Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
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Le fonti di finanziamento includono il Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) e la Texas A & M University. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

1. Placcatura cellulare per l'imaging
<ol><li>Aspirare il mezzo da un pallone T-75 confluente all'80-90% di cellule MCF-7, sciacquare le cellule con 10 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,25% (1x) per staccare le cellule dal fondo del pallone.</li>
	<li>Incubare il matraccio a 37 °C per ~4 min. Controllare le cellule al microscopio per confermare il distacco.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 8 ml di terreno di coltura per disattivare la tr...

L'intensità di autofluorescenza e l'imaging a vita sono stati ampiamente utilizzati per valutare il metabolismo nelle cellule21,55. FLIM è ad alta risoluzione e quindi risolve singole cellule, che è importante per gli studi sul cancro perché l'eterogeneità cellulare contribuisce all'aggressività tumorale e alla resistenza ai farmaci7,39,41,44,45,46,58.<s...

Il metabolismo è il processo cellulare di produzione di energia. Il metabolismo cellulare comprende più vie, tra cui glicolisi, fosforilazione ossidativa e glutaminolisi. Le cellule sane utilizzano queste vie metaboliche per generare energia per la proliferazione e la funzione, come la produzione di citochine da parte delle cellule immunitarie. Molte malattie, tra cui i disturbi metabolici, il cancro e la neurodegenerazione, sono caratterizzate da un metabolismo cellulare alterato1. Ad esempio, alcuni tipi di cellule tumorali hanno tassi elevati di glicolisi, anche in presenza di ossigeno, per generare molecole per la sintesi di acidi nucleici, proteine e lipidi2,3. Questo fenomeno, noto come effetto Warburg, è un segno distintivo di molti tipi di cancro, tra cui il cancro al seno, il cancro ai polmoni e i glioblastomi4. A causa delle alterazioni del metabolismo cellulare associate alla progressione del cancro, il metabolismo cellulare può essere un biomarcatore surrogato per la risposta ai farmaci5,6. Inoltre, comprendere l'efficacia del farmaco a livello cellulare è fondamentale in quanto l'eterogeneità cellulare può portare a diverse risposte farmacologiche negli individui7,8.
Le tecnologie che identificano e quantificano i cambiamenti nel metabolismo cellulare sono essenziali per gli studi sul cancro e sulla risposta ai farmaci. Le analisi chimiche e proteiche vengono utilizzate per valutare il metabolismo delle cellule o dei tessuti, ma mancano di risoluzione unicellulare e di informazioni spaziali. I saggi basati sul lettore di piastre metaboliche possono misurare il pH e il consumo di ossigeno nel campione nel tempo e la successiva perturbazione metabolica da parte di sostanze chimiche. Il pH può essere utilizzato per calcolare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che fornisce una panoramica dell'attività glicolitica delle cellule9. I metodi di imaging di tutto il corpo, tra cui la tomografia a emissione di positroni fluoro-D-glucosio 2-[fluoro-18] (FDG PET) e la spettroscopia di risonanza magnetica (MRS), sono modalità di imaging non invasive utilizzate clinicamente per identificare la recidiva del tumore e l'efficacia del farmaco attraverso misurazioni metaboliche10,11,12,13,14.
FDG-PET visualizza l'assorbimento tissutale di FDG, un analogo del glucosio radiomarcato. L'aumento dell'assorbimento di FDG-PET da parte dei tumori rispetto al tessuto circostante è dovuto all'effetto Warburg12,13. MRS visualizza nuclei comuni di molecole utilizzate per il metabolismo, come 13C e 31P, e può ottenere informazioni dinamiche su come il metabolismo cambia in risposta a stimoli, come l'esercizio fisico o il mangiare14. Sebbene FDG-PET e MRS possano essere utilizzati clinicamente, queste tecnologie mancano della risoluzione spaziale per risolvere l'eterogeneità intratumorale. Allo stesso modo, le misurazioni del consumo di ossigeno vengono effettuate su una popolazione di massa di cellule. L'imaging a autofluorescenza supera l'ostacolo della risoluzione spaziale di queste tecnologie e fornisce un metodo non invasivo per quantificare il metabolismo cellulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Figura 1: NADH e FAD nelle vie metaboliche comuni. NADH e FAD sono coenzimi utilizzati nella glicolisi, nel ciclo di Krebs e nella catena di trasporto degli elettroni. L'imaging a autofluorescenza di queste molecole fornisce informazioni sul metabolismo cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La nicotinamide adenina (fosfato) dinucleotide (NAD(P)H) e la flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD) sono coenzimi delle reazioni metaboliche, tra cui glicolisi, fosforilazione ossidativa e glutaminolisi (Figura 1). Sia NAD(P)H che FAD sono autofluorescenti e forniscono un contrasto endogeno per l'imaging a fluorescenza1,15. NADPH ha proprietà fluorescenti simili a NADH. Per questo motivo, NAD(P)H è spesso usato per rappresentare il segnale combinato di NADH e NADPH2,16.
