Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
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Zu den Finanzierungsquellen gehören das Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) und die Texas A & M University. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

1. Zellbeschichtung für die Bildgebung
<ol><li>Saugen Sie das Medium aus einem 80-90% igen konfluierenden T-75-Kolben von MCF-7-Zellen ab, spülen Sie die Zellen mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin (1x) hinzu, um die Zellen vom Kolbenboden zu lösen.</li>
	<li>Den Kolben bei 37 °C für ~4 min inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Ablösung zu bestätigen.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 8 ml Kulturmedium hinzu, um da...

Die Autofluoreszenzintensität und die lebenslange Bildgebung wurden häufig zur Beurteilung des Stoffwechsels in Zellen eingesetzt21,55. FLIM ist hochauflösend und löst daher einzelne Zellen auf, was für Krebsstudien wichtig ist, da die zelluläre Heterogenität zur Tumoraggression und Arzneimittelresistenz beiträgt7,39,41,44,45,46,58.</...

Stoffwechsel ist der zelluläre Prozess der Energieerzeugung. Der Zellstoffwechsel umfasst mehrere Wege, einschließlich Glykolyse, oxidative Phosphorylierung und Glutaminolyse. Gesunde Zellen nutzen diese Stoffwechselwege, um Energie für die Proliferation und Funktion zu erzeugen, wie zum Beispiel die Produktion von Zytokinen durch Immunzellen. Viele Krankheiten, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs und Neurodegeneration, sind durch einen veränderten Zellstoffwechsel gekennzeichnet1. Zum Beispiel haben einige Krebszelltypen erhöhte Glykolyseraten, selbst in Gegenwart von Sauerstoff, um Moleküle für die Synthese von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden zu erzeugen2,3. Dieses Phänomen, das als Warburg-Effekt bekannt ist, ist ein Kennzeichen vieler Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs und Glioblastome4. Aufgrund der Veränderungen des Zellstoffwechsels, die mit dem Fortschreiten der Krebserkrankung verbunden sind, kann der Zellstoffwechsel ein Surrogat-Biomarker für die Arzneimittelreaktion sein5,6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit auf zellulärer Ebene von entscheidender Bedeutung, da die Zellheterogenität bei Individuen zu unterschiedlichen Arzneimittelreaktionen führen kann7,8.
Technologien, die Veränderungen im Zellstoffwechsel identifizieren und quantifizieren, sind für Studien zu Krebs und Medikamentenreaktion unerlässlich. Chemische und Proteinanalysen werden verwendet, um den Stoffwechsel von Zellen oder Geweben zu bewerten, aber es fehlen Einzelzellauflösungen und räumliche Informationen. Metabolische Plattenleser-basierte Assays können den pH- und Sauerstoffverbrauch in der Probe im Laufe der Zeit und die anschließende metabolische Störung durch Chemikalien messen. Über den pH-Wert kann die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) berechnet werden, die einen Einblick in die glykolytische Aktivität der Zellen gibt9. Bildgebende Ganzkörpermethoden, einschließlich 2-[Fluor-18] Fluor-D-Glucose-Positronen-Emissions-Tomographie (FDG PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS), sind nichtinvasive Bildgebungsmodalitäten, die klinisch verwendet werden, um Tumorrezidive und Arzneimittelwirksamkeit durch metabolische Messungen zu identifizieren10,11,12,13,14.
FDG-PET bildet die Gewebeaufnahme von FDG, einem radioaktiv markierten Glukoseanalogon, ab. Die erhöhte Aufnahme von FDG-PET durch Tumore im Verhältnis zum umgebenden Gewebe ist auf den Warburg-Effekt zurückzuführen12,13. MRS bildet gemeinsame Kerne von Molekülen ab, die für den Stoffwechsel verwendet werden, wie 13C und 31P, und kann dynamische Informationen darüber erhalten, wie sich der Stoffwechsel als Reaktion auf Reize wie Bewegung oder Essen verändert14. Obwohl FDG-PET und MRS klinisch eingesetzt werden können, fehlt diesen Technologien die räumliche Auflösung, um die intratumorale Heterogenität aufzulösen. Ebenso werden Sauerstoffverbrauchsmessungen an einer Massenpopulation von Zellen durchgeführt. Die Autofluoreszenzbildgebung überwindet das räumliche Auflösungshindernis dieser Technologien und bietet eine nichtinvasive Methode zur Quantifizierung des Zellstoffwechsels.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Abbildung 1: NADH und FAD in gemeinsamen Stoffwechselwegen. NADH und FAD sind Coenzyme, die in der Glykolyse, im Krebszyklus und in der Elektronentransportkette verwendet werden. Die Autofluoreszenzbildgebung dieser Moleküle liefert Informationen über den Zellstoffwechsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen, einschließlich Glykolyse, oxidativer Phosphorylierung und Glutaminolyse (Abbildung 1). Sowohl NAD(P)H als auch FAD sind autofluoreszierend und bieten einen endogenen Kontrast für die Fluoreszenzbildgebung1,15. NADPH hat ähnliche fluoreszierende Eigenschaften wie NADH. Aus diesem Grund wird NAD(P)H häufig verwendet, um das kombinierte Signal von NADH und NADPH2,16 darzustellen.
