiento que requieren crecimiento paralelo e imágenes de muchos animales en etapa tardía. El elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) se utilizó para fabricar este dispositivo debido a su bioestabilidad26, biocompatibilidad 27,28, permeabilidad al gas 29,30 y módulo elástico sintonizable 31. Este dispositivo de dos capas permite el crecimiento de animales con suministro continuo de alimentos en un canal microfluídico y la captura de C. elegans individuales a través de la compresión de membrana PDMS utilizando gas nitrógeno. Este dispositivo es una extensión del dispositivo publicado anteriormente con la ventaja de crecer e imaginar el mismo animal en el microcanal bajo un suministro continuo de alimentos3. La red de membranas de aislamiento adicional y una membrana de captura de 2 mm de ancho permiten la inmovilización eficiente de los animales en desarrollo. El dispositivo se ha utilizado para observar el desarrollo neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en neuronas PVD sensoriales. Los animales crecen sin efectos adversos para la salud en el dispositivo y pueden inmovilizarse repetidamente para facilitar la obtención de imágenes de eventos subcelulares en el mismo animal durante su desarrollo.
Todo el protocolo se divide en cinco partes. La Parte 1 describe la fabricación del dispositivo para el chip de crecimiento e imagen. La Parte 2 describe cómo configurar un sistema de presión para la deflexión de la membrana PDMS para inmovilizar y aislar C. elegans individuales. La Parte 3 describe cómo sincronizar C. elegans en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) para obtener imágenes del dispositivo. La Parte 4 describe cómo cargar un solo animal en el dispositivo y hacer crecer al animal dentro del dispositivo microfluídico durante varios días. La Parte 5 describe cómo inmovilizar a un animal individual en múltiples puntos de tiempo, capturar imágenes de alta resolución utilizando diferentes objetivos y analizar las imágenes usando Fiji.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>Gauge 18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WW-30600-02</td>
			<td>Masterflex fitting with luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>EMCCD C9100-13no</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit board film</td>
			<td>Fine Line Imaging, Colorado, USA</td>
			<td></td>
			<td>The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Meta-Lab Scientific Industries, India</td>
			<td>MSI-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Blue stat microscopic cover glass</td>
			<td></td>
			<td>22mm x 10Gms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hi media</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris uni-core puncher 1mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Z708801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>&#160;IKA</td>
			<td>RCT B S 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 5 LIVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td>0.5-10 &#181;L micropipette tips are used for food supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-1</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2025</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-2</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2050</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Local Supplier</td>
			<td>Commercial nitrogen gas</td>
			<td>Cylinder volume of 7 cubic meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Curing solution)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>&#160;Sylgard curing solution</td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>&#160;PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor and blades</td>
			<td>Lister surgical Blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer (Base)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>Sylgard 184 base</td>
			<td>elastomer base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer, MA, USA</td>
			<td>[100] orientation, 4-inch diameter</td>
			<td>Small pieces (2 mm &#215; 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>SPS-Europe B.V., The Netherlands</td>
			<td>SPIN 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk microscope</td>
			<td>Perkin Elmer ultra-view VOX system</td>
			<td>CSU-X1-A3 N</td>
			<td>The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>Microchem, MA, USA</td>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>448931</td>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td>
			<td></td>
			<td>200 Watt and collimated UV light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha demostrado ser un valioso sistema modelo para estudiar los procesos biológicos celulares y de desarrollo. La comprensión de estos procesos biológicos a menudo requiere imágenes a largo plazo y repetidas del mismo animal. Los largos tiempos de recuperación asociados con los métodos convencionales de inmovilización realizados en almohadillas de agar tienen efectos perjudiciales para la salud animal, por lo que es inapropiado obtener imágenes repetidas del mismo animal durante largos períodos de tiempo. Este documento describe un diseño de chip microfluídico, método de fabricación, protocolo de cultivo de C. elegans en chip y tres ejemplos de imágenes a largo plazo para estudiar los procesos de desarrollo en animales individuales. El chip, fabricado con polidimetilsiloxano y unido a un vidrio de cubierta, inmoviliza a los animales en un sustrato de vidrio utilizando una membrana elastomérica que se desvía con gas nitrógeno. La inmovilización completa de C. elegans permite obtener imágenes robustas de lapso de tiempo de eventos celulares y subcelulares sin anestesia. Una geometría de canal con una gran sección transversal permite al animal moverse libremente dentro de dos membranas de aislamiento parcialmente selladas que permiten el crecimiento en el canal con un suministro continuo de alimentos. Usando este simple chip, se pueden realizar imágenes de fenómenos de desarrollo como el crecimiento del proceso neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en las neuronas sensoriales PVD, a medida que el animal crece dentro del canal. El chip de crecimiento e imágenes a largo plazo funciona con una sola línea de presión, sin válvulas externas, consumibles fluídicos de bajo costo y utiliza protocolos estándar de manejo de gusanos que pueden ser fácilmente adaptados por otros laboratorios que utilizan C. elegans.

