Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

تشمل مصادر التمويل معهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس (CPRIT RP200668) وجامعة تكساس إيه آند إم. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.

1. طلاء الخلايا للتصوير
<ol><li>استنشق الوسط من قارورة T-75 المتقاربة بنسبة 80-90٪ من خلايا MCF-7 ، واشطف الخلايا ب 10 مل من المياه المالحة المعقمة العازلة بالفوسفات (PBS) ، وأضف 2 مل من 0.25٪ من التربسين (1x) لفصل الخلايا عن قاع القارورة.</li>
	<li>احتضن القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تقريبا. تحق...

تم استخدام كثافة التألق الذاتي والتصوير مدى الحياة على نطاق واسع لتقييم التمثيل الغذائي في الخلايا21,55. FLIM عالي الدقة وبالتالي يحل الخلايا المفردة ، وهو أمر مهم لدراسات السرطان لأن عدم التجانس الخلوي يساهم في عدوان الورم ومقاومة الأدوية7,39,41,44,45,46,58.<sup class="xref"...

الأيض هو العملية الخلوية لإنتاج الطاقة. يشمل التمثيل الغذائي الخلوي مسارات متعددة ، بما في ذلك تحلل السكر ، والفسفرة التأكسدية ، وتحلل الجلوتامين. تستخدم الخلايا السليمة هذه المسارات الأيضية لتوليد الطاقة من أجل الانتشار والوظيفة ، مثل إنتاج السيتوكينات بواسطة الخلايا المناعية. تتميز العديد من الأمراض، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية والسرطان والتنكس العصبي، بتغيير التمثيل الغذائي الخلوي1. على سبيل المثال ، تحتوي بعض أنواع الخلايا السرطانية على معدلات مرتفعة من تحلل السكر ، حتى في وجود الأكسجين ، لتوليد جزيئات لتخليق الأحماض النووية والبروتينات والدهون2,3. هذه الظاهرة، المعروفة باسم تأثير واربورغ، هي السمة المميزة للعديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان الرئة والأورام الأرومية الدبقية4. بسبب تغيرات التمثيل الغذائي الخلوي المرتبطة بتطور السرطان ، يمكن أن يكون التمثيل الغذائي الخلوي علامة حيوية بديلة للاستجابة للدواء5,6. علاوة على ذلك ، فإن فهم فعالية الدواء على المستوى الخلوي أمر بالغ الأهمية لأن عدم تجانس الخلايا يمكن أن يؤدي إلى استجابات دوائية مختلفة لدى الأفراد7,8.
تعد التقنيات التي تحدد التغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي وتحدد كميتها ضرورية لدراسات السرطان والاستجابة للأدوية. تستخدم التحليلات الكيميائية والبروتينية لتقييم عملية التمثيل الغذائي للخلايا أو الأنسجة ولكنها تفتقر إلى دقة الخلية الواحدة والمعلومات المكانية. يمكن للمقايسات القائمة على قارئ لوحة الأيض قياس استهلاك الأس الهيدروجيني والأكسجين في العينة بمرور الوقت والاضطراب الأيضي اللاحق بواسطة المواد الكيميائية. يمكن استخدام الرقم الهيدروجيني لحساب معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ، والذي يوفر نظرة ثاقبة على النشاط المحلل للسكر للخلايا9. طرق التصوير لكامل الجسم ، بما في ذلك التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للفلورو-D-glucose 2-[fluorine-18] (FDG PET) والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي (MRS) ، هي طرق تصوير غير جراحية تستخدم سريريا لتحديد تكرار الورم وفعالية الدواء من خلال القياسات الأيضية10،11،12،13،14.
يصور FDG-PET امتصاص الأنسجة من FDG ، وهو تناظري للجلوكوز المسمى إشعاعيا. زيادة امتصاص FDG-PET من قبل الأورام بالنسبة للأنسجة المحيطة يرجع إلى تأثير Warburg 12,13. صور MRS النوى الشائعة للجزيئات المستخدمة في التمثيل الغذائي ، مثل 13C و 31P ، ويمكنها الحصول على معلومات ديناميكية حول كيفية تغير التمثيل الغذائي استجابة للمحفزات ، مثل التمرين أو الأكل14. على الرغم من أنه يمكن استخدام FDG-PET و MRS سريريا ، إلا أن هذه التقنيات تفتقر إلى الدقة المكانية لحل عدم التجانس داخل الرحم. وبالمثل ، يتم إجراء قياسات استهلاك الأكسجين على مجموعة كبيرة من الخلايا. يتغلب التصوير الفلوري الذاتي على عقبة الدقة المكانية لهذه التقنيات ويوفر طريقة غير جراحية لقياس التمثيل الغذائي الخلوي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> الشكل 1: NADH و FAD في المسارات الأيضية الشائعة. NADH و FAD هي إنزيمات مساعدة تستخدم في تحلل السكر ، ودورة كريبس ، وسلسلة نقل الإلكترون. يوفر التصوير الفلوري الذاتي لهذه الجزيئات معلومات حول التمثيل الغذائي الخلوي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
انخفاض نيكوتيناميد الأدينين (الفوسفات) ثنائي النوكليوتيد (NAD (P) H) و flavin الأدينين ثنائي النوكليوتيد المؤكسد (FAD) هي إنزيمات مساعدة للتفاعلات الأيضية ، بما في ذلك تحلل السكر ، الفسفرة التأكسدية ، وانحلال الجلوتامينو (الشكل 1). كل من NAD (P) H و FAD هما من الفلورسنت الذاتي ويوفران تباينا داخليا للتصوير الفلوري 1,15. NADPH له خصائص فلورسنت مماثلة ل NADH. ولهذا السبب ، غالبا ما يستخدم NAD (P) H لتمثيل الإشارة المدمجة ل NADH و NADPH2,16.
