Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
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Las fuentes de financiamiento incluyen el Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT RP200668) y la Universidad de Texas A&M. La Figura 1 se creó con BioRender.com.

1. Revestimiento celular para imágenes
<ol><li>Aspire el medio a partir de un matraz T-75 confluente al 80-90% de células MCF-7, enjuague las células con 10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y agregue 2 ml de tripsina al 0,25% (1x) para separar las células del fondo del matraz.</li>
	<li>Incubar el matraz a 37 °C durante ~4 min. Revise las células bajo el microscopio para confirmar el desprendimiento.</li>
	<li>Agregue inmediatamente 8 ml de medio de cultivo para desacti...

La intensidad de la autofluorescencia y las imágenes de por vida han sido ampliamente utilizadas para evaluar el metabolismo en las células21,55. FLIM es de alta resolución y, por lo tanto, resuelve células individuales, lo cual es importante para los estudios de cáncer porque la heterogeneidad celular contribuye a la agresión tumoral y la resistencia a los medicamentos7,39,41,44,45,46,58.</sup...

El metabolismo es el proceso celular de producción de energía. El metabolismo celular abarca múltiples vías, incluyendo la glucólisis, la fosforilación oxidativa y la glutaminólisis. Las células sanas utilizan estas vías metabólicas para generar energía para la proliferación y la función, como la producción de citoquinas por las células inmunes. Muchas enfermedades, incluyendo trastornos metabólicos, cáncer y neurodegeneración, se caracterizan por un metabolismo celular alterado1. Por ejemplo, algunos tipos de células cancerosas tienen tasas elevadas de glucólisis, incluso en presencia de oxígeno, para generar moléculas para la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos2,3. Este fenómeno, conocido como el efecto Warburg, es un sello distintivo de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama, el cáncer de pulmón y los glioblastomas4. Debido a las alteraciones del metabolismo celular asociadas a la progresión del cáncer, el metabolismo celular puede ser un biomarcador sustituto de la respuesta farmacológica5,6. Además, la comprensión de la eficacia del fármaco a nivel celular es crucial, ya que la heterogeneidad celular puede conducir a diferentes respuestas farmacológicas en los individuos7,8.
Las tecnologías que identifican y cuantifican los cambios en el metabolismo celular son esenciales para los estudios del cáncer y la respuesta a los medicamentos. Los análisis químicos y de proteínas se utilizan para evaluar el metabolismo de las células o tejidos, pero carecen de resolución unicelular e información espacial. Los ensayos basados en lectores de placas metabólicas pueden medir el pH y el consumo de oxígeno en la muestra a lo largo del tiempo y la posterior perturbación metabólica por productos químicos. El pH se puede utilizar para calcular la tasa de acidificación extracelular (ECAR), lo que proporciona una visión de la actividad glucolítica de las células9. Los métodos de imágenes de todo el cuerpo, incluida la tomografía por emisión de positrones fluorados-D-glucosa 2-[flúor-18] (FDG PET) y la espectroscopia de resonancia magnética (MRS), son modalidades de imágenes no invasivas utilizadas clínicamente para identificar la recurrencia tumoral y la eficacia del fármaco a través de mediciones metabólicas10,11,12,13,14.
FDG-PET toma imágenes de la captación tisular de FDG, un análogo de glucosa radiomarcado. El aumento de la captación de FDG-PET por los tumores en relación con el tejido circundante se debe al efecto Warburg12,13. MRS toma imágenes de núcleos comunes de moléculas utilizadas para el metabolismo, como 13C y 31P, y puede obtener información dinámica sobre cómo cambia el metabolismo en respuesta a estímulos, como el ejercicio o la alimentación14. Aunque FDG-PET y MRS se pueden usar clínicamente, estas tecnologías carecen de la resolución espacial para resolver la heterogeneidad intratumoral. Del mismo modo, las mediciones de consumo de oxígeno se realizan en una población masiva de células. Las imágenes de autofluorescencia superan el obstáculo de resolución espacial de estas tecnologías y proporcionan un método no invasivo para cuantificar el metabolismo celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Figura 1: NADH y FAD en vías metabólicas comunes. NADH y FAD son coenzimas utilizadas en la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones. Las imágenes de autofluorescencia de estas moléculas proporcionan información sobre el metabolismo celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La nicotinamida reducida adenina (fosfato) dinucleótido (NAD(P)H) y el dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD) son coenzimas de reacciones metabólicas, incluyendo glucólisis, fosforilación oxidativa y glutaminólisis (Figura 1). Tanto EL NAD(P)H como el FAD son autofluorescentes y proporcionan contraste endógeno para la obtención de imágenes de fluorescencia1,15. NADPH tiene propiedades fluorescentes similares a NADH. Debido a esto, NAD(P)H se utiliza a menudo para representar la señal combinada de NADH y NADPH2,16.
