Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
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Les sources de financement comprennent le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) et la Texas A & M University. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

1. Placage cellulaire pour l’imagerie
<ol><li>Aspirer le milieu à partir d’une fiole T-75 confluente à 80-90% de cellules MCF-7, rincer les cellules avec 10 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 2 mL de trypsine à 0,25% (1x) pour détacher les cellules du fond de la fiole.</li>
	<li>Incuber la fiole à 37 °C pendant environ 4 min. Vérifiez les cellules au microscope pour confirmer le détachement.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 8 mL de milieu de culture pour...

L’intensité de l’autofluorescence et l’imagerie à vie ont été largement utilisées pour évaluer le métabolisme dans les cellules21,55. FLIM est à haute résolution et résout donc les cellules individuelles, ce qui est important pour les études sur le cancer car l’hétérogénéité cellulaire contribue à l’agression tumorale et à la résistance aux médicaments7,39,41,44,45,46,58.<sup class="xref...

Le métabolisme est le processus cellulaire de production d’énergie. Le métabolisme cellulaire englobe de multiples voies, y compris la glycolyse, la phosphorylation oxydative et la glutaminolyse. Les cellules saines utilisent ces voies métaboliques pour générer de l’énergie pour la prolifération et la fonction, comme la production de cytokines par les cellules immunitaires. De nombreuses maladies, y compris les troubles métaboliques, le cancer et la neurodégénérescence, sont caractérisées par une altération du métabolisme cellulaire1. Par exemple, certains types de cellules cancéreuses ont des taux élevés de glycolyse, même en présence d’oxygène, pour générer des molécules pour la synthèse d’acides nucléiques, de protéines et de lipides2,3. Ce phénomène, connu sous le nom d’effet Warburg, est une caractéristique de nombreux types de cancer, y compris le cancer du sein, le cancer du poumon et les glioblastomes4. En raison des altérations du métabolisme cellulaire associées à la progression du cancer, le métabolisme cellulaire peut être un biomarqueur de substitution de la réponse aux médicaments5,6. De plus, la compréhension de l’efficacité des médicaments au niveau cellulaire est cruciale, car l’hétérogénéité cellulaire peut entraîner des réponses différentes aux médicaments chez les individus7,8.
Les technologies qui identifient et quantifient les changements dans le métabolisme cellulaire sont essentielles pour les études sur le cancer et la réponse aux médicaments. Les analyses chimiques et protéiques sont utilisées pour évaluer le métabolisme des cellules ou des tissus, mais manquent de résolution unicellulaire et d’informations spatiales. Les tests basés sur des lecteurs de plaques métaboliques peuvent mesurer le pH et la consommation d’oxygène dans l’échantillon au fil du temps et la perturbation métabolique subséquente par les produits chimiques. Le pH peut être utilisé pour calculer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), ce qui donne un aperçu de l’activité glycolytique des cellules9. Les méthodes d’imagerie du corps entier, y compris la tomographie par émission de positons 2-[fluor-18] fluoro-D-glucose (FDG PET) et la spectroscopie par résonance magnétique (MRS), sont des modalités d’imagerie non invasives utilisées cliniquement pour identifier la récidive tumorale et l’efficacité des médicaments par des mesures métaboliques10,11,12,13,14.
FDG-PET image l’absorption tissulaire de FDG, un analogue du glucose radiomarqué. L’absorption accrue de FDG-PET par les tumeurs par rapport aux tissus environnants est due à l’effet Warburg12,13. MRS image les noyaux communs des molécules utilisées pour le métabolisme, telles que le 13C et le 31P, et peut obtenir des informations dynamiques sur la façon dont le métabolisme change en réponse à des stimuli, tels que l’exercice ou l’alimentation14. Bien que fdG-PET et MRS puissent être utilisés cliniquement, ces technologies n’ont pas la résolution spatiale nécessaire pour résoudre l’hétérogénéité intratumorale. De même, les mesures de consommation d’oxygène sont effectuées sur une population en vrac de cellules. L’imagerie par autofluorescence surmonte l’obstacle de résolution spatiale de ces technologies et fournit une méthode non invasive de quantification du métabolisme cellulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Figure 1 : NADH et FAD dans les voies métaboliques courantes. Le NADH et le FAD sont des coenzymes utilisées dans la glycolyse, le cycle de Krebs et la chaîne de transport d’électrons. L’imagerie par autofluorescence de ces molécules fournit des informations sur le métabolisme cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La nicotinamide adénine (phosphate) dinucléotide (NAD(P)H) réduite et la flavine adénine dinucléotide (FAD) oxydée sont des coenzymes de réactions métaboliques, y compris la glycolyse, la phosphorylation oxydative et la glutaminolyse (Figure 1). Le NAD(P)H et le FAD sont tous deux autofluorescents et fournissent un contraste endogène pour l’imagerie par fluorescence1,15. Le NADPH a des propriétés fluorescentes similaires à celles du NADH. Pour cette raison, nad(P)H est souvent utilisé pour représenter le signal combiné du NADH et du NADPH2,16.