يحدد التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) عمر التألق أو الوقت الذي يكون فيه الفلوروفور في حالة الحماس. تستجيب الأعمار الفلورية للبيئة الدقيقة للفلوروفورات وتوفر معلومات حول التمثيل الغذائي الخلوي17. يمكن أن يوجد NAD (P) H و FAD داخل الخلايا إما في تشكيلات مرتبطة بالبروتين أو حرة ، ولكل منها عمر مختلف. NAD(P)H الحر له عمر أقصر من NAD(P)H المرتبط بالبروتين. على العكس من ذلك ، فإن FAD المجاني له عمر أطول من FAD18,19 المقيد. يمكن قياس أوزان مكونات العمر والعمر من بيانات الاضمحلال الفلوري مدى الحياة من خلال Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
يمثل Eq (1) شدة التألق الطبيعية كدالة للوقت. يمثل α 1 و α 2 في هذه المعادلة المكونات المتناسبة للعمر القصير والطويل (α 1+ α 2 = 1) ، على التوالي ، τ1 و τ2 يمثلان العمر القصير والطويل ، على التوالي ، و C يمثل ضوء الخلفية7,20. يتم حساب العمر المرجح للسعة، والممثل هنا ك τm، باستخدام Eq. (2).
τm = α 1τ1+ α 2τ2 (2)
يمكن حساب متوسط العمر من خلال متوسط "t" على شدة اضمحلال الفلوروفور ، والذي يظهر للاضمحلال الأسي بواسطة Eq. (3) 17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
يمكن حساب صورة شدة التألق من صورة العمر من خلال دمج اضمحلال التألق مدى الحياة. التصوير الفلوري الذاتي هو طريقة غير مدمرة وخالية من الملصقات يمكن استخدامها لتوصيف عملية التمثيل الغذائي للخلايا الحية بدقة دون الخلايا. توفر نسبة الأكسدة والاختزال البصرية مقياسا تناظريا بصريا لحالة الأكسدة والاختزال الكيميائي للخلية ويتم حسابها كنسبة كثافة NAD (P) H و FAD. على الرغم من أن صيغة حساب نسبة الأكسدة والاختزال البصرية ليست موحدة22،23،24،25 ، إلا أنها تعرف هنا بأنها شدة FAD على الشدة المشتركة ل NAD (P) H و FAD. يستخدم هذا التعريف لأن الكثافة المجمعة في المقام تطبيع المقياس بين 0 و 1 ، والنتيجة المتوقعة لتثبيط السيانيد هي انخفاض في نسبة الأكسدة والاختزال. توفر الأعمار الفلورية ل NAD (P) H و FAD الحر نظرة ثاقبة على التغيرات في البيئة الدقيقة للمذيبات الأيضية ، بما في ذلك درجة الحموضة ودرجة الحرارة والقرب من الأكسجين والأسمولية 17.
يمكن أن تشير التغيرات في عمر التألق للأجزاء المرتبطة من NAD (P) H و FAD إلى استخدام المسار الأيضي والتمثيل الغذائي الخاص بالركيزة26. يمكن تفسير أوزان المكونات للتغيرات في الجزء الحر إلى الجزء المرتبط من الإنزيمات المساعدة18,19. إجمالا، تسمح مقاييس عمر التألق الذاتي الكمي هذه بتحليل الأيض الخلوي، وقد تم استخدام التصوير الفلوري الذاتي لتحديد الأورام من الأنسجة الطبيعية27،28، وتوصيف الخلايا الجذعية29،30، وتقييم وظيفة الخلايا المناعية31،32،33،34،35، وقياس النشاط العصبي36، 37,38، وفهم فعالية الدواء في أنواع السرطان مثل سرطان الثدي وسرطان الرأس والرقبة21,39,40,41,42. يمكن الجمع بين التصوير الفلوري الذاتي عالي الدقة مع تجزئة الصور لتحليل الخلية الواحدة وتحديد كمية عدم التجانس داخل السكان43،44،45،46،47.
يمكن تصوير NAD (P) H و FAD على المجاهر الفلورية أحادية الفوتون أو متعددة الفوتونات التي تم تكوينها للتصوير المكثف أو مدى الحياة. بالنسبة للمجاهر أحادية الفوتون ، عادة ما يتم إثارة NAD (P) H و FAD بأطوال موجية تتراوح بين 375-405 نانومتر و 488 نانومتر ، على التوالي ، بسبب مصادر الليزر الشائعة عند هذه الأطوال الموجية 48. في الإثارة الفلورية ثنائية الفوتون ، سوف يثير NAD (P) H و FAD بأطوال موجية تتراوح من 700 إلى 750 نانومتر تقريبا و 700 إلى 900 نانومتر ، على التوالي 15,49. بمجرد إثارة الفلوروفورات ، ينبعث من NAD (P) H و FAD فوتونات بأطوال موجية تتراوح بين ~ 410 نانومتر إلى ~ 490 نانومتر و ~ 510 نانومتر إلى ~ 640 نانومتر ، على التوالي 15. يبلغ الطول الموجي الأقصى للانبعاثات NAD(P)H و FAD حوالي 450 نانومتر و 535 نانومتر على التوالي48.
بسبب اختلاف أطوال موجية الإثارة والانبعاثات ، يمكن عزل تألق الإنزيمين المساعدين الأيضيين طفيا. يعد فهم الخصائص الطيفية ل NAD (P) H و FAD ضروريا لتصميم وتحسين بروتوكولات التصوير بالموجات الفلورية الذاتية. السيانيد هو مثبط IV مركب لسلسلة نقل الإلكترون (ETC). تتميز آثار السيانيد على التمثيل الغذائي الخلوي وكثافة التألق الذاتي وعمر NAD (P) H و FAD داخل الخلايا بشكل جيد27,40. لذلك ، تعد تجربة اضطراب السيانيد وسيلة فعالة للتحقق من صحة بروتوكولات التصوير NAD (P) H و FAD. توفر تجربة السيانيد الناجحة الثقة في أنه يمكن استخدام بروتوكول التصوير NAD (P) H و FAD لتقييم عملية التمثيل الغذائي لمجموعات أو اضطرابات غير معروفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

