Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

מקורות המימון כוללים את המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT RP200668) ואוניברסיטת טקסס A&M. איור 1 נוצר עם BioRender.com.

1. ציפוי תאים להדמיה
<ol><li>שאפו את המדיום מבקבוק T-75 בעל 80-90% של תאי MCF-7, שטפו את התאים ב-10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין (1x) כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוקון.</li>
	<li>דגירה הבקבוקון ב 37 °C (50 °F) במשך ~ 4 דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק...

עוצמת autofluorescence והדמיה לכל החיים היו בשימוש נרחב כדי להעריך את חילוף החומרים בתאים21,55. FLIM הוא ברזולוציה גבוהה ולכן פותר תאים בודדים, אשר חשוב עבור מחקרי סרטן כי הטרוגניות הסלולר תורם תוקפנות הגידול ועמידות לתרופות7,39,41,44,44,45,46,58.</su...

חילוף החומרים הוא התהליך התאי של ייצור אנרגיה. חילוף החומרים התאי מקיף מסלולים מרובים, כולל גליקוליזה, זרחן חמצוני, גלוטמינוליזיס. תאים בריאים משתמשים במסלולים מטבוליים אלה כדי לייצר אנרגיה להתפשטות ולתפקוד, כגון ייצור ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון. מחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, סרטן, ניוון עצבי, מאופיינים בחילוף חומרים תאי שונה1. לדוגמה, כמה סוגי תאים סרטניים יש שיעורים גבוהים של גליקוליזה, אפילו בנוכחות חמצן, כדי ליצור מולקולות לסינתזה של חומצות גרעין, חלבונים, שומנים, שומנים2,3. תופעה זו, המכונה אפקט ורבורג, היא סימן היכר של סוגי סרטן רבים, כולל סרטן השד, סרטן ריאות, ו glioblastomas4. בגלל השינויים של חילוף החומרים התאי הקשורים עם התקדמות הסרטן, חילוף החומרים התאי יכול להיות סמן ביולוגי פונדקאי לתגובה תרופתית 5,6. יתר על כן, הבנת יעילות התרופה ברמה התאית היא חיונית כמו הטרוגניות התא יכול להוביל לתגובות סמים שונות אצל אנשים7,8.
טכנולוגיות המזהות ומכמתות שינויים בחילוף החומרים התאי חיוניות למחקרים של סרטן ותגובה לתרופות. ניתוחים כימיים וחלבון משמשים להערכת חילוף החומרים של תאים או רקמות אך חסרים רזולוציה של תא יחיד ומידע מרחבי. בדיקות המבוססות על קורא לוחות מטבוליים יכולות למדוד את צריכת החומציות והחמצן במדגם לאורך זמן ואת ההפרעה המטבולית הבאה על ידי כימיקלים. ניתן להשתמש ב- pH כדי לחשב את קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR), המספק תובנה על הפעילות הגליקוליטית של התאים9. שיטות הדמיה לכל הגוף, כולל טומוגרפיה של פליטת פלואורו-D-גלוקוז פוזיטרונים (FDG PET) וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (MRS), הן שיטות הדמיה לא פולשניות המשמשות קלינית לזיהוי הישנות גידולים ויעילות התרופה באמצעות מדידות מטבוליות10,11,12,13,14.14.
FDG-PET מצלם את ספיגת הרקמות של FDG, אנלוגי גלוקוז עם תווית רדיו. ספיגה מוגברת של FDG-PET על ידי גידולים ביחס לרקמה שמסביב נובעת אפקט ורבורג12,13. MRS מדמה גרעינים נפוצים של מולקולות המשמשות לחילוף חומרים, כגון 13C ו- 31P, ויכולה לקבל מידע דינמי על האופן שבו חילוף החומרים משתנה בתגובה לגירויים, כגון פעילות גופנית או אכילה14. למרות FDG-PET ו- MRS ניתן להשתמש קלינית, טכנולוגיות אלה חסרות את הפתרון המרחבי כדי לפתור הטרוגניות תוךטומורלית. כמו כן, מדידות צריכת חמצן נעשות על אוכלוסייה בתפזורת של תאים. הדמיית Autofluorescence מתגברת על מכשול הרזולוציה המרחבית של טכנולוגיות אלה ומספקת שיטה לא פולשנית לכימות חילוף החומרים התאי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> איור 1: NADH ו-FAD במסלולים מטבוליים נפוצים. NADH ו-FAD הם קואנזימים המשמשים בגליקוליזה, מחזור קרבס ושרשרת הובלת האלקטרונים. הדמיה Autofluorescence של מולקולות אלה מספק מידע על חילוף החומרים הסלולר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ניקוטינאמיד אדנין מופחת (פוספט) דינוקלאוטיד (NAD(P)H) ופלובין אדנין דינוקלאוטיד מחומצן (FAD) הם קואנזימים של תגובות מטבוליות, כולל גליקוליזה, זרחן חמצוני וגלוטמינוליזיס (איור 1). הן NAD(P)H והן FAD הם autofluorescent ומספקים ניגודיות אנדוגנית להדמיית פלואורסצנטיות1,15. ל- NADPH תכונות פלואורסצנטיות דומות ל- NADH. מסיבה זו, NAD(P)H משמש לעתים קרובות כדי לייצג את האות המשולב של NADH ו NADPH2,16.