L’imagerie de la durée de vie de la fluorescence (FLIM) quantifie la durée de vie de la fluorescence ou le temps pendant lequel un fluorophore est à l’état excité. Les durées de vie de la fluorescence sont sensibles au microenvironnement des fluorophores et fournissent des informations sur le métabolisme cellulaire17. Le NAD(P)H et le FAD peuvent exister dans les cellules dans des conformations liées aux protéines ou libres, chacune ayant une durée de vie différente. Le NAD(P)H libre a une durée de vie plus courte que le NAD(P)H lié aux protéines; à l’inverse, le FAD libre a une durée de vie plus longue que le FAD lié18,19. Les durées de vie et les poids des composants à vie peuvent être quantifiés à partir des données de désintégration de la durée de vie de la fluorescence via Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) représente l’intensité de fluorescence normalisée en fonction du temps. Les α 1 et α 2 de cette équation représentent les composantes proportionnelles des durées de vie courtes et longues (α 1+ α 2=1), respectivement, τ1 et τ2 représentent les durées de vie courtes et longues, respectivement, et C représente la lumière de fond7,20. La durée de vie pondérée en fonction de l’amplitude, représentée ici par τm, est calculée à l’aide de Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Une durée de vie moyenne peut être calculée en faisant la moyenne de « t » sur la désintégration d’intensité du fluorophore, qui pour une désintégration à deux exponentielles est montrée par Eq. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Une image d’intensité de fluorescence peut être calculée à partir de l’image de durée de vie en intégrant la désintégration de la durée de vie de fluorescence. L’imagerie par autofluorescence est une méthode non destructive et sans étiquette qui peut être utilisée pour caractériser le métabolisme des cellules vivantes à une résolution subcellulaire. Le rapport redox optique fournit une métrique analogique optique de l’état redox chimique de la cellule et est calculé comme le rapport des intensités NAD(P)H et FAD. Bien que la formule de calcul du rapport redox optique ne soit pas normalisée22,23,24,25, elle est définie ici comme l’intensité de la DCP par rapport aux intensités combinées de NAD(P)H et de FAD. Cette définition est utilisée parce que l’intensité totale dans le dénominateur normalise la métrique entre 0 et 1, et le résultat attendu de l’inhibition du cyanure est une diminution du rapport redox. Les durées de vie en fluorescence du NAD(P)H libre et du FAD donnent un aperçu des changements dans le microenvironnement du solvant métabolique, y compris le pH, la température, la proximité de l’oxygène et l’osmolarité17.
Les changements dans la durée de vie de fluorescence des fractions liées de NAD(P)H et de FAD peuvent indiquer l’utilisation de la voie métabolique et le métabolisme spécifique du substrat26. Les poids des composants peuvent être interprétés pour les changements dans la fraction libre à la fraction liée des coenzymes18,19. Dans l’ensemble, ces mesures quantitatives de la durée de vie de l’autofluorescence permettent l’analyse du métabolisme cellulaire, et l’imagerie par autofluorescence a été utilisée pour identifier les néoplasmes des tissus normaux27,28, caractériser les cellules souches29,30, évaluer la fonction des cellules immunitaires31,32,33,34,35, évaluer l’activité neurologique36, 37,38, et comprendre l’efficacité des médicaments dans les types de cancer tels que le cancer du sein et le cancer de la tête et du cou21,39,40,41,42. L’imagerie par autofluorescence à haute résolution peut être combinée à la segmentation d’images pour l’analyse unicellulaire et la quantification de l’hétérogénéité intrapopulation43,44,45,46,47.
Le NAD(P)H et le FAD peuvent être imagés sur des microscopes à fluorescence monophotonique ou multiphotonique configurés pour l’imagerie d’intensité ou de durée de vie. Pour les microscopes monophotoniques, le NAD(P)H et le FAD sont généralement excités à des longueurs d’onde de 375-405 nm et 488 nm, respectivement, en raison de sources laser courantes à ces longueurs d’onde48. Dans l’excitation par fluorescence à deux photons, le NAD(P)H et le FAD s’exciteront à des longueurs d’onde d’environ 700 à 750 nm et de 700 à 900 nm, respectivement15,49. Une fois les fluorophores excités, le NAD(P)H et le FAD émettent des photons à des longueurs d’onde comprises respectivement entre ~410 nm et ~510 nm à ~640 nm15. Les longueurs d’onde d’émission maximales NAD(P)H et FAD sont respectivement d’environ 450 nm et 535 nm48.
En raison de leurs différentes longueurs d’onde d’excitation et d’émission, la fluorescence des deux coenzymes métaboliques peut être isolée spectralement. Une compréhension des caractéristiques spectrales du NAD(P)H et du FAD est nécessaire pour la conception et l’optimisation des protocoles d’imagerie par autofluorescence. Le cyanure est un inhibiteur IV du complexe IV de la chaîne de transport d’électrons (ETC). Les effets du cyanure sur le métabolisme cellulaire et les intensités d’autofluorescence et la durée de vie du NAD(P)H et du FAD dans les cellules sont bien caractérisés27,40. Par conséquent, une expérience de perturbation du cyanure est un moyen efficace de valider les protocoles d’imagerie NAD(P)H et FAD. Une expérience réussie sur le cyanure permet de s’assurer que le protocole d’imagerie NAD(P)H et FAD peut être utilisé pour évaluer le métabolisme de groupes inconnus ou de perturbations.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