Caracterización del dispositivo: El dispositivo de crecimiento e imagen consiste en dos capas de PDMS unidas entre sí (Figura 1) utilizando enlaces de plasma irreversibles. La capa de flujo (patrón 1) que tiene 10 mm de longitud y 40 μm u 80 μm de altura nos permite cultivar al animal en cultivo líquido (Figura 1A). La capa de captura (patrón 2) tiene una membrana de 2 mm de ancho (Figura 1B) para inmoviliza...

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A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

La principal ventaja de esta técnica es que el animal puede crecer libremente dentro del dispositivo y puede quedar atrapado para obtener imágenes de alta resolución. El dispositivo se puede reutilizar varias veces. Al fabricar el dispositivo, la limpieza es el factor más importante para poder fabricar dispositivos libres de polvo para evitar fugas durante las operaciones del dispositivo.Para comenzar el patrón de diseño uno para la capa de flujo y el patrón dos para la capa de control utilizando formas rectangulares en un software de procesamiento de textos e imprimir las máscaras fotográficas con la ayuda de un trazador láser con un tamaño mínimo de característica de ocho micrómetros en película a base de poliéster. Corte las obleas de silicio en trozos cuadrados de 2,5 centímetros de altura y anchura. Límpielos con hidróxido de potasio al 20% durante un minuto y enjuague las obleas en agua desionizada.Utilice una oblea para el flujo y la otra para la capa de control. Seque las piezas con 14 gas nitrógeno comprimido P-S-I seguido de deshidratación en una placa caliente a 120 grados centígrados durante cuatro horas. Después de enfriar, tome una pieza de silicio, colóquela en el mandril de un codificador de centrifugado y encienda la aspiradora para mantener la oblea en su lugar.Ponga aproximadamente 20 microlitros de hexametildisilano en la pieza de silicio y cúbrala con el codificador de centrifugado a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 3000 R-P-M durante 30 segundos. Para obtener un espesor fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrómetros específicos para la capa de flujo, cubra la oblea de silicio con aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistencia negativa con un codificador de espín a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 2000 R-P-M durante 30 segundos. Repita el recubrimiento de la pieza de silicio con hexametildisilano y fotorresistencia negativa para la segunda oblea para obtener un espesor fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrómetros específicos para la capa de control.Alternativamente, para aumentar el grosor de la capa de flujo a aproximadamente 80 micrómetros para animales más viejos, cubra las obleas de silicio con aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistencia negativa dos, utilizando el codificador de espín a 500 R-P-M durante cinco segundos seguido de 2000 R-P-M durante 30 segundos. Hornea las dos piezas de silicona previamente recubiertas de fotorresistencia en una placa caliente a 65 grados centígrados durante un minuto seguido de 95 grados centígrados durante 10 minutos. Después del enfriamiento, coloque piezas de silicona suavemente horneadas en la etapa de exposición del iluminador U-V con la superficie recubierta de fotorresistencia frente a la lámpara U-V.Exponga las dos piezas por separado a U-V durante 15 segundos usando una lámpara de 200 vatios a través de una máscara fotográfica con patrones uno y dos para obtener capas de flujo y control respectivamente. Hornea las dos piezas de silicona expuestas como se describió anteriormente con capas recubiertas hacia arriba. Después de enfriar las piezas, desarrolle los patrones remojando las piezas de silicona en la solución de revelador fotoresistente durante 20 minutos.Una vez que el patrón sea visible, enjuague las piezas con alcohol isopropílico puro y seque suavemente con gas nitrógeno. Mantenga las piezas de silicona en un desecador con la superficie recubierta hacia arriba. Exponga las piezas a vapores de silano vertiendo 50 microlitros de T-C-P-F-O-S puro en un portaobjetos de vidrio.Coloque el portaobjetos dentro de un desecador e incube durante dos horas. Haga P-D-M-S en un vaso de plástico mezclando la base de elastómero con el agente de curado y revuelva constantemente durante tres minutos. Desgasifique la mezcla P-D-M-S en un desecador durante 30 minutos para eliminar todas las burbujas de aire.Coloque las obleas de silicio de la capa de control en una placa de Petri y vierta una capa de mezcla P-D-M-S de cinco milímetros de espesor sobre las piezas de silicio. Después del proceso de vertido P-D-M-S, repita la desgasificación de la mezcla P-D-M-S. Coloque la oblea de silicio con una capa de flujo frente al camión hilandero aplicando una presión de vacío de 200 a 500 militorr.Vierta aproximadamente un mililitro de P-D-M-S en la oblea de silicio. Codifique usando un recubridor de centrifugado para obtener una capa de aproximadamente 80 micrómetros de espesor. Hornea las dos obleas de silicio con el P-D-M-S recubierto de centrifugado y vierte las capas de P-D-M-S a 50 grados centígrados en un horno de convección de aire caliente durante seis horas.Después de enfriar, las piezas cortan la capa P-D-M-S de cinco milímetros de espesor de la pieza de silicio alrededor de la capa de control con una cuchilla afilada y la despegan del sustrato de silicio. Perfore dos orificios de aproximadamente un milímetro de diámetro utilizando una perforadora Harris en el depósito del bloque