الأيض الخلوي هو العملية التي تولد بها الخلايا الطاقة ، وتتميز العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان ، بالتمثيل الغذائي غير الطبيعي. انخفاض نيكوتيناميد الأدينين (الفوسفات) ثنائي النوكليوتيد (NAD (P) H) و الفلافين المؤكسد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD) هي إنزيمات مساعدة للتفاعلات الأيضية. يظهر NAD (P) H و FAD تألقا ذاتيا ويمكن عزلهما طيفا عن طريق الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات. يمكن أن يوجد كل من الإنزيمات المساعدة ، NAD (P) H و FAD ، إما في تكوين حر أو مرتبط بالبروتين ، ولكل منهما عمر فلوري متميز - وهو الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالة الحماس. يسمح التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) بتحديد كمية كثافة التألق وعمر NAD (P) H و FAD لتحليل التمثيل الغذائي الخلوي بدون ملصقات. يمكن تحسين كثافة التألق والمجاهر مدى الحياة لتصوير NAD (P) H و FAD عن طريق اختيار الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاثات. تتحقق الاضطرابات الأيضية بواسطة السيانيد من بروتوكولات التصوير الفلوري الذاتي للكشف عن التغيرات الأيضية داخل الخلايا. ستوضح هذه المقالة تقنية التصوير الفلوري الذاتي ل NAD (P) H و FAD لقياس التمثيل الغذائي الخلوي.