Le métabolisme cellulaire est le processus par lequel les cellules génèrent de l’énergie, et de nombreuses maladies, y compris le cancer, sont caractérisées par un métabolisme anormal. La réduction de la nicotinamide adénine (phosphate), du dinucléotide (NAD(P)H) et de la flavine adénine dinucléotide (FAD) oxydée sont des coenzymes de réactions métaboliques. Le NAD(P)H et le FAD présentent une autofluorescence et peuvent être isolés spectralement par des longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Les deux coenzymes, NAD(P)H et FAD, peuvent exister dans une configuration libre ou liée aux protéines, chacune ayant une durée de vie de fluorescence distincte - le temps pendant lequel le fluorophore reste à l’état excité. L’imagerie par durée de vie de fluorescence (FLIM) permet de quantifier l’intensité de fluorescence et la durée de vie du NAD(P)H et du FAD pour une analyse sans étiquette du métabolisme cellulaire. L’intensité de fluorescence et la durée de vie des microscopes peuvent être optimisés pour l’imagerie NAD(P)H et FAD en sélectionnant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées. Les perturbations métaboliques par le cyanure vérifient les protocoles d’imagerie par autofluorescence pour détecter les changements métaboliques dans les cellules. Cet article démontrera la technique d’imagerie par autofluorescence du NAD(P)H et du FAD pour mesurer le métabolisme cellulaire.

