Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
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资金来源包括德克萨斯州癌症预防和研究所（CPRIT RP200668）和德克萨斯A&M大学。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

1. 用于成像的细胞电镀
<ol><li>从80-90%汇合的MCF-7细胞的T-75烧瓶中吸出培养基，用10mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，并加入2mL0.25%胰蛋白酶（1x）以将细胞从烧瓶底部分离。</li>
	<li>将烧瓶在37°C孵育约4分钟。在显微镜下检查细胞以确认脱离。</li>
	<li>立即加入8mL培养基以停用胰蛋白酶。</li>
	<li>将细胞收集在锥形管（15 mL或50 mL）中。使用血细胞计数器计数细胞。</li>
	<li>将细胞?...

自发荧光强度和终生成像已被广泛用于评估细胞的新陈代谢21，55。FLIM具有高分辨率，因此可以解决单个细胞，这对于癌症研究很重要，因为细胞异质性有助于肿瘤侵袭性和耐药性7，39，41，44，45，46?...

新陈代谢是产生能量的细胞过程。细胞代谢包括多种途径，包括糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺溶解。健康细胞利用这些代谢途径产生增殖和功能的能量，例如免疫细胞产生细胞因子。许多疾病，包括代谢紊乱、癌症和神经变性，其特征是细胞代谢改变1。例如，即使在氧气存在下，某些癌细胞类型的糖酵解速率也较高，以产生用于合成核酸，蛋白质和脂质的分子2，3。这种现象被称为Warburg效应，是许多癌症类型的标志，包括乳腺癌，肺癌和胶质母细胞瘤4。由于与癌症进展相关的细胞代谢的改变，细胞代谢可以成为药物反应的替代生物标志物5，6。此外，在细胞水平上了解药物疗效至关重要，因为细胞异质性可导致个体中不同的药物反应7，8。
识别和量化细胞代谢变化的技术对于癌症和药物反应的研究至关重要。化学和蛋白质分析用于评估细胞或组织的代谢，但缺乏单细胞分辨率和空间信息。基于代谢读板仪的测定可以测量样品中随时间推移的pH值和氧气消耗量以及随后化学物质的代谢扰动。pH值可用于计算细胞外酸化速率（ECAR），从而深入了解细胞的糖酵解活性9。全身成像方法，包括2-[氟-18]氟-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG PET）和磁共振波谱（MRS），是临床上用于通过代谢测量识别肿瘤复发和药物疗效的非侵入性成像方式10，11，12，13，14。
FDG-PET成像了FDG的组织摄取，FDG是一种放射性标记的葡萄糖类似物。肿瘤相对于周围组织对FDG-PET的摄取增加是由于Warburg效应12，13。MRS图像用于代谢的分子的常见核，如 13C和 31P，并且可以获得有关代谢如何响应刺激而变化的动态信息，如运动或饮食14。虽然FDG-PET和MRS可用于临床，但这些技术缺乏解决肿瘤内异质性的空间分辨率。同样，对大量细胞群进行耗氧量测量。自发荧光成像克服了这些技术的空间分辨率障碍，并提供了一种量化细胞代谢的非侵入性方法。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> 图1：常见代谢途径中的NADH和FAD。 NADH和FAD是用于糖酵解，克雷布斯循环和电子传递链的辅酶。这些分子的自发荧光成像提供有关细胞代谢的信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
还原的烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应的辅酶，包括糖酵解，氧化磷酸化和谷氨酰胺溶解（图1）。NAD（P）H 和 FAD 都是自发荧光的，为荧光成像提供内源性对比1，15。NADPH具有与NADH相似的荧光特性。因此，NAD（P）H通常用于表示NADH和NADPH2，16的组合信号。
荧光寿命成像（FLIM）量化荧光寿命或荧光团处于激发态的时间。荧光寿命对荧光团的微环境有反应，并提供有关细胞代谢的信息17。NAD（P）H和FAD可以存在于蛋白质结合或游离构象的细胞内，每种构象都有不同的寿命。游离NAD（P）H的寿命比蛋白质结合的NAD（P）H短;相反，自由 FAD 的寿命比绑定的 FAD18，19 长。寿命和寿命组分重量可以通过方程（1）20从荧光寿命衰减数据进行量化：
I（t） = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C （1）
等式（1）表示归一化的荧光强度作为时间的函数。该等式中的α 1 和α 2 分别表示短寿命和长寿命的比例分量（α 1+α 2=1），τ1 和τ2 分别代表短寿命和长寿命，C占背景光7，20。振幅加权寿命（此处表示为τm）是使用等式（2）计算的。
τm= α 1τ1+ α 2τ2 （2）
平均寿命可以通过在荧光团的强度衰变上平均“t”来计算，对于双指数衰减，方程（3）17，21显示了该衰变。
τ*m= （α 1τ12+ α 2τ22）/ （α 1τ1+ α 2τ2） （3）
通过积分荧光寿命衰减，可以从寿命图像中计算出荧光强度图像。自发荧光成像是一种无损且无标记的方法，可用于以亚细胞分辨率表征活细胞的代谢。光学氧化还原比提供电池化学氧化还原状态的光学模拟度量，并计算为NAD（P）H和FAD强度的比值。虽然计算光学氧化还原比的公式不是标准化的22，23，24，25，但这里将其定义为FAD在NAD（P）H和FAD的组合强度上的强度。使用这个定义是因为分母中的总强度使度量归一化为0和1之间的度量，氰化物抑制的预期结果是氧化还原比的降低。游离 NAD（P）H 和 FAD 的荧光寿命可深入了解代谢溶剂微环境的变化，包括 pH、温度、与氧气的接近度和渗透压17。
NAD（P）H和FAD结合组分的荧光寿命变化可指示代谢途径利用和底物特异性代谢26。组分权重可以解释为辅酶的自由到结合部分的变化18，19。总而言之，这些定量的自发荧光寿命指标允许分析细胞代谢，并且自发荧光成像已用于识别正常组织中的肿瘤27，28，表征干细胞29，30，评估免疫细胞功能31，32，33，34，35，测量神经活性36，37，38，并了解药物在乳腺癌和头颈部癌症等癌症类型中的疗效21，39，40，41，42。高分辨率自发荧光成像可与图像分割相结合，用于单细胞分析和种群内异质性量化43，44，45，46，47。
NAD（P）H和FAD可以在配置为强度或寿命成像的单光子或多光子荧光显微镜上成像。对于单光子显微镜，NAD（P）H 和 FAD 通常分别在 375-405 nm 和 488 nm 波长处激发，因为这些波长处有常见的激光源48。在双光子荧光激发中，NAD（P）H和FAD将分别在大约700至750nm和700至900nm的波长下激发15，49。一旦荧光团被激发，NAD（P）H和FAD分别发射波长在~410 nm至~490nm和~510nm至~640nm之间的光子15。NAD（P）H 和 FAD 最大发射波长分别约为 450 nm 和 535 nm48。
由于它们的激发和发射波长不同，两种代谢辅酶的荧光可以被光谱分离。了解NAD（P）H和FAD的光谱特性对于设计和优化自发荧光成像方案是必要的。氰化物是一种电子传递链（ETC）复合IV抑制剂。氰化物对细胞代谢的影响以及细胞内NAD（P）H和FAD的自发荧光强度和寿命得到了很好的表征27，40。因此，氰化物扰动实验是验证NAD（P）H和FAD成像方案的有效手段。成功的氰化物实验提供了NAD（P）H和FAD成像方案可用于评估未知组或扰动代谢的信心。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