Die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FLIM) quantifiziert die Fluoreszenzlebensdauer oder die Zeit, für die sich ein Fluorophor im angeregten Zustand befindet. Fluoreszenzlebensdauern reagieren auf die Mikroumgebung der Fluorophore und liefern Informationen über den Zellstoffwechsel17. NAD(P)H und FAD können in Zellen entweder in proteingebundenen oder freien Konformationen existieren, von denen jede eine andere Lebensdauer hat. Freies NAD(P)H hat eine kürzere Lebensdauer als proteingebundenes NAD(P)H; Umgekehrt hat die freie FAD eine längere Lebensdauer als die gebundenen FAD18,19. Die Lebensdauern und Lebensdauerkomponentengewichte können aus Fluoreszenz-Lebensdauerzerfallsdaten durch Gl. (1)20 quantifiziert werden:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) stellt die normierte Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit dar. Die α 1 und α 2 in dieser Gleichung stellen die proportionalen Komponenten der kurzen und langen Lebensdauer (α 1+ α 2=1) dar, τ1 und τ2 die kurze bzw. lange Lebensdauer und C das Hintergrundlicht7,20. Die amplitudengewichtete Lebensdauer, hier dargestellt als τm, wird mit Gleichung (2) berechnet.
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Eine mittlere Lebensdauer kann durch Mittelung von "t" über den Intensitätszerfall des Fluorophors berechnet werden, was für einen zweiexponentiellen Zerfall durch Gl. (3)17,21 dargestellt wird.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Ein Fluoreszenzintensitätsbild kann aus dem Lebensdauerbild berechnet werden, indem der Fluoreszenzlebensdauerzerfall integriert wird. Die Autofluoreszenzbildgebung ist eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Methode, mit der der Stoffwechsel lebender Zellen mit subzellulärer Auflösung charakterisiert werden kann. Das optische Redoxverhältnis liefert eine optische Analogmetrik des chemischen Redoxzustands der Zelle und wird als Verhältnis von NAD(P)H- und FAD-Intensitäten berechnet. Obwohl die Formel zur Berechnung des optischen Redoxverhältnisses nicht standardisiert ist22,23,24,25, wird sie hier als die Intensität von FAD über die kombinierten Intensitäten von NAD(P)H und FAD definiert. Diese Definition wird verwendet, weil die summierte Intensität im Nenner die Metrik zwischen 0 und 1 normalisiert und das erwartete Ergebnis der Cyanidhemmung eine Abnahme des Redoxverhältnisses ist. Die Fluoreszenzlebensdauern von freiem NAD(P)H und FAD liefern Einblicke in Veränderungen in der metabolischen Lösungsmittelmikroumgebung, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Nähe zu Sauerstoff und Osmolarität17.
Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer der gebundenen Fraktionen von NAD(P)H und FAD können auf die Nutzung des Stoffwechselwegs und den substratspezifischen Stoffwechsel hinweisen26. Komponentengewichte können für Änderungen der freien zur gebundenen Fraktion der Coenzyme interpretiert werden18,19. Insgesamt ermöglichen diese quantitativen Autofluoreszenz-Lebenszeitmetriken die Analyse des Zellstoffwechsels, und die Autofluoreszenz-Bildgebung wurde zur Identifizierung von Neoplasmen aus normalem Gewebe verwendet27,28, zur Charakterisierung von Stammzellen29,30, zur Bewertung der Immunzellfunktion31,32,33,34,35, zur Messung der neurologischen Aktivität36, 37,38, und Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit bei Krebsarten wie Brustkrebs und Kopf-Hals-Krebs21,39,40,41,42. Hochauflösende Autofluoreszenzbildgebung kann mit Bildsegmentierung für die Einzelzellanalyse und Quantifizierung der intrapopulationären Heterogenität kombiniert werden43,44,45,46,47.
NAD(P)H und FAD können auf Einzelphotonen- oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopen abgebildet werden, die für die Intensitäts- oder Lebensdauerbildgebung konfiguriert sind. Bei Einzelphotonenmikroskopen werden NAD(P)H und FAD aufgrund üblicher Laserquellen bei diesen Wellenlängen typischerweise bei Wellenlängen von 375-405 nm bzw. 488 nm angeregt48. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung werden NAD(P)H und FAD bei Wellenlängen von etwa 700 bis 750 nm bzw. 700 bis 900 nm bzw. 15,49 anregen. Sobald die Fluorophore angeregt sind, emittieren NAD(P)H und FAD Photonen bei Wellenlängen zwischen ~410 nm bis ~490 nm bzw. ~510 nm bis ~640 nm15. Die maximalen Emissionswellenlängen NAD(P)H und FAD betragen etwa 450 nm bzw. 535 nm48.