La lignée cellulaire du cancer du sein épithélial, MCF-7, a été cultivée dans du DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine. Pour l’imagerie par fluorescence, les cellules ont été ensemencées à une densité de 4 × 105 cellules par antenne d’imagerie à fond de verre de 35 mm 48 h avant l’imagerie. Les cellules ont été imagées avant et après le traitement au cyanure en utilisant les protocoles énoncés ci-dessus. L’objectif de l’expérience...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Ce protocole décrit l’imagerie par fluorescence et l’analyse des coenzymes métaboliques endogènes, du dinucléotide réduit en nicotinamide adénine (phosphate) (NAD(P)H) et du dinucléotide de flavine adénine oxydé (FAD). L’imagerie par autofluorescence du NAD(P)H et du FAD fournit une méthode non destructive sans étiquette pour évaluer le métabolisme cellulaire.

Imagerie par autofluorescence pour évaluer le métabolisme cellulaire

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

L’ADH et la FAD sont des molécules endogènes qui présentent une autofluorescence à différentes longueurs d’onde d’excitation et d’émission. En raison de leur utilisation comme co-enzymes des réactions métaboliques, la microscopie à autofluorescence peut évaluer le métabolisme cellulaire. L’imagerie par autofluorescence du NADH et du FAD ne nécessite pas d’étiquettes exogènes et est une méthode non destructive avec une résolution subcellulaire.La microscopie à autofluorescence peut être utilisée sur des échantillons vivants et pour des études de parcours temporel. L’imagerie autofluorescente peut être largement appliquée à toutes les cellules ou tissus vivants. L’imagerie autofluorescente a été utilisée sur les neurones, les cellules cancéreuses, les tumeurs, in vivo, les cellules souches et les cellules immunitaires.La démonstration de la procédure sera faite par Linghao Hu, un étudiant diplômé du laboratoire d’imagerie optique quantitative de la Texas A & M University. Commencez l’expérience en allumant tous les composants du microscope à vie à fluorescence multiphotonique, y compris la source laser et les détecteurs. Avant de placer l’échantillon, allumez la lampe à champ lumineux et assurez-vous que la lumière pénètre dans l’oculaire.Ensuite, choisissez un objectif pour l’imagerie cellulaire. Si vous n’utilisez pas d’objectif aérien, appliquez une goutte du milieu d’immersion approprié sur le dessus de l’objectif. Placez le plat à fond de verre sur le porte-échantillon sur la scène du microscope.Ensuite, centrez l’échantillon avec l’objectif à l’aide de la commande d’étage X / Y Assurez-vous que l’échantillon est sécurisé et ne bougera pas pendant l’imagerie. Une fois cela fait, regardez dans l’oculaire et déplacez l’objectif vers le haut pour vous concentrer sur les cellules. Si le microscope se trouve dans un boîtier, fermez la porte de la boîte à lumière.Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur l’onglet Imagerie multiphotonique pour définir les paramètres d’imagerie multiphotoniques comme décrit dans le manuscrit. Ajustez le gain du détecteur à la valeur optimale pour l’imagerie à vie de fluorescence, ou FILM. Ensuite, modifiez le temps de séjour de la dépense laser à chaque pixel de l’échantillon à la valeur souhaitée.Pour le nicotinamide adénine phosphate dinucléotide, ou NADPH, réglez le laser multiphoton à 750 nanomètres. Ensuite, vérifiez que le contrôle de puissance du laser est réglé à zéro afin que les cellules ne soient pas endommagées lors de l’ouverture de l’obturateur sur le laser. Réglez un filtre d’émission entre 400 et 500 nanomètres.Lorsque les paramètres sont définis, commencez à créer des images de manière ciblée ou en direct pour optimiser les paramètres de l’image. Augmentez lentement la puissance du laser de trois à huit milliwatts tout en vous assurant que les cellules sont au point. Une fois réglé, notez la puissance maximale utilisée.Utilisez le réglage de puissance maximale