NEPTUNE允许从胚胎第7.5天开始对小鼠胚胎神经系统进行靶向和遗传操作,并能够在几天内生成敲低或谱系追踪模型。该协议适应性强、灵活且快速。我们可以提供shRNA,cdRNA或条形码病毒库,以在几天而不是几个月或几年内解决不同的问题。
我们预计海王星将提供神经科学方面的见解,但它也可以适应其他器官系统。识别羊膜腔可能非常具有挑战性,因此请花点时间查看超声图像,并可能手头有教科书或其他解剖学资源。要开始装载针头,请将玻璃针滑到金属柱塞上,保持连接,但略微松动。
然后,将毛细管针与金属柱塞一起推过前垫圈,直到到达垫片。按 Empty 将柱塞推入针中并从针尖排出油。然后按 Fill 以创建一个气泡,将油和溶液分开。
最后,放下针头,将尖端浸入溶液中,然后再次按Fill以加载针头。将具有理想大小羊膜腔的麻醉雌性小鼠固定在加热台上后,将眼凝胶涂在双眼以防止角膜干燥并皮下注射止痛药。然后,用浸有每毫升0.5毫克氯己定溶液的布擦拭下腹部并擦干皮肤,从而对下腹部进行消毒。
接下来,使用手术剪刀,在下腹部做一个 1.5 到 2 厘米的垂直中线皮肤切口。然后轻轻提起皮肤,将其从切口点周围约一厘米的底层肌肉层中解放出来,以方便手术后的缝合。接下来,在肌肉层中做一个一厘米的垂直中线切口。
使用一对镊子,抬起皮肤和肌肉层的一侧,用另一对镊子寻找子宫角。然后,使用镊子将组织固定在胚胎之间,并小心地从腹部拉出两个子宫角。对两侧的胚胎进行计数和编号,无论是从卵巢到子宫颈还是从子宫颈到卵巢。
接下来,用湿棉签轻轻地将所有胚胎推回腹腔,除了前三个要注射的胚胎。然后,将一滴PBS放在粘在市售改良培养皿的圆形中央开口上的弹性膜上,并将其保持在胚胎上方。将闭合的镊子插入松紧带的切口,然后松开镊子以打开弹性切口,将液体滴到胚胎上。
使用镊子,将对应于三个胚胎的子宫部分拉过松紧带,然后将培养皿轻轻地栖息在小鼠的腹部。使用四个粘土脚,将培养皿固定并固定在腹部上方,以减轻对小鼠的压力,并降低成像对小鼠呼吸和心跳的敏感性。接下来,使用镊子和湿棉签,调整子宫和弹性,以确保弹性密封在小鼠皮肤周围,防止PBS泄漏。
接下来,要固定子宫,将造型粘土圆柱体向下按压到胚胎或子宫的右侧,并将PBS添加到培养皿中,直到胚胎和子宫完全被PBS覆盖。为了便于记录注射,将超声探头浸入PBS并调整小鼠或手术台,使第一个胚胎与超声探头对齐。扫描所有三个胚胎并检查羊膜腔。
然后,使用超声机测量羊膜腔的直径以确定适当的注射量。使用注射控制器,将确定的注射量和注射速度设置为慢速,注射速率为每秒 23 纳升。将针头放入PBS后,使用导轨系统上的主轮,按纳米注射器控制器上的Empty,直到液体到达针尖。
然后,将针头从PBS中取出并按Inject以验证是否排出了近似所需体积的一滴。再次将针头放入PBS,并用显微操纵器上的Y平面轮移动纳米注射器,以使针头与超声探头和胚胎对齐。用注射角度轮调整针头角度,以确保相对于子宫壁的注射角度接近垂直。
然后,使用显微操纵器上的注射轮,将针头一次性插入羊膜腔。如果针尖从超声图像中消失,请向前或向后移动探头以使针头重新聚焦。然后,按 注入 适当的次数注入所需的体积。
注射所需体积后,等待 5 到 10 秒,然后轻轻地缩回针头。将载物台移至下一个胚胎,并如图所示对其他两个胚胎重复注射。接下来,使用显微操纵器将超声探头和针头从PBS中取出,将针头远离操作员以避免损坏和伤害。
使用镊子,将第一个和第二个胚胎轻轻推入松紧带,将它们放回腹部。然后,轻轻抓住与第三个胚胎相邻的组织,并将子宫拉向弹性切口的上端。用镊子轻轻拉起第四到第六个胚胎,让第三个胚胎重新进入腹部。
注射所有具有最佳羊膜腔的胚胎后,轻轻地将胚胎和子宫推回小鼠的腹部。神经板的成功转导导致胚胎在大脑和其他外胚层衍生组织(如皮肤)中强烈表达荧光报告基因。注射量过大可能导致神经管缺陷,例如脑畸形。
在胚胎第7.5天成功注射导致从前脑到后脑的均匀转导,包括脉络丛。低滴度的注射导致单细胞克隆的转导,而高滴度病毒几乎100%地转导整个大脑。通过胚胎第13.5天的冠状切片显示眼睛,晶状体,角膜和间充质的神经组织高度和均匀的转导。
在胚胎第9.5天注射后,唾液腺和导管在胚胎第11.5天左右从口腔上皮发育。舌头的舌上皮转导良好,而下面的间充质为阴性。此外,舌上皮内的阳性簇由负切片隔开,提示表面的转导。
在胚胎第7.5天注射导致胚胎第13.5天舌间充质的广泛转导,这表明早期注射靶向神经嵴细胞,有助于舌头中的间充质。慢病毒注射还导致广泛靶向中枢和周围神经系统,转导脊髓中的神经元和祖细胞,以及背根神经节。良好的准备是必不可少的。
确保没有泄漏并且胚胎固定良好,以便您可以完全专注于注射到大鼠腔中。海王星后,可以通过多种方法进行分析,例如大脑的免疫荧光分析,单细胞RNA测序,或允许注射的胚胎出生以进行行为分析。