细胞代谢是细胞产生能量的过程，许多疾病，包括癌症，都以异常代谢为特征。还原的烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应的辅酶。NAD（P）H和FAD表现出自发荧光，可以通过激发和发射波长进行光谱隔离。辅酶NAD（P）H和FAD都可以以游离或蛋白质结合的构型存在，每种构型都具有不同的荧光寿命 - 荧光团保持在激发态的时间。荧光寿命成像（FLIM）可以量化NAD（P）H和FAD的荧光强度和寿命，以便对细胞代谢进行无标记分析。通过选择适当的激发和发射波长，可以针对 NAD（P）H 和 FAD 成像优化荧光强度和寿命显微镜。氰化物的代谢扰动验证了自发荧光成像方案，以检测细胞内的代谢变化。本文将展示NAD（P）H和FAD的自发荧光成像技术，用于测量细胞代谢。

上皮乳腺癌细胞系MCF-7在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素的DMEM中培养。对于荧光成像，在成像前48小时，将细胞以每35mm玻璃底成像培养皿4×105个细胞的密度接种。使用上述方案对细胞进行氰化物处理之前和之后进行成像。氰化物实验的目的是确认NAD（P）H和FAD荧光的光谱分离，并验证用于检测细胞代谢变化的成像系统和分析方案。配对的NAD（P）H和FAD荧光寿命图像在氰化物之?...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

该协议描述了内源性代谢辅酶，还原烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像和分析。NAD（P）H 和 FAD 的自发荧光成像提供了一种无标记、无损的方法来评估细胞代谢。