Las imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) cuantifican la vida útil de la fluorescencia o el tiempo durante el cual un fluoróforo está en estado excitado. Las vidas útiles de fluorescencia responden al microambiente de los fluoróforos y proporcionan información sobre el metabolismo celular17. NAD(P)H y FAD pueden existir dentro de las células en conformaciones unidas a proteínas o libres, cada una de las cuales tiene una vida útil diferente. El NAD(P)H libre tiene una vida útil más corta que el NAD(P)H unido a proteínas; por el contrario, el FAD libre tiene una vida útil más larga que el FAD18,19 enlazado. Las vidas útiles y los pesos de los componentes de por vida se pueden cuantificar a partir de los datos de desintegración de la vida útil de la fluorescencia a través de Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) representa la intensidad de fluorescencia normalizada en función del tiempo. Las α 1 y α 2 en esta ecuación representan los componentes proporcionales de vidas cortas y largas (α 1+ α 2=1), respectivamente, τ1 y τ2 representan las vidas cortas y largas, respectivamente, y C representa la luz de fondo7,20. La vida útil ponderada por amplitud, representada aquí como τm, se calcula utilizando Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Una vida media se puede calcular promediando "t" sobre la desintegración de intensidad del fluoróforo, que para una desintegración dos exponenciales se muestra por Eq. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Una imagen de intensidad de fluorescencia se puede calcular a partir de la imagen de por vida integrando la desintegración de la vida útil de fluorescencia. Las imágenes de autofluorescencia son un método no destructivo y libre de etiquetas que se puede utilizar para caracterizar el metabolismo de las células vivas a una resolución subcelular. La relación redox óptica proporciona una métrica analógica óptica del estado redox químico de la célula y se calcula como la relación de intensidades NAD(P)H y FAD. Aunque la fórmula para calcular la relación redox óptica no está estandarizada22,23,24,25, se define aquí como la intensidad de FAD sobre las intensidades combinadas de NAD(P)H y FAD. Esta definición se utiliza porque la intensidad sumada en el denominador normaliza la métrica entre 0 y 1, y el resultado esperado de la inhibición del cianuro es una disminución en la relación redox. Las vidas de fluorescencia de NAD(P)H libre y FAD proporcionan información sobre los cambios en el microambiente del disolvente metabólico, incluido el pH, la temperatura, la proximidad al oxígeno y la osmolaridad17.
Los cambios en la vida útil de fluorescencia de las fracciones unidas de NAD(P)H y FAD pueden indicar la utilización de la vía metabólica y el metabolismo específico del sustrato26. Los pesos de los componentes pueden interpretarse para los cambios en la fracción libre a la fracción unida de las coenzimas18,19. En conjunto, estas métricas cuantitativas de la vida útil de la autofluorescencia permiten el análisis del metabolismo celular, y la imagen de autofluorescencia se ha utilizado para identificar neoplasias de tejidos normales27,28, caracterizar células madre29,30, evaluar la función de las células inmunes31,32,33,34,35, medir la actividad neurológica36, 37,38, y comprender la eficacia de los medicamentos en tipos de cáncer como el cáncer de mama y el cáncer de cabeza y cuello21,39,40,41,42. Las imágenes de autofluorescencia de alta resolución se pueden combinar con la segmentación de imágenes para el análisis unicelular y la cuantificación de la heterogeneidad intrapoblacional43,44,45,46,47.
NAD(P)H y FAD se pueden obtener imágenes en microscopios de fluorescencia de fotón único o multifotón configurados para imágenes de intensidad o de por vida. Para los microscopios de fotón único, NAD(P)H y FAD se excitan típicamente en longitudes de onda de 375-405 nm y 488 nm, respectivamente, debido a fuentes láser comunes en estas longitudes de onda48. En la excitación de fluorescencia de dos fotones, NAD(P)H y FAD excitarán a longitudes de onda de aproximadamente 700 a 750 nm y 700 a 900 nm, respectivamente15,49. Una vez que los fluoróforos se excitan, NAD(P)H y FAD emiten fotones en longitudes de onda entre ~410 nm a ~490 nm y ~510 nm a ~640 nm, respectivamente15. Las longitudes de onda máximas de emisión NAD(P)H y FAD son de aproximadamente 450 nm y 535 nm, respectivamente48.
Debido a sus diferentes longitudes de onda de excitación y emisión, la fluorescencia de las dos coenzimas metabólicas puede aislarse espectralmente. Una comprensión de las características espectrales de NAD(P)H y FAD es necesaria para el diseño y la optimización de los protocolos de imágenes de autofluorescencia. El cianuro es un inhibidor del complejo IV de la cadena de transporte de electrones (ETC). Los efectos del cianuro sobre el metabolismo celular y las intensidades de autofluorescencia y la vida útil de NAD(P)H y FAD dentro de las células están bien caracterizados27,40. Por lo tanto, un experimento de perturbación de cianuro es un medio eficaz para validar los protocolos de imágenes NAD(P)H y FAD. Un experimento exitoso de cianuro proporciona confianza en que el protocolo de imágenes NAD(P)H y FAD se puede utilizar para evaluar el metabolismo de grupos o perturbaciones desconocidas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