Aufgrund ihrer unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen kann die Fluoreszenz der beiden metabolischen Coenzyme spektral isoliert werden. Ein Verständnis der spektralen Eigenschaften von NAD(P)H und FAD ist für das Design und die Optimierung von Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokollen notwendig. Cyanid ist ein Elektrontransportkette (ETC) -Komplex-IV-Inhibitor. Die Auswirkungen von Cyanid auf den Zellstoffwechsel und die Autofluoreszenzintensitäten und Lebensdauern von NAD(P)H und FAD in Zellen sind gut charakterisiert27,40. Daher ist ein Cyanid-Störungsexperiment ein wirksames Mittel zur Validierung von NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokollen. Ein erfolgreiches Cyanidexperiment gibt die Gewissheit, dass das NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokoll verwendet werden kann, um den Stoffwechsel unbekannter Gruppen oder Störungen zu beurteilen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

Der Zellstoffwechsel ist der Prozess, durch den Zellen Energie erzeugen, und viele Krankheiten, einschließlich Krebs, sind durch einen abnormalen Stoffwechsel gekennzeichnet. Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen. NAD(P)H und FAD weisen Autofluoreszenz auf und können spektral durch Anregung und Emissionswellenlängen isoliert werden. Beide Coenzyme, NAD (P) H und FAD, können entweder in einer freien oder proteingebundenen Konfiguration vorliegen, von denen jedes eine ausgeprägte Fluoreszenzlebensdauer hat - die Zeit, für die das Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt. Die Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung (FLIM) ermöglicht die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und Lebensdauer von NAD(P)H und FAD für eine markierungsfreie Analyse des Zellstoffwechsels. Fluoreszenzintensitäts- und Lebensdauermikroskope können für die Bildgebung von NAD(P)H und FAD optimiert werden, indem die geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen ausgewählt werden. Metabolische Störungen durch Cyanid verifizieren Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokolle, um metabolische Veränderungen in Zellen zu erkennen. Dieser Artikel demonstriert die Technik der Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD zur Messung des Zellstoffwechsels.

Die epitheliale Brustkrebs-Zelllinie, MCF-7, wurde in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Zellen mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro 35 mm Glasboden-Bildgebungsschale 48 h vor der Bildgebung ausgesät. Die Zellen wurden vor und nach der Cyanidbehandlung unter Verwendung der oben genannten Protokolle abgebildet. Ziel des Cyanidexperiments ist es, die spektrale Isolierung von NAD(P)H- und FAD-Fluoreszenz zu bes...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH und FAD sind endogene Moleküle, die Autofluoreszenz bei unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweisen. Aufgrund ihrer Verwendung als Co-Enzyme von Stoffwechselreaktionen kann die Autofluoreszenzmikroskopie den Zellstoffwechsel beurteilen. Die Autofluoreszenzbildgebung von NADH und FAD erfordert keine exogenen Markierungen und ist eine zerstörungsfreie Methode mit subzellulärer Auflösung.Die Autofluoreszenzmikroskopie kann an lebenden Proben und für Zeitkursstudien verwendet werden. Die autofluoreszierende Bildgebung kann weitgehend auf alle lebenden Zellen oder Gewebe angewendet werden. Autofluoreszierende Bildgebung wurde bei Neuronen-, Krebszell-, Tumor-, In-vivo-, Stammzell- und Immunzellen eingesetzt.Linghao Hu, ein Doktorand des Quantitative Optical Imaging Laboratory an der Texas A & M University, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie alle Komponenten des Multiphotonen-Fluoreszenz-Lebensdauermikroskops einschalten, einschließlich der Laserquelle und der Detektoren. Schalten Sie vor der Platzierung der Proben die helle Feldlampe ein und stellen Sie sicher, dass das Licht in das Okular gelangt.Wählen Sie dann ein Objektiv für die Zellbildgebung aus. Wenn Sie kein Luftobjektiv verwenden, tragen Sie einen Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das Objektiv auf. Legen Sie die Glasbodenschale auf den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch.Zentrieren Sie dann die Probe mit dem Objektiv unter Verwendung der X / Y-Stufensteuerung Stellen Sie sicher, dass die Probe gesichert ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt. Sobald Sie fertig sind, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren. Wenn sich das Mikroskop in einem Gehäuse befindet, schließen Sie die Leuchtkastentür.