人类胚胎干细胞可以诱导分化成神经祖细胞，然后分化成神经元星细胞和寡头细胞。然而，人类胚胎干细胞的类型培养方法及其分化成神经祖细胞是非常低效和开放的体内共培养系统在这里，我们提出了一个改进和强大的培养系统，很容易扩展使用高密度单细胞类型培养与人类胚胎干细胞。人类胚胎干细胞的单细胞类型培养提供了一个快速高效的系统，用于研究沿各种和不同分化的血统（包括神经祖细胞及其随后分化为其他神经系）调节多步分化的分子机制。
首先准备人类胚胎干细胞合格的地下室膜基质涂层板。在四摄氏度下慢慢解冻基底膜基质溶液至少两到三个小时或过夜。解冻后，将冷DMEM/F-12中的基质稀释至2%混合，用一毫升稀释溶液覆盖六井板的每个井。
在室温下孵育涂层板至少三小时或在四摄氏度下过夜。通过生长在地下室膜基质上的H9型人类胚胎干细胞的分离培养物，从孔中吸出培养基，用一毫升DMBS洗涤一次。在每个井中加入一毫升 Dispase 溶液，并在 37 摄氏度下孵育板 20 分钟。
取出 Dispase，用两毫升 DMEM/F-12 轻轻清洗细胞一次。洗涤后，取出介质，向每井添加两毫升 DMEM/F-12。通过上下移液轻轻分离菌落，将其转移到15毫升的管子中。
将管子以370倍g离心两分钟。吸气介质。然后加入两毫升细胞分离溶液，在37摄氏度下孵育10分钟，将细胞颗粒分离成单细胞。
重复离心并拆下分离溶液。通过上下轻轻移液，在mTeSR-1人类ESC介质中重新发送细胞。为了将群体型人类胚胎干细胞适应单个细胞型培养，将大约150万至200万个细胞板入地下室膜基质涂层板的每个孔中，放入含有10微摩尔 ROCK抑制剂的两毫升mTeSR-1中。
24 小时后，用新鲜的 mTeSR-1 更换介质，不带 ROCK 抑制剂。允许细胞作为单个细胞类型生长三天，每天改变介质。在第四天，分离分离溶液中的细胞，并重新镀上它们，如前所述。
根据手稿指示重新沉淀和孵育细胞后，将小胚胎体转移到15毫升管中，让它们沉淀到底部，然后用移液器轻轻取出介质。将它们转移到EB介质中，并允许它们在低附着菜中扩展七天。为了诱导神经祖细胞或NPC分化，用一毫升分离溶液分离单细胞型人类胚胎干细胞，并在37摄氏度下孵育10分钟。
以370倍g将细胞离心两分钟。拆下分离溶液上一样。然后在DMEM/F-12中重新暂停细胞。
在两毫升mTeSR-1和10微摩尔 ROCK抑制剂的两毫升中，将基底膜基质上的细胞以每孔2倍10至第五孔的密度涂覆六孔板。24小时后，用神经诱导介质代替培养基，辅以1微摩尔多索莫非辛和5微摩尔SB431542。在神经感应的头四天中，每隔一天更换一次介质，然后每天更换一次，直到第七天达到汇合。
经过七天的神经感应后，通过加入一毫升分离溶液，在37摄氏度下孵育10分钟，使细胞分离。将细胞以 370 倍 g 离心，并取出分离溶液上一液。加入一毫升的NPC膨胀介质，轻轻移液细胞上下重新暂停。
然后板1倍10至第五细胞每孔在两毫升的NPC膨胀介质在地下室膜基质上涂上六孔板。当培养达到90%的汇合时，必要时通过细胞，在前三到四个通道中加入10微摩尔 ROCK抑制剂。在扩展期间每隔一天更换一次介质。
要准备 PLO 层压涂层板，将 PLO 库存溶液稀释到 PBS 或水中，最终浓度为每毫升 10 微克，混合好，然后用溶液的六孔板在每孔中涂上一毫升溶液。在37摄氏度下孵育板至少两小时，或在4摄氏度下过夜。接下来，用 PBS 清洗每一个井，并在涂覆每个井后立即按照手稿说明准备一毫升层压溶液。
将盘子保持在四摄氏度，长达一周。为了将NPC分化成多巴胺神经元，在24小时后以大约50%的密度将PLLA层涂层的菜中的细胞板入NPC膨胀介质中，将介质更改为DA1，并在此后每隔一天更换一次。要通过培养物，当它们达到汇合时，用一毫升分离溶液分离细胞，并在37摄氏度下孵育10分钟。
然后以 370 倍 g 离心，取出分离溶液上一样。将细胞在一毫升的DA1介质中，将10倍的板在PLP层压涂层的六孔板上的两毫升介质中，将第五细胞重新暂停。为了将NPC区分为星细胞，在24小时后将介质以50%的密度将细胞板板到PLC层压板和NPC膨胀介质，然后通过前面描述的细胞。
当群体型人类胚胎干细胞适应单细胞型培养时，发现细胞能够保持高密度，然后在对汇接时容易有效地亚培养。这些细胞保留了人类胚胎干细胞群的典型细胞周期特征，如短G1阶段和高比例细胞在S阶段。定量PCR分析还证实，它们表示的ESC标记水平与群体型细胞相当。
此外，研究表明，单细胞人类胚胎干细胞能够形成胚胎体，包含来自所有三个胚胎层的细胞：内皮、中皮和外皮。结果表明，单细胞型人类胚胎干细胞有效分化成NPC，这表现为典型的人类胚胎干细胞形态的丧失和NPC形态的出现。差异得到签名NPC标记的增强表达的支持，并得到免疫污染和FACS分析的证实。
同样的分析还显示，超过90%的细胞对SOX1、PAX6和NCAM蛋白的染色呈阳性。此外，衍生的NPC能够分化成多巴胺神经元和星形细胞，如特征形态的出现和血统特异性标记的表达所示。在尝试这种程序时，必须高密度地对人类胚胎干细胞进行板状，以保持健康、无差别的人类胚胎干细胞培养。
该协议为简单、可靠和可扩展的祖细胞和分化细胞的生产提供了一个平台，这些细胞将可扩展用于基础研究、药物筛选和神经退行性疾病的应用。