L'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) quantifica la durata della fluorescenza o il tempo per il quale un fluoroforo è nello stato eccitato. Le durate di fluorescenza rispondono al microambiente dei fluorofori e forniscono informazioni sul metabolismo cellulare17. NAD(P)H e FAD possono esistere all'interno delle cellule in conformazioni legate a proteine o libere, ognuna delle quali ha una vita diversa. Il NAD(P)H libero ha una vita più breve rispetto al NAD(P)H legato alle proteine; al contrario, la FAD libera ha una durata maggiore rispetto alla FAD18,19 legata. Le durate e i pesi dei componenti a vita possono essere quantificati dai dati di decadimento della durata della fluorescenza tramite Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) rappresenta l'intensità di fluorescenza normalizzata in funzione del tempo. Le α 1 e α 2 in questa equazione rappresentano le componenti proporzionali di vita breve e lunga (α 1+ α 2=1), rispettivamente, τ1 e τ2 rappresentano rispettivamente la vita breve e lunga, e C rappresenta la luce di fondo7,20. La durata ponderata in ampiezza, qui rappresentata come τm, è calcolata utilizzando Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Una vita media può essere calcolata facendo la media di "t" sul decadimento di intensità del fluoroforo, che per un decadimento bieculente è mostrato da Eq. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Un'immagine di intensità di fluorescenza può essere calcolata dall'immagine a vita integrando il decadimento della durata della fluorescenza. L'imaging a autofluorescenza è un metodo non distruttivo e privo di etichette che può essere utilizzato per caratterizzare il metabolismo delle cellule vive a una risoluzione subcellulare. Il rapporto redox ottico fornisce una metrica analogica ottica dello stato redox chimico della cellula ed è calcolato come il rapporto tra le intensità NAD(P)H e FAD. Sebbene la formula per il calcolo del rapporto redox ottico non sia standardizzata22,23,24,25, è qui definita come l'intensità di FAD sulle intensità combinate di NAD(P)H e FAD. Questa definizione viene utilizzata perché l'intensità sommata nel denominatore normalizza la metrica tra 0 e 1 e il risultato atteso dell'inibizione del cianuro è una diminuzione del rapporto redox. Le durate di fluorescenza di NAD(P)H e FAD liberi forniscono informazioni sui cambiamenti nel microambiente del solvente metabolico, tra cui pH, temperatura, vicinanza all'ossigeno e osmolarità17.
I cambiamenti nella durata di fluorescenza delle frazioni legate di NAD(P)H e FAD possono indicare l'utilizzo della via metabolica e il metabolismo specifico del substrato26. I pesi dei componenti possono essere interpretati per cambiamenti nella frazione libera al legato dei coenzimi18,19. Complessivamente, queste metriche quantitative di durata dell'autofluorescenza consentono l'analisi del metabolismo cellulare e l'imaging ad autofluorescenza è stato utilizzato per identificare neoplasie da tessuti normali27,28, caratterizzare le cellule staminali29,30, valutare la funzione delle cellule immunitarie31,32,33,34,35, misurare l'attività neurologica36, 37,38 e comprensione dell'efficacia dei farmaci in tipi di cancro come il cancro al seno e il cancro della testa e del collo21,39,40,41,42. L'imaging ad autofluorescenza ad alta risoluzione può essere combinato con la segmentazione dell'immagine per l'analisi di singole cellule e la quantificazione dell'eterogeneità intrapopolazione43,44,45,46,47.
NAD(P)H e FAD possono essere ripresi su microscopi a fluorescenza a fotone singolo o multifotone configurati per l'imaging di intensità o durata. Per i microscopi a singolo fotone, NAD(P)H e FAD sono tipicamente eccitati a lunghezze d'onda di 375-405 nm e 488 nm, rispettivamente, a causa di sorgenti laser comuni a queste lunghezze d'onda48. Nell'eccitazione a fluorescenza a due fotoni, NAD(P)H e FAD ecciteranno a lunghezze d'onda di circa 700-750 nm e da 700 a 900 nm, rispettivamente15,49. Una volta che i fluorofori sono eccitati, NAD(P)H e FAD emettono fotoni a lunghezze d'onda comprese tra ~ 410 nm a ~ 490 nm e ~ 510 nm a ~ 640 nm, rispettivamente15. Le lunghezze d'onda massime di emissione NAD(P)H e FAD sono rispettivamente di circa 450 nm e 535 nm48.