P-D-M-S para conectar el canal de inmovilización y las entradas del canal de aislamiento a las líneas de gas para las deflexiones de membrana P-D-M-S. Coloque la pieza de silicona con la capa P-D-M-S recubierta de espín en el patrón uno con la superficie recubierta de P-D-M-S hacia arriba en una bandeja de plástico.Mantenga el bloque P-D-M-S perforado con el patrón dos en la bandeja con el lado moldeado hacia arriba. Mantenga la bandeja de plástico dentro de un limpiador de plasma y exponga las dos superficies P-D-M-S a plasma de aire de 18 vatios durante dos minutos aplicando vacío bajo. Saque los dos bloques tratados con plasma y una suavemente los bloques presionando las superficies tratadas con plasma de los patrones uno y dos.Hornea los patrones unidos a 50 grados centígrados durante dos horas en un horno de convección de aire caliente. Después de sacar el dispositivo unido del horno, córtelo de la oblea de silicio con el patrón uno y el patrón dos y perfore los orificios en los depósitos de entrada y salida de la capa de flujo con el perforador Harris. Coloque el bloque P-D-M-S unido con la capa de flujo hacia arriba en una bandeja de plástico y mantenga un vidrio de cubierta limpio en la misma bandeja.Exponga los bloques en el vidrio de la cubierta a plasma de aire de 18 vatios durante dos minutos. Ajuste la presión del vacío para ver una cámara violeta. Coloque el bloque P-D-M-S expuesto con plasma en el vidrio de la cubierta y hornee la estructura unida en un horno a 50 grados centígrados durante dos horas.Guarde el dispositivo en una cámara limpia para cualquier experimento futuro. Tome el dispositivo, colóquelo en un microscopio estéreo y conecte los tubos. Conecte un tubo microflex a una línea de gas nitrógeno comprimido y un conector de tres vías en el otro extremo.Conecte los tubos uno y dos de los conectores de tres vías a la trampa en membranas aislantes respectivamente. Conecte dos tubos microflex a los dos puertos de salida de la llave de paso de tres vías. Conecte el otro extremo de los dos tubos a una aguja de calibre 18 de ocho milímetros de largo.Llene la capa de flujo con tampón M-9 utilizando una micropipeta a través del puerto de entrada. Llene ambos tubos con agua desionizada a través del extremo conectado a la aguja. Inserte las dos agujas en los orificios perforados que conectan la membrana aislante y atrapante.Abra el regulador de gas nitrógeno a 14 P-S-I y gire la válvula de tres vías del tubo uno para empujar el agua hacia el dispositivo a través de los canales microfluídicos en las capas de control, es decir, las membranas de trampa y aislamiento. Libere la presión usando la llave de paso de tres vías, una vez que los canales estén llenos de agua y cebados. Retire las burbujas haciendo fluir medios adicionales a través del canal de flujo.La figura muestra imágenes de P-S-3-2-3-9, animal creciendo dentro del chip microfluídico e inmovilizado cada ocho a 10 horas para capturar imágenes de fluorescencia. La variación en el patrón de expresión representa un ejemplo de regulación temporal de genes donde el mismo gen se expresa en diferentes células en diferentes etapas de desarrollo. Las imágenes del genotipo individual W-D-I-S-5-1 de caenorhabditis elegans muestran una arquitectura dendrítica ramificada similar a la menorá en cada neurona P-V-D que comprende procesos primarios, terciarios secundarios y cuaternarios en las etapas de desarrollo L-2, L-2 tardía, L-3 y L-4, respectivamente.La figura en este documento compara el desarrollo de P-V-D y los animales cultivados en dispositivos, y los cultivados en placas N-G-M. El número de S-P y Q-P en diferentes etapas del desarrollo del gusano aumentó con la edad. Caenorhabditis elegans se trató con una caída de tres milimolares de levamisol para causar suficiente parálisis requerida para imágenes de alta resolución.Los valores de S-P no fueron significativamente diferentes cuando se midieron de animales por etapas similares cultivados en placas N-G-M y se obtuvieron imágenes utilizando levamisol de tres milimolares en un portaobjetos de agar. Además, la distancia entre los dos cuerpos celulares P-V-C, uno presente en la cola y el segundo presente cerca de la vulva, aumenta a medida que se separan tanto en los animales cultivados en el dispositivo como en los que crecen en placas N-G-M. La figura representa la imagen de alta resolución de las neuronas receptoras táctiles de animales que crecen dentro del dispositivo microfluídico.El montaje representa todo el proceso neuronal P-L-M-R en puntos de tiempo sucesivos destacando las mitocondrias y el proceso neuronal. El gráfico representa la longitud total del proceso neuronal que se observó que aumentaba con una pendiente de 10,4 micrómetros por hora. El dispositivo microfabricado utiliza una membrana delgada P-D-M-S desviada en presencia de gas nitrógeno a alta presión para inmovilizar y mantener C-elegans en su lugar para obtener imágenes de alta resolución.Este procedimiento puede permitir estudios longitudinales de procesos celulares y subcelulares en C-elegans que necesitan observaciones intermitentes durante un largo período de tiempo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Investigación

Bioingeniería

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

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Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

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Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

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