El metabolismo celular es el proceso por el cual las células generan energía, y muchas enfermedades, incluido el cáncer, se caracterizan por un metabolismo anormal. La nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y el dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD) son coenzimas de reacciones metabólicas. NAD(P)H y FAD exhiben autofluorescencia y pueden aislarse espectralmente por excitación y longitudes de onda de emisión. Ambas coenzimas, NAD(P)H y FAD, pueden existir en una configuración libre o unida a proteínas, cada una de las cuales tiene una vida útil de fluorescencia distinta, el tiempo durante el cual el fluoróforo permanece en el estado excitado. Las imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) permiten cuantificar la intensidad de fluorescencia y la vida útil de NAD(P)H y FAD para el análisis sin etiquetas del metabolismo celular. La intensidad de fluorescencia y los microscopios de por vida se pueden optimizar para obtener imágenes de NAD(P)H y FAD seleccionando las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas. Las perturbaciones metabólicas por cianuro verifican los protocolos de imágenes de autofluorescencia para detectar cambios metabólicos dentro de las células. Este artículo demostrará la técnica de imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD para medir el metabolismo celular.

La línea celular epitelial de cáncer de mama, MCF-7, se cultivó en DMEM suplementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Para las imágenes de fluorescencia, las células se sembraron a una densidad de 4 × 105 células por plato de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm 48 h antes de la toma de imágenes. Las células fueron fotografiadas antes y después del tratamiento con cianuro utilizando los protocolos mencionados anteriormente. El objetivo del experimento con cianu...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH y FAD son moléculas endógenas que exhiben autofluorescencia en diferentes longitudes de onda de excitación y emisión. Debido a su uso como coenzimas de reacciones metabólicas, la microscopía de autofluorescencia puede evaluar el metabolismo celular. Las imágenes de autofluorescencia de NADH y FAD no requieren etiquetas exógenas y es un método no destructivo con resolución subcelular.La microscopía de autofluorescencia se puede utilizar en muestras vivas y para estudios de cursos de tiempo. Las imágenes autofluorescentes se pueden aplicar ampliamente a cualquier célula o tejido vivo. Las imágenes autofluorescentes se han utilizado en neuronas, células cancerosas, tumores, in vivo, células madre y células inmunes.Demostrando el procedimiento estará Linghao Hu, un estudiante graduado del Laboratorio de Imágenes Ópticas Cuantitativas de la Universidad de Texas A&M. Comience el experimento encendiendo todos los componentes del microscopio de fluorescencia multifotón de por vida, incluida la fuente láser y los detectores. Antes de colocar la muestra, encienda la lámpara de campo brillante y asegúrese de que la luz entre en el ocular.Luego, elija un objetivo para la imagen celular. Si no utiliza un objetivo de aire, aplique una gota del medio de inmersión apropiado sobre el objetivo. Coloque el plato con fondo de vidrio en el soporte de la muestra en el escenario del microscopio.Luego, centre la muestra con el objetivo utilizando el control de etapa X / Y Asegúrese de que la muestra esté asegurada y no se mueva durante la toma de imágenes. Una vez hecho esto, mire dentro del ocular y mueva el objetivo hacia arriba para enfocarse en las células. Si el microscopio está dentro de un recinto, cierre la puerta de la caja de luz.A continuación, abra el software de adquisición de imágenes y haga clic en la pestaña Imágenes de fotones múltiples para establecer los parámetros de imágenes de fotones múltiples como se describe en el manuscrito. Ajuste la ganancia del detector al valor óptimo para la imagen de fluorescencia de por vida, o FILM. Luego, cambie el tiempo de permanencia del láser que pasa en cada píxel de la muestra al valor deseado.Para nicotinamida adenina fosfato dinucleótido, o NADPH, ajuste el láser multifotón a 750 nanómetros. Luego, confirme que el control de potencia para el láser esté configurado en cero para que las celdas no se dañen al abrir el obturador en el láser. Establezca un filtro de emisión a 400 a 500 nanómetros.Cuando