Öffnen Sie als Nächstes die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf die Registerkarte Multi-Photonen-Bildgebung, um die Multi-Photonen-Bildgebungsparameter wie im Manuskript beschrieben einzustellen. Stellen Sie die Verstärkung des Detektors auf den optimalen Wert für die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FILM) ein. Ändern Sie dann die Verweilzeit der Laserausgabe an jedem Pixel der Probe auf den gewünschten Wert.Für Nicotinamidadenindiphosphat-Dinukleotid oder NADPH stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 750 Nanometer ein. Vergewissern Sie sich dann, dass die Leistungsregelung für den Laser auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses des Lasers nicht beschädigt werden. Stellen Sie einen Emissionsfilter auf 400 bis 500 Nanometer ein.Wenn die Parameter eingestellt sind, beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren. Erhöhen Sie die Laserleistung langsam von drei auf acht Milliwatt und stellen Sie sicher, dass die Zellen im Fokus sind. Zeichnen Sie nach der Anpassung die maximal verbrauchte Leistung auf.Verwenden Sie die aufgezeichnete maximale Leistungseinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale. Sammeln Sie ein NADPH-FILM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 Sekunden und überprüfen Sie, ob das Bild eine ausreichende Anzahl von Photonen aufweist, z. B. einen Peak von 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.Stellen Sie für die Flavin-Adenin-Dinukleotid- oder FAD-Bildgebung den Multiphotonenlaser auf 890 Nanometer ein und warten Sie, bis der Laser bei der neuen Wellenlänge im Modus blockiert ist. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist. Stellen Sie einen Emissionsfilter auf 500 bis 600 Nanometer ein.Um die Bildeinstellungen zu optimieren, beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, indem Sie die Laserleistung auf 5 bis 10 Milliwatt erhöhen und die maximal verbrauchte Leistung aufzeichnen. Verwenden Sie dieselbe Energieeinstellung für die FAD-Bildgebung nachfolgender Sichtfelder. Sammeln Sie das FAD-FILM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 Sekunden und überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist.Wenn die Anzahl der Photonen zu niedrig ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme und wiederholen Sie die Bildgebung für weitere vier bis fünf Sichtfelder oder FOVs, wobei jedes Bild zwei FOVs entfernt ist. Um eine 80-Millimolare Natriumcyanidlösung herzustellen, lösen Sie 130,24 Milligramm Natriumcyanid in 25 Milliliter PBS auf. Aus der Kulturschale 100 Mikroliter Kulturmedium aspirieren, um sie durch 100 Mikroliter Natriumcyanidlösung zu ersetzen, um eine vier-millimolare Konzentration von Cyanid in der Schale zu erhalten.Legen Sie die Zellen fünf Minuten lang in einen Inkubator, damit die Zellen mit der Cyanidlösung reagieren können. Erfassen Sie nach der Cyanid-Exposition NADPH- und FAD-Bilder der Zellen wie zuvor beschrieben. Die Studie berechnete die Parameter der Fluoreszenzlebensdauer unter Verwendung der gemessenen Instrumentenreaktionsfunktion (IRF) von Harnstoff.Die Parameter wurden über die Pixel des Zytoplasmas jeder Zelle gemittelt, die für die Segmentierung verwendet wurde. Einzelne Zellen wurden identifiziert und maskiert, um Hintergrundgeräusche zu eliminieren. Dann wurde der Zellkern identifiziert und auf die Zellmaske projiziert.Darüber hinaus wurden die Zellen gefiltert, um die maskierten Bereiche zu entfernen, die nicht zur Größe typischer Zellen passen. Die Multiphotonen-Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung von NADPH und FAD ermöglichte die Visualisierung der Zellmorphologie und des Stoffwechsels vor und nach der Cyanidbehandlung. Es wurde beobachtet, dass die NADPH-Lebensdauer mit der Cyanidbehandlung abnimmt, während die FAD-Lebensdauer nach der Cyanidbehandlung zunimmt.Das repräsentative Box-Diagramm zeigte, dass das optische Redoxverhältnis von MCF7-Zellen nach der Cyanidbehandlung abnahm. Die Cyanid-Exposition verringerte die amplitudengewichtete NADPH-Lebensdauer von MCF7-Zellen. Die kurzen und langen Lebensdauern nahmen für NADPH ab, stiegen aber für NADPH alpha eins an.Für FAD nahm die amplitudengewichtete Lebensdauer von MCF7-Zellen nach Cyanid-Exposition zu. Sowohl die kurze als auch die lange Lebensdauer nahmen für FAD zu, nahmen aber für FAD alpha eins ab. Es ist wichtig, genügend Laserleistung für die Proben zu haben, aber denken Sie daran, dass zu viel Leistung die Zellen schädigen kann.Da die Autofluoreszenzbildgebung die Zellen nicht schädigt, können nachfolgende biochemische Assays an denselben Proben verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

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