自发荧光成像评估细胞代谢

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH和FAD是内源性分子，在不同的激发和发射波长下表现出自发荧光。由于它们被用作代谢反应的辅酶，自发荧光显微镜可以评估细胞代谢。NADH和FAD的自发荧光成像不需要外源性标记，是一种具有亚细胞分辨率的非破坏性方法。自发荧光显微镜可用于活体样品和时间过程研究。自发荧光成像可以广泛应用于任何活细胞或组织。自发荧光成像已用于神经元，癌细胞，肿瘤，体内，干细胞和免疫细胞。演示该程序的将是德克萨斯A&M大学定量光学成像实验室的研究生Linghao Hu。通过打开多光子荧光寿命显微镜的所有组件（包括激光源和探测器）开始实验。在放置样品之前，打开亮场灯并确保光线进入目镜。然后，为细胞成像选择一个物镜。如果不使用空气物镜，请在物镜顶部涂抹一滴适当的浸入介质。将玻璃底培养皿放在显微镜载物台上的样品架上。然后，使用X / Y载物台控制将标本与物镜居中，确保标本固定，并且在成像过程中不会移动。完成后，观察目镜并将物镜向上移动以聚焦在细胞上。如果显微镜在外壳内，请关闭灯箱门。接下来，打开图像采集软件，单击“多光子成像”选项卡以设置手稿中描述的多光子成像参数。将检测器的增益调整为荧光寿命成像或FILM的最佳值。然后，将样品每个像素处激光消耗的停留时间更改为所需值。对于烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸或NADPH，将多光子激光器设置为750纳米。然后，确认激光器的功率控制设置为零，以便在打开激光器上的快门时电池不会损坏。将发射过滤器设置为400至500纳米。设置参数后，开始以对焦或实时取景方式成像，以优化图像设置。慢慢地将激光功率从三毫瓦增加到八毫瓦，同时确保电池处于焦点状态。调整后，记录使用的最大功率。使用记录的最大功率设置在培养皿的其他部分上进行成像。收集图像积分时间为60秒的NADPH-FILM图像，并检查图像是否具有足够数量的光子，例如荧光寿命衰减曲线内细胞质像素的峰值为100光子。如果光子数量太少，请增加激光功率或图像采集的持续时间。对于黄素腺嘌呤二核苷酸或FAD成像，将多光子激光器设置为890纳米，并等待激光器在新波长处锁定模式。确保激光器的功率控制最初设置为零。将发射过滤器设置为500至600纳米。要优化图像设置，请通过将激光功率增加到5至10毫瓦并记录使用的最大功率，以对焦或实时取景方式开始成像。对后续视场的 FAD 成像使用相同的功率设置。收集图像积分时间为60秒的FAD-FILM图像，并检查图像在荧光寿命衰减曲线内是否有足够的光子。如果光子数量太少，请增加激光功率或图像采集的持续时间，并重复成像以获得额外的四到五个视场或FOV，每个图像间隔在两个FOV上。为了制造80毫摩尔氰化钠溶液，将130.24毫克氰化钠溶解在25毫升PBS中。从培养皿中，吸取100微升培养基，用100微升氰化钠溶液代替，在培养皿中获得4毫摩尔浓度的氰化物。将细胞置于培养箱中五分钟，以使细胞与氰化物溶液反应。氰化物暴露后，获取细胞的NADPH和FAD图像，如前所述。该研究使用来自尿素的测量仪器响应函数（IRF）计算了荧光寿命参数。参数在用于分割的每个细胞的细胞质的像素上取平均值。识别并屏蔽单个细胞以消除背景噪音。然后，鉴定细胞核并将其投射到细胞掩膜上。此外，过滤细胞以去除不适合典型细胞大小的被遮蔽区域。NADPH和FAD的多光子荧光寿命成像允许在氰化物处理之前和之后可视化细胞形态和代谢。观察到，氰化物处理后NADPH寿命降低，而氰化物处理后FAD寿命增加。具有代表性的箱形图表明，氰化物处理后MCF7细胞的光学氧化还原比降低。氰化物暴露降低了MCF7细胞的振幅加权NADPH寿命。NADPH的短寿命和长寿命减少，但NADPH alpha的寿命增加。对于FAD，MCF7细胞的振幅加权寿命在氰化物暴露后增加。FAD的短寿命和长寿命都增加了，但FAD alpha的寿命减少了。重要的是要有足够的激光功率进入样品，但请记住，太多的功率会对细胞造成损害。由于自发荧光成像不会对细胞造成损害，因此可以对相同的样品进行后续生化测定。

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