تم استزراع خط خلايا سرطان الثدي الظهاري ، MCF-7 ، في DMEM مع استكمال 10 ٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين. بالنسبة للتصوير الفلوري ، تم زرع الخلايا بكثافة 4 × 105 خلية لكل طبق تصوير 35 مم من الزجاج السفلي قبل 48 ساعة من التصوير. تم تصوير الخلايا قبل وبعد العلاج بالسيانيد باستخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

يصف هذا البروتوكول التصوير الفلوري وتحليل الإنزيمات المساعدة الأيضية الذاتية المنشأ، وانخفاض نيكوتيناميد الأدينين (الفوسفات) ثنائي النوكليوتيد (NAD(P)H)، وثنائي النوكليوتيد المؤكسد فلافين الأدينين (FAD). يوفر التصوير الفلوري الذاتي ل NAD (P) H و FAD طريقة خالية من الملصقات وغير مدمرة لتقييم التمثيل الغذائي الخلوي.

التصوير الفلوري الذاتي لتقييم التمثيل الغذائي الخلوي

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH و FAD هي جزيئات داخلية المنشأ تظهر التألق الذاتي بأطوال موجية مختلفة للإثارة والانبعاثات. بسبب استخدامها كإنزيمات مشتركة للتفاعلات الأيضية ، يمكن للمجهر الفلوري الذاتي تقييم التمثيل الغذائي الخلوي. لا يتطلب التصوير الفلوري الذاتي ل NADH و FAD تسميات خارجية المنشأ وهو طريقة غير مدمرة ذات دقة دون الخلايا.يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري الذاتي على العينات الحية ودراسات الدورة الزمنية. يمكن تطبيق التصوير الفلوري الذاتي على نطاق واسع على أي خلايا أو أنسجة حية. تم استخدام التصوير الفلوري الذاتي على الخلايا العصبية والخلايا السرطانية والورم والجسم الحي والخلايا الجذعية والخلايا المناعية.سيوضح الإجراء لينغهاو هو ، وهو طالب دراسات عليا من مختبر التصوير البصري الكمي في جامعة تكساس إيه آند إم. ابدأ التجربة عن طريق تشغيل جميع مكونات المجهر الفلوري متعدد الفوتونات ، بما في ذلك مصدر الليزر وأجهزة الكشف. قبل وضع العينة، قم بتشغيل مصباح الحقل الساطع وتأكد من دخول الضوء إلى النظارة.ثم اختر هدفا لتصوير الخلية. إذا لم تكن تستخدم هدفا جويا ، فقم بتطبيق قطرة واحدة من وسط الغمر المناسب فوق الهدف. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي على حامل العينة على مرحلة المجهر.بعد ذلك ، قم بتوسيط العينة بهدف استخدام عنصر التحكم في المرحلة X / Y تأكد من أن العينة مؤمنة ولن تتحرك أثناء التصوير. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انظر إلى العدسة وحرك الهدف لأعلى للتركيز على الخلايا. إذا كان المجهر داخل حاوية ، فأغلق باب صندوق الضوء.بعد ذلك ، افتح برنامج الحصول على الصور وانقر فوق علامة التبويب التصوير متعدد الفوتونات لتعيين معلمات التصوير متعدد الفوتون كما هو موضح في المخطوطة. اضبط كسب الكاشف إلى القيمة المثلى للتصوير الفلوري مدى الحياة ، أو FILM. ثم قم بتغيير وقت الإقامة للإنفاق بالليزر في كل بكسل من العينة إلى القيمة المطلوبة.بالنسبة لثنائي نيوكليوتيد فوسفات الأدينين النيكوتيناميد ، أو NADPH ، اضبط الليزر متعدد الفوتون على 750 نانومتر. بعد ذلك ، تأكد من ضبط التحكم في الطاقة لليزر على الصفر بحيث لا تتلف الخلايا عند فتح الغالق على الليزر. اضبط مرشح الانبعاثات على 400 إلى 500 نانومتر.عند تعيين المعلمات، ابدأ التصوير بطريقة التركيز البؤري أو العرض المباشر لتحسين إعدادات الصورة. قم بزيادة طاقة الليزر ببطء من ثلاثة إلى ثمانية مللي واط مع التأكد من أن الخلايا في بؤرة التركيز. بمجرد ضبطه ، سجل الحد الأقصى للطاقة المستخدمة.