A causa delle loro diverse lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, la fluorescenza dei due coenzimi metabolici può essere isolata spettralmente. Una comprensione delle caratteristiche spettrali di NAD(P)H e FAD è necessaria per la progettazione e l'ottimizzazione dei protocolli di imaging ad autofluorescenza. Il cianuro è un inibitore iv del complesso della catena di trasporto degli elettroni (ETC). Gli effetti del cianuro sul metabolismo cellulare e le intensità di autofluorescenza e la durata di vita di NAD(P)H e FAD all'interno delle cellule sono ben caratterizzati27,40. Pertanto, un esperimento di perturbazione al cianuro è un mezzo efficace per convalidare i protocolli di imaging NAD(P)H e FAD. Un esperimento di cianuro di successo fornisce la certezza che il protocollo di imaging NAD(P)H e FAD può essere utilizzato per valutare il metabolismo di gruppi sconosciuti o perturbazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

Il metabolismo cellulare è il processo attraverso il quale le cellule generano energia e molte malattie, incluso il cancro, sono caratterizzate da un metabolismo anormale. Nicotinamide adenina (fosfato) dinucleotide (NAD(P)H) ridotta e flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD) sono coenzimi delle reazioni metaboliche. NAD(P)H e FAD mostrano autofluorescenza e possono essere isolati spettralmente da lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Entrambi i coenzimi, NAD(P)H e FAD, possono esistere in una configurazione libera o legata alle proteine, ognuno dei quali ha una durata di fluorescenza distinta, il tempo per il quale il fluoroforo rimane nello stato eccitato. L'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) consente di quantificare l'intensità di fluorescenza e la durata di NAD(P)H e FAD per l'analisi senza etichetta del metabolismo cellulare. I microscopi a intensità di fluorescenza e durata possono essere ottimizzati per l'imaging di NAD(P)H e FAD selezionando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate. Le perturbazioni metaboliche da parte del cianuro verificano i protocolli di imaging ad autofluorescenza per rilevare i cambiamenti metabolici all'interno delle cellule. Questo articolo dimostrerà la tecnica di imaging ad autofluorescenza di NAD(P)H e FAD per misurare il metabolismo cellulare.

La linea cellulare epiteliale del cancro al seno, MCF-7, è stata coltivata in DMEM integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Per l'imaging a fluorescenza, le cellule sono state seminate a una densità di 4 × 105 cellule per piatto di imaging con fondo di vetro da 35 mm 48 ore prima dell'imaging. Le cellule sono state fotografate prima e dopo il trattamento con cianuro utilizzando i protocolli sopra indicati. L'obiettivo dell'esperimento al cianuro è confermare l'...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH e FAD sono molecole endogene che mostrano autofluorescenza a diverse lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. A causa del loro uso come coenzimi delle reazioni metaboliche, la microscopia a autofluorescenza può valutare il metabolismo cellulare. L'imaging a autofluorescenza di NADH e FAD non richiede etichette esogene ed è un metodo non distruttivo con risoluzione subcellulare.La microscopia a autofluorescenza può essere utilizzata su campioni vivi e per studi di corsi temporali. L'imaging autofluorescente può essere ampiamente applicato a qualsiasi cellula o tessuto vivente. L'imaging autofluorescente è stato utilizzato su neuroni, cellule tumorali, tumori, in vivo, cellule staminali e cellule immunitarie.A dimostrare la procedura sarà Linghao Hu, uno studente laureato del Quantitative Optical Imaging Laboratory della Texas A & M University. Inizia l'esperimento accendendo tutti i componenti del microscopio a vita a fluorescenza multifotone, compresa la sorgente laser e i rivelatori. Prima del posizionamento del campione, accendere la lampada a campo luminoso e assicurarsi che la luce entri nell'oculare.Quindi, scegli un obiettivo per l'imaging cellulare. Se non si utilizza un obiettivo aereo, applicare una goccia del mezzo di immersione appropriato sopra l'obiettivo. Posizionare la parabola con fondo di vetro sul portacampioni sul palco del microscopio.Quindi, centrare il campione con l'obiettivo utilizzando il controllo dello stadio X/Y Assicurarsi che il campione sia fissato e non si muova durante l'imaging. Una volta fatto, guarda nell'oculare e sposta l'obiettivo verso l'alto per mettere a fuoco le cellule. Se il microscopio si trova all'interno di un involucro, chiudere lo sportello della scatola luminosa.Quindi, aprire il software di acquisizione delle immagini e fare clic sulla scheda Imaging multi-fotone per impostare i parametri di imaging multi-fotone come descritto