enregistrée pour l’imagerie sur d’autres segments de la boîte de Pétri. Collectez une image NADPH-FILM avec un temps d’intégration d’image de 60 secondes et vérifiez que l’image a un nombre suffisant de photons, comme un pic de 100 photons pour un pixel de cytoplasme dans la courbe de désintégration de la durée de vie de la fluorescence. Si le nombre de photons est trop faible, augmentez la puissance laser ou la durée d’acquisition de l’image.Pour l’imagerie du dinucléotide de flavine adénine, ou FAD, réglez le laser multiphoton à 890 nanomètres et attendez que le laser se verrouille en mode à la nouvelle longueur d’onde. Assurez-vous que le contrôle de puissance du laser est initialement réglé à zéro. Réglez un filtre d’émission entre 500 et 600 nanomètres.Pour optimiser les paramètres d’image, commencez à photographier de manière focalisée ou en direct en augmentant la puissance du laser à 5 à 10 milliwatts et en enregistrant la puissance maximale utilisée. Utilisez le même paramètre d’alimentation pour l’imagerie FAD des champs de vision suivants. Collectez l’image FAD-FILM avec un temps d’intégration de l’image de 60 secondes et vérifiez que l’image contient suffisamment de photons dans la courbe de désintégration de la durée de vie de la fluorescence.Si le nombre de photons est trop faible, augmentez la puissance laser ou la durée d’acquisition de l’image et répétez l’imagerie pour quatre à cinq champs de vision supplémentaires, ou FOV, chaque image étant espacée de deux FOV. Pour obtenir une solution de cyanure de sodium de 80 millimolaires, dissoudre 130,24 milligrammes de cyanure de sodium dans 25 millilitres de PBS. À partir de la boîte de culture, aspirer 100 microlitres de milieu de culture à remplacer par 100 microlitres de solution de cyanure de sodium pour obtenir une concentration de cyanure de quatre millimolaires dans la boîte.Mettez les cellules dans un incubateur pendant cinq minutes pour permettre aux cellules de réagir avec la solution de cyanure. Après l’exposition au cyanure, acquérir des images NADPH et FAD des cellules comme décrit précédemment. L’étude a calculé les paramètres de durée de vie de la fluorescence à l’aide de la fonction de réponse de l’instrument mesurée, ou IRF, à partir de l’urée.Les paramètres ont été moyennés à travers les pixels du cytoplasme de chaque cellule utilisée pour la segmentation. Des cellules individuelles ont été identifiées et masquées pour éliminer le bruit de fond. Ensuite, le noyau a été identifié et projeté sur le masque cellulaire.De plus, les cellules ont été filtrées pour éliminer les zones masquées qui ne correspondent pas à la taille des cellules typiques. L’imagerie à vie de fluorescence multiphotonique du NADPH et du FAD a permis de visualiser la morphologie et le métabolisme cellulaires avant et après le traitement au cyanure. Il a été observé que la durée de vie du NADPH diminue avec le traitement au cyanure, tandis que la durée de vie de la DCP augmente après le traitement au cyanure.Le diagramme représentatif de la boîte indiquait que le rapport redox optique des cellules MCF7 diminuait après le traitement au cyanure. L’exposition au cyanure a diminué la durée de vie du NADPH pondérée en amplitude des cellules MCF7. Les durées de vie courtes et longues ont diminué pour le NADPH, mais ont augmenté pour le NADPH alpha un.Pour la DCP, la durée de vie pondérée en fonction de l’amplitude des cellules MCF7 a augmenté après l’exposition au cyanure. Les durées de vie courtes et longues ont augmenté pour FAD, mais ont diminué pour FAD alpha one. Il est important d’avoir suffisamment de puissance laser pour aller aux échantillons, mais rappelez-vous, trop de puissance peut causer des dommages aux cellules.Parce que l’imagerie par autofluorescence n’endommage pas les cellules, des tests biochimiques ultérieurs peuvent être utilisés sur les mêmes échantillons.

Research

JoVE Journal

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