استخدم إعداد الطاقة القصوى المسجل للتصوير على أجزاء أخرى من طبق بيتري. اجمع صورة NADPH-FILM مع وقت تكامل الصورة البالغ 60 ثانية وتحقق من أن الصورة تحتوي على عدد كاف من الفوتونات ، مثل ذروة 100 فوتون لبكسل السيتوبلازم داخل منحنى الاضمحلال الفلوري مدى الحياة. إذا كان عدد الفوتونات منخفضا جدا ، فقم بزيادة طاقة الليزر أو مدة الحصول على الصورة.بالنسبة لثنائي نيوكليوتيد الأدينين الفلافين ، أو FAD ، التصوير ، اضبط الليزر متعدد الفوتون على 890 نانومتر وانتظر حتى يتم قفل الليزر عند الطول الموجي الجديد. تأكد من ضبط التحكم في الطاقة لليزر عند الصفر في البداية. اضبط مرشح الانبعاثات على 500 إلى 600 نانومتر.لتحسين إعدادات الصورة، ابدأ التصوير بطريقة التركيز البؤري أو العرض المباشر عن طريق زيادة طاقة الليزر إلى 5 إلى 10 مللي واط وتسجيل الطاقة القصوى المستخدمة. استخدم نفس إعداد الطاقة لتصوير FAD لمجالات الرؤية اللاحقة. اجمع صورة FAD-FILM مع وقت تكامل الصورة البالغ 60 ثانية وتحقق من أن الصورة تحتوي على فوتونات كافية داخل منحنى الاضمحلال الفلوري مدى الحياة.إذا كان عدد الفوتونات منخفضا جدا، فقم بزيادة طاقة الليزر أو مدة الحصول على الصورة وكرر التصوير للحصول على أربعة إلى خمسة مجالات رؤية إضافية، أو FOVs، مع تباعد كل صورة على بعد اثنين من FOVs. لصنع محلول سيانيد الصوديوم 80 ملليمول ، قم بإذابة 130.24 ملليغرام من سيانيد الصوديوم في 25 ملليلتر من PBS. من طبق الاستزراع ، استطلع 100 ميكرولتر من وسط الثقافة ليحل محله 100 ميكرولتر من محلول سيانيد الصوديوم للحصول على تركيز أربعة ملليمولات من السيانيد في الطبق.ضع الخلايا في حاضنة لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالتفاعل مع محلول السيانيد. بعد التعرض للسيانيد ، احصل على صور NADPH و FAD للخلايا كما هو موضح سابقا. حسبت الدراسة معلمات عمر التألق باستخدام دالة استجابة الأداة المقاسة ، أو IRF ، من اليوريا.تم حساب متوسط المعلمات عبر وحدات بكسل السيتوبلازم لكل خلية تستخدم للتقسيم. تم تحديد الخلايا الفردية وإخفائها للقضاء على ضوضاء الخلفية. بعد ذلك ، تم تحديد النواة وإسقاطها على قناع الخلية.علاوة على ذلك ، تمت تصفية الخلايا لإزالة المناطق المقنعة التي لا تتناسب مع حجم الخلايا النموذجية. سمح التصوير الفلوري متعدد الفوتونات مدى الحياة ل NADPH و FAD بتصور مورفولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي قبل وبعد معالجة السيانيد. لوحظ أن عمر NADPH ينخفض مع معالجة السيانيد ، في حين أن عمر FAD يزداد بعد معالجة السيانيد.وأشار مخطط الصندوق التمثيلي إلى أن نسبة الأكسدة والاختزال البصرية لخلايا MCF7 انخفضت بعد معالجة السيانيد. أدى التعرض للسيانيد إلى تقليل عمر NADPH المرجح بالسعة لخلايا MCF7. انخفضت الأعمار القصيرة والطويلة ل NADPH ، ولكنها زادت بالنسبة ل NADPH alpha one.بالنسبة ل FAD ، زاد العمر المرجح للسعة لخلايا MCF7 بعد التعرض للسيانيد. زاد كل من العمر القصير والطويل ل FAD ، ولكنه انخفض ل FAD alpha one. من المهم أن يكون لديك ما يكفي من طاقة الليزر التي تذهب إلى العينات ، ولكن تذكر أن الكثير من الطاقة يمكن أن يسبب تلفا للخلايا.نظرا لأن التصوير بالتألق الذاتي لا يضر بالخلايا ، يمكن استخدام الفحوصات الكيميائية الحيوية اللاحقة على نفس العينات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...