הדמיה לכל החיים פלואורסצנטיות (FLIM) מכמתת את חיי הפלואורסצנטיות או את הזמן שעבורו פלואורופור נמצא במצב הנרגש. תקופות חיים פלואורסצנטיות מגיבות למיקרו-סביבה של הפלואורופורים ומספקות מידע על חילוף החומרים התאי17. NAD(P)H ו-FAD יכולים להתקיים בתוך תאים בקונפורמציות הקשורות לחלבון או בחינם, שלכל אחד מהם יש חיים שונים. ל-NAD(P)H החינמי יש אורך חיים קצר יותר מ-NAD(P)H הקשור לחלבון; לעומת זאת, ל-FAD בחינם יש חיים ארוכים יותר מ-FAD18,19 מאוגד. ניתן לכמת את אורך החיים ואת משקולות הרכיבים לכל החיים מנתוני ריקבון לכל החיים של פלואורסצנטיות באמצעות Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) מייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות המנורמלת כפונקציה של זמן. α 1 ו-α 2 במשוואה זו מייצגים את הרכיבים היחסיים של אורך חיים קצר וארוך (α 1+ α 2=1), בהתאמה, τ1 ו- τ2 מייצגים את אורך החיים הקצר והארוך, בהתאמה, ו- C מהווה אור רקע7,20. אורך החיים המשוקלל של משרעת, המיוצג כאן כ- τm, מחושב באמצעות Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
חיים ממוצעים יכולים להיות מחושבים על ידי ממוצע "t" על דעיכה אינטנסיבית של פלואורופור, אשר עבור ריקבון דו-מעריכי מוצג על ידי Eq. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
ניתן לחשב תמונה בעוצמה פלואורסצנטית מהתמונה לכל החיים על-ידי שילוב הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. הדמיה אוטופלואורסצנטית היא שיטה לא הרסנית ונטולת תוויות שניתן להשתמש בה כדי לאפיין את חילוף החומרים של תאים חיים ברזולוציה תת-תאית. יחס redox אופטי מספק מדד אנלוגי אופטי של מצב redox כימי של התא ומחושב כיחס של עוצמות NAD(P)H ו- FAD. למרות שהנוסחה לחישוב יחס ה-redox האופטי אינה מתוקננת22,23,24,25, היא מוגדרת כאן כעוצמת ה-FAD על פני העוצמות המשולבות של NAD(P)H ו-FAD. הגדרה זו משמשת מכיוון שהעוצמה המסוכמת במכנה מנרמלת את המדד בין 0 ל-1, והתוצאה הצפויה של עיכוב הציאניד היא ירידה ביחס ה- redox. חיי הפלואורסצנטיות של NAD(P)H ו-FAD בחינם מספקים תובנה לגבי שינויים במיקרו-סביבה הממסית המטבולית, כולל pH, טמפרטורה, קרבה לחמצן ואוסמולאריות17.
שינויים באורך הפלואורסצנטיות של השברים הכרוכים של NAD(P)H ו- FAD יכולים להצביע על ניצול מסלול מטבולי וחילוף חומרים ספציפי למצע26. ניתן לפרש משקולות רכיבים לשינויים בשבר החופשי עד הכרוך של קואנזים18,19. בסך הכל, מדדים כמותיים אלה של אורך החיים של autofluorescence מאפשרים ניתוח של חילוף החומרים התאי, והדמיה autofluorescence שימש לזיהוי neoplasms מרקמות נורמליות27,28, המאפיינים תאי גזע29,30, הערכת תפקוד תאי מערכת החיסון31,32,33,34,35, מודד פעילות נוירולוגית36, 37,38, והבנת יעילות התרופה בסוגי סרטן כגון סרטן השד וסרטן הראש והצוואר21,39,40,41,42. הדמיית תצפרחת אוטומטית ברזולוציה גבוהה ניתן לשלב עם פילוח תמונה לניתוח תא יחיד וכימות של הטרוגניות תוך-אוכלוסיות43,44,44,45,45,46,47.
ניתן לצלם את NAD(P)H ו- FAD במיקרוסקופים פלואורסצנטיים של פוטון יחיד או רב-פוטון המוגדרים לעוצמה או להדמיה לכל החיים. עבור מיקרוסקופים של פוטון יחיד, NAD(P)H ו- FAD מתרגשים בדרך כלל באורכי גל של 375-405 ננומטר ו- 488 ננומטר, בהתאמה, בשל מקורות לייזר נפוצים באורכי גל אלה48. בהתרגשות פלואורסצנטית דו-פוטונית, NAD(P)H ו-FAD ירגשו באורכי גל של כ-700 עד 750 ננומטר ו-700 עד 900 ננומטר, בהתאמה, 15,49. לאחר הפלורופורים מתרגשים, NAD(P)H ו- FAD פולטים פוטונים באורכי גל בין ~ 410 ננומטר ל ~ 490 ננומטר ו ~ 510 ננומטר ~ 640 ננומטר, בהתאמה. אורכי הגל של פליטת NAD(P)H ו-FAD maxa הם כ-450 ננומטר ו-535 ננומטר, בהתאמה, בהתאמה.
בגלל אורכי הגל השונים של עירור ופליטה, הפלואורסצנטיות של שני הקואנזימים המטבוליים יכולה להיות מבודדת באופן ספקטרלי. הבנה של המאפיינים הספקטרליים של NAD(P)H ו- FAD נחוצה לתכנון ואופטימיזציה של פרוטוקולי הדמיה autofluorescence. ציאניד הוא מעכב עירוי מורכב של שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC). ההשפעות של ציאניד על חילוף החומרים התאי ואת עוצמות autofluorescence ואת אורך החיים של NAD(P)H ו FAD בתוך תאים מאופיינים היטב27,40. לכן, ניסוי הפרעת ציאניד הוא אמצעי יעיל לאימות פרוטוקולי הדמיה NAD(P)H ו- FAD. ניסוי ציאניד מוצלח מספק ביטחון כי פרוטוקול הדמיה NAD(P)H ו- FAD יכול לשמש כדי להעריך את חילוף החומרים של קבוצות לא ידועות או הפרעות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