nel manoscritto. Regolare il guadagno del rilevatore al valore ottimale per l'imaging a fluorescenza o FILM. Quindi, modificare il tempo di permanenza della spesa laser a ciascun pixel del campione al valore desiderato.Per la nicotinamide adenina fosfato dinucleotide, o NADPH, impostare il laser multi-fotone a 750 nanometri. Quindi, verificare che il controllo di potenza per il laser sia impostato su zero in modo che le celle non vengano danneggiate all'apertura dell'otturatore sul laser. Impostare un filtro di emissione a 400-500 nanometri.Quando i parametri sono impostati, iniziare a visualizzare le immagini in modo da mettere a fuoco o live-view per ottimizzare le impostazioni dell'immagine. Aumentare lentamente la potenza del laser da tre a otto milliwatt assicurandosi che le celle siano a fuoco. Una volta regolato, registra la potenza massima utilizzata.Utilizzare l'impostazione di potenza massima registrata per l'imaging su altri segmenti della capsula di Petri. Raccogli un'immagine NADPH-FILM con un tempo di integrazione dell'immagine di 60 secondi e controlla che l'immagine abbia un numero sufficiente di fotoni, come un picco di 100 fotoni per un pixel del citoplasma all'interno della curva di decadimento della durata della fluorescenza. Se il numero di fotoni è troppo basso, aumentare la potenza del laser o la durata dell'acquisizione dell'immagine.Per l'imaging flavin adenina dinucleotide, o FAD, impostare il laser multi-fotone su 890 nanometri e attendere che il laser si blocchi in modalità alla nuova lunghezza d'onda. Assicurarsi che il controllo di potenza per il laser sia inizialmente impostato su zero. Impostare un filtro di emissione a 500-600 nanometri.Per ottimizzare le impostazioni dell'immagine, iniziare a visualizzare le immagini in modo focalizzato o live-view aumentando la potenza del laser da 5 a 10 milliwatt e registrando la potenza massima utilizzata. Utilizzare la stessa impostazione di alimentazione per l'imaging FAD dei campi visivi successivi. Raccogli l'immagine FAD-FILM con un tempo di integrazione dell'immagine di 60 secondi e controlla che l'immagine abbia fotoni sufficienti all'interno della curva di decadimento della durata della fluorescenza.Se il numero di fotoni è troppo basso, aumentare la potenza del laser o la durata dell'acquisizione dell'immagine e ripetere l'imaging per altri quattro o cinque campi visivi, o FOV, con ogni immagine distanziata a due FOV di distanza. Per produrre una soluzione di cianuro di sodio 80 millimolare, sciogliere 130,24 milligrammi di cianuro di sodio in 25 millilitri di PBS. Dal piatto di coltura, aspirare 100 microlitri di terreno di coltura da sostituire con 100 microlitri di soluzione di cianuro di sodio per ottenere una concentrazione di quattro millimolari di cianuro nel piatto.Mettere le cellule in un'incubatrice per cinque minuti per consentire alle cellule di reagire con la soluzione di cianuro. Dopo l'esposizione al cianuro, acquisire immagini NADPH e FAD delle cellule come descritto in precedenza. Lo studio ha calcolato i parametri di durata della fluorescenza utilizzando la funzione di risposta dello strumento misurato, o IRF, dall'urea.I parametri sono stati mediati attraverso i pixel del citoplasma di ciascuna cellula utilizzata per la segmentazione. Le singole cellule sono state identificate e mascherate per eliminare il rumore di fondo. Quindi, il nucleo è stato identificato e proiettato sulla maschera cellulare.Inoltre, le cellule sono state filtrate per rimuovere le aree mascherate che non si adattano alle dimensioni delle cellule tipiche. L'imaging a vita a fluorescenza multi-fotone di NADPH e FAD ha permesso la visualizzazione della morfologia cellulare e del metabolismo prima e dopo il trattamento con cianuro. È stato osservato che la durata del NADPH diminuisce con il trattamento con cianuro, mentre la durata della FAD aumenta dopo il trattamento con cianuro.Il box plot rappresentativo ha indicato che il rapporto redox ottico delle cellule MCF7 è diminuito dopo il trattamento con cianuro. L'esposizione al cianuro ha ridotto la durata di vita NADPH ponderata in ampiezza delle cellule MCF7. La vita breve e lunga è diminuita per NADPH, ma è aumentata per NADPH alfa uno.Per fad, la durata ponderata in ampiezza delle cellule MCF7 è aumentata dopo l'esposizione al cianuro. Sia la breve che la lunga durata sono aumentate per FAD, ma sono diminuite per FAD alfa uno. È importante avere abbastanza potenza laser che va ai campioni, ma ricorda, troppa potenza può causare danni alle cellule.Poiché l'imaging ad autofluorescenza non è dannoso per le cellule, i successivi saggi biochimici possono essere utilizzati sugli stessi campioni.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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