se establezcan los parámetros, comience a crear imágenes de manera enfocada o de visualización en vivo para optimizar la configuración de la imagen. Aumente lentamente la potencia del láser de tres a ocho milivatios mientras se asegura de que las células estén enfocadas. Una vez ajustado, registre la potencia máxima utilizada.Utilice el ajuste de potencia máxima grabada para la toma de imágenes en otros segmentos de la placa de Petri. Recopile una imagen NADPH-FILM con un tiempo de integración de imagen de 60 segundos y compruebe que la imagen tiene un número suficiente de fotones, como un pico de 100 fotones para un píxel de citoplasma dentro de la curva de desintegración de la vida útil de la fluorescencia. Si el número de fotones es demasiado bajo, aumente la potencia del láser o la duración de la adquisición de la imagen.Para la imagen de dinucleótido de flavina adenina, o FAD, configure el láser multifotón a 890 nanómetros y espere a que el láser se bloquee en modo en la nueva longitud de onda. Asegúrese de que el control de potencia para el láser se ajuste a cero inicialmente. Establezca un filtro de emisión a 500 a 600 nanómetros.Para optimizar la configuración de la imagen, comience a crear imágenes de manera enfocada o de visualización en vivo aumentando la potencia del láser a 5 a 10 milivatios y registrando la potencia máxima utilizada. Utilice la misma configuración de energía para las imágenes FAD de los campos de visión posteriores. Recoja la imagen FAD-FILM con un tiempo de integración de imagen de 60 segundos y compruebe que la imagen tiene suficientes fotones dentro de la curva de desintegración de la vida útil de la fluorescencia.Si el número de fotones es demasiado bajo, aumente la potencia del láser o la duración de la adquisición de la imagen y repita la imagen para obtener de cuatro a cinco campos de visión adicionales, o FOV, con cada imagen espaciada a dos FOV de distancia. Para hacer una solución de cianuro de sodio 80 milimolar, disuelva 130.24 miligramos de cianuro de sodio en 25 mililitros de PBS. A partir del plato de cultivo, aspire 100 microlitros de medio de cultivo para reemplazar con 100 microlitros de solución de cianuro de sodio para obtener una concentración de cuatro milimolares de cianuro en el plato.Coloque las células en una incubadora durante cinco minutos para permitir que las células reaccionen con la solución de cianuro. Después de la exposición al cianuro, adquiera imágenes NADPH y FAD de las células como se describió anteriormente. El estudio calculó los parámetros de la vida útil de la fluorescencia utilizando la función de respuesta del instrumento medida, o IRF, a partir de urea.Los parámetros se promediaron a través de los píxeles del citoplasma de cada célula utilizada para la segmentación. Se identificaron células individuales y se enmascararon para eliminar el ruido de fondo. Luego, el núcleo fue identificado y proyectado sobre la máscara celular.Además, las células se filtraron para eliminar las áreas enmascaradas que no se ajustan al tamaño de las células típicas. Las imágenes de por vida de fluorescencia de múltiples fotones de NADPH y FAD permitieron la visualización de la morfología celular y el metabolismo antes y después del tratamiento con cianuro. Se observó que la vida útil de NADPH disminuye con el tratamiento con cianuro, mientras que la vida útil de FAD aumenta después del tratamiento con cianuro.El diagrama de caja representativo indicó que la relación redox óptica de las células MCF7 disminuyó después del tratamiento con cianuro. La exposición al cianuro disminuyó la vida útil de NADPH ponderada por amplitud de las células MCF7. Las vidas cortas y largas disminuyeron para NADPH, pero aumentaron para NADPH alfa uno.Para FAD, la vida útil ponderada por amplitud de las células MCF7 aumentó después de la exposición al cianuro. Tanto la vida corta como la larga aumentaron para FAD, pero disminuyeron para FAD alfa uno. Es importante tener suficiente potencia láser para las muestras, pero recuerde, demasiada potencia puede causar daño a las células.Debido a que las imágenes de autofluorescencia no dañan las células, se pueden usar ensayos bioquímicos posteriores en las mismas muestras.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

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Bioingeniería

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