חילוף החומרים התאי הוא התהליך שבו תאים מייצרים אנרגיה, ומחלות רבות, כולל סרטן, מאופיינות בחילוף חומרים חריג. ניקוטינאמיד אדנין מופחת (פוספט) דינוקלאוטיד (NAD(P)H) ופלובין אדנין דינוקלאוטיד מחומצן (FAD) הם קואנזימים של תגובות מטבוליות. NAD(P)H ו-FAD מציגים זרימה אוטומטית וניתן לבודד אותם באופן ספקטרלי על ידי אורכי גל של עירור ופליטה. שני הקואנזימים, NAD(P)H ו- FAD, יכולים להתקיים בתצורה חופשית או כרוכה בחלבון, שלכל אחד מהם פלואורסצנטיות ייחודית לכל החיים - הזמן שעבורו הפלואורופור נשאר במצב הנרגש. הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM) מאפשרת כימות של עוצמת הפלואורסצנטיות ואורך החיים של NAD(P)H ו- FAD לניתוח ללא תוויות של חילוף החומרים התאי. ניתן למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות ואת המיקרוסקופים לכל החיים להדמיית NAD(P)H ו- FAD על-ידי בחירת אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה. הפרעות מטבוליות על ידי ציאניד לאמת פרוטוקולי הדמיה autofluorescence כדי לזהות שינויים מטבוליים בתוך תאים. מאמר זה ידגים את הטכניקה של הדמיית autofluorescence של NAD(P)H ו- FAD למדידת חילוף החומרים התאי.

קו תאי סרטן השד האפיתל, MCF-7, היה תרבית ב- DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. להדמיית פלואורסצנטיות, התאים נזרעו בצפיפות של 4 × 105 תאים לכל צלחת הדמיה תחתית זכוכית 35 מ"מ 48 שעות לפני ההדמיה. התאים צולמו לפני ואחרי טיפול ציאניד באמצעות הפרוטוקולים שצוינו לעיל. מטרת ניסו...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

פרוטוקול זה מתאר הדמיה וניתוח פלואורסצנטי של קואנזימים מטבוליים אנדוגני, אדנין ניקוטינאמיד מופחת (פוספט) dinucleotide (NAD(P)H), ו flavin adenine dinucleotide מחומצן (FAD). הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו-FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת חילוף החומרים התאי.

הדמיית זרם אוטומטי להערכת חילוף החומרים התאי

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH ו-FAD הן מולקולות אנדוגניות המציגות זרימה אוטומטית באורכי גל שונים של עירור ופליטה. בגלל השימוש שלהם כקו-אנזימים של תגובות מטבוליות, מיקרוסקופיה autofluorescence יכול להעריך את חילוף החומרים התאי. הדמיה אוטופלואורסצנטית של NADH ו- FAD אינה דורשת תוויות אקסוגניות והיא שיטה לא הרסנית עם רזולוציה תת-תאית.ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של Autofluorescence על דגימות חיות ועל לימודי קורס זמן. הדמיה אוטופלואורסצנטית יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על כל תאים חיים או רקמה. הדמיה אוטופלואורסצנטית שימשה על נוירון, תא סרטן, גידול, in-vivo, תאי גזע, ותאי מערכת החיסון.מי שידגים את ההליך יהיה לינגהאו הו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה להדמיה אופטית כמותית באוניברסיטת טקסס A&M. התחל את הניסוי על ידי הפעלת כל הרכיבים של מיקרוסקופ החיים פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות רב פוטוניות, כולל מקור הלייזר והגלאים. לפני מיקום הדגימה, הפעילו את מנורת השדה הבהירה וודאו שהאור נכנס לעפעף.לאחר מכן, בחר מטרה עבור הדמיית התא. אם לא משתמשים במטרת אוויר, יש למרוח טיפה אחת של מדיום הטבילה המתאים על גבי המטרה. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה על מחזיק הדגימה על במת המיקרוסקופ.לאחר מכן, מרכז את הדגימה עם המטרה באמצעות בקרת שלב X/ Y ודא כי הדגימה מאובטחת ולא תזוז במהלך הדמיה. לאחר ביצוע, להסתכל לתוך העין ולהזיז את המטרה למעלה כדי להתמקד בתאים. אם המיקרוסקופ נמצא בתוך מתחם, סגור את דלת תיבת האור.לאחר מכן, פתח את תוכנת רכישת התמונה ולחץ על הכרטיסיה הדמיה מרובת פוטונים כדי להגדיר את הפרמטרים הדמיה מרובת פוטונים כמתואר בכתב היד. התאם את הרווח של הגלאי לערך האופטימלי עבור הדמיית חיי הפלואורסצנטיות, או FILM. לאחר מכן, שנה את זמן ההשתהות של הוצאות הלייזר בכל פיקסל של הדגימה לערך הרצוי.עבור ניקוטינאמיד אדנין אדנין פוספט דינוקלאוטיד, או NADPH, הגדר את הלייזר רב-פוטונים ל-750 ננומטר. לאחר מכן, ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס, כך התאים אינם פגומים בעת פתיחת התריס על הלייזר. הגדר מסנן פליטה ב 400 עד 500 ננומטר.כאשר הפרמטרים מוגדרים, התחל הדמיה באופן מיקוד או הצגה חיה כדי למטב את הגדרות התמונה. הגדל לאט את כוח הלייזר משלושה לשמונה מילי-וואט תוך הקפדה שהתאים נמצאים בפוקוס. לאחר ההתאמה, רשום את העוצמה המרבית שבה נעשה שימוש.השתמש בהגדרת הכוח המרבית המוקלטת להדמיה בקטעים אחרים של צלחת פטרי. אסוף תמונת NADPH-FILM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות ובדוק שלתמונה יש מספר מספיק של פוטונים, כגון שיא של 100 פוטונים לפיקסל ציטופלסמה בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או את משך הזמן של רכישת התמונה.עבור אדנין dinucleotide flavin, או FAD, הדמיה, להגדיר את לייזר רב פוטון ל 890 ננומטר ולחכות לייזר למצב נעילה באורך הגל החדש. ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס בתחילה. הגדר מסנן פליטה ב 500 עד 600 ננומטר.כדי למטב את הגדרות התמונה, התחל בהדמיה באופן ממוקד או צפייה חיה על-ידי הגדלת עוצמת הלייזר ל-5 עד 10 מילי-וואט ורישום העוצמה המרבית שבה נעשה שימוש. השתמש באותה הגדרת צריכת חשמל עבור הדמיית ה- FAD של שדות התצוגה הבאים. אסוף את תמונת FAD-FILM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות ובדוק שלתמונה יש מספיק פוטונים בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות.אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או משך הזמן של רכישת התמונה וחזור על ההדמיה עבור ארבעה עד חמישה שדות ראייה נוספים, או FOVs, כאשר כל תמונה מרווחת במרחק של שני FOVs. כדי ליצור פתרון ציאניד נתרן 80 מילימולרי, להמיס 130.24 מיליגרם של ציאניד נתרן ב 25 מיליליטר של PBS. מתוך צלחת התרבות, לשאוף 100 microliters של מדיום תרבות להחליף עם 100 מיקרוליטרים של פתרון ציאניד נתרן כדי לקבל ריכוז ארבעה מילימולרי של ציאניד בצלחת.שים את התאים באינקובטור במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להגיב עם פתרון ציאניד. לאחר החשיפה ציאניד, לרכוש NADPH ו FAD תמונות של התאים כפי שתואר קודם לכן. המחקר חישב את הפרמטרים של אורך החיים של הפלואורסצנטיות באמצעות פונקציית התגובה הנמדדת של המכשיר, או IRF, מאוריאה.הפרמטרים היו בממוצע על פני הפיקסלים של הציטופלסמה של כל תא המשמש לפילוח. תאים בודדים זוהו והוסוו מסכות כדי למנוע רעשי רקע. לאחר מכן, הגרעין זוהה והוקרן על מסכת התא.כמו כן, התאים סוננו כדי להסיר את האזורים עם המסיכה שאינם מתאימים לגודל של תאים טיפוסיים. הדמיית חיי הפלואורסצנטיות הרב-פוטונית של NADPH ו- FAD אפשרה הדמיה של מורפולוגיה של תאים וחילוף חומרים לפני ואחרי טיפול ציאניד. זה נצפתה כי חיים NADPH פוחתת עם טיפול ציאניד, בעוד החיים FAD עולה לאחר טיפול ציאניד.תרשים התיבה הייצוגית הצביע על כך שיחס ה- redox האופטי של תאי MCF7 ירד לאחר טיפול ציאניד. החשיפה ציאניד הפחיתה את אורך החיים NADPH משוקלל משרעת של תאי MCF7. אורך החיים הקצר והארוך ירד עבור NADPH, אבל גדל עבור NADPH אלפא אחד.עבור FAD, אורך החיים משוקלל משרעת של תאי MCF7 גדל לאחר חשיפה ציאניד. הן אורך החיים הקצר והארוך גדל עבור FAD, אך ירד עבור FAD אלפא אחד. חשוב שיהיה מספיק כוח לייזר הולך לדגימות, אבל לזכור, יותר מדי כוח יכול לגרום נזק לתאים.מכיוון שהדמיה אוטופלואורסצנטית אינה מזיקה לתאים, ניתן להשתמש בבדיקות ביוכימיות עוקבות באותן דגימות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...