Name: autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

Finansman kaynakları arasında Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT RP200668) ve Texas A & M Üniversitesi bulunmaktadır. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Görüntüleme için hücre kaplaması
<ol><li>Ortamı, MCF-7 hücrelerinin %80-90'lık bir T-75 şişesinden aspire edin, hücreleri 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın ve hücreleri şişe tabanından ayırmak için 2 mL% 0.25 tripsin (1x) ekleyin.</li>
	<li>Şişeyi ~ 4 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ayrılmayı onaylamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin.</li>
	<li>Tripsini devre dışı bırakmak için hemen 8 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>...

Otofloresan yoğunluğu ve ömür boyu görüntüleme, hücrelerdeki metabolizmayı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır21,55. FLIM yüksek çözünürlüktedir ve bu nedenle kanser çalışmaları için önemli olan tek hücreleri çözer, çünkü hücresel heterojenlik tümör saldırganlığına ve ilaç direncine katkıda bulunur7,39,41,44,45,46,58.</su...

Metabolizma, enerji üretmenin hücresel sürecidir. Hücresel metabolizma, glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve glutaminoliz dahil olmak üzere birçok yolu kapsar. Sağlıklı hücreler, bağışıklık hücreleri tarafından sitokinlerin üretimi gibi çoğalma ve işlev için enerji üretmek için bu metabolik yolları kullanır. Metabolik bozukluklar, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere birçok hastalık, değişmiş hücresel metabolizma ile karakterizedir1. Örneğin, bazı kanser hücresi tipleri, nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin sentezi için moleküller üretmek üzere oksijen varlığında bile glikoliz oranlarını yükseltmiştir2,3. Warburg etkisi olarak bilinen bu fenomen, meme kanseri, akciğer kanseri ve glioblastomlar dahil olmak üzere birçok kanser türünün ayırt edici özelliğidir4. Kanser progresyonu ile ilişkili hücresel metabolizmadaki değişiklikler nedeniyle, hücresel metabolizma ilaç yanıtı için vekil bir biyobelirteç olabilir5,6. Ayrıca, hücre heterojenliği bireylerde farklı ilaç yanıtlarına yol açabileceğinden, ilaç etkinliğini hücresel düzeyde anlamak çok önemlidir7,8.
Hücresel metabolizmadaki değişiklikleri tanımlayan ve ölçen teknolojiler, kanser ve ilaç yanıtı çalışmaları için gereklidir. Kimyasal ve protein analizleri, hücrelerin veya dokuların metabolizmasını değerlendirmek için kullanılır, ancak tek hücreli çözünürlük ve mekansal bilgiden yoksundur. Metabolik plaka okuyucu tabanlı testler, numunedeki pH ve oksijen tüketimini zaman içinde ve ardından kimyasallar tarafından metabolik bozulmayı ölçebilir. PH, hücrelerin glikolitik aktivitesi hakkında bir fikir veren hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) hesaplamak için kullanılabilir9. 2-[flor-18] floro-D-glukoz pozitron emisyon tomografisi (FDG PET) ve manyetik rezonans spektroskopisi (MRS) dahil olmak üzere tüm vücut görüntüleme yöntemleri, metabolik ölçümler yoluyla tümör nüksünü ve ilaç etkinliğini tanımlamak için klinik olarak kullanılan noninvaziv görüntüleme yöntemleridir10,11,12,13,14.
FDG-PET, RADYO-etiketli bir glikoz analoğu olan FDG'nin doku alımını görüntüler. Tümörler tarafından çevre dokuya göre FDG-PET alımının artması, Warburg etkisinden kaynaklanmaktadır12,13. MRS, 13C ve 31P gibi metabolizma için kullanılan moleküllerin ortak çekirdeklerini görüntüler ve metabolizmanın egzersiz veya yemek yeme gibi uyaranlara yanıt olarak nasıl değiştiği hakkında dinamik bilgiler elde edebilir14. FDG-PET ve MRS klinik olarak kullanılabilse de, bu teknolojiler intratümöral heterojenliği çözmek için uzamsal çözünürlükten yoksundur. Aynı şekilde, oksijen tüketimi ölçümleri büyük miktarda hücre popülasyonu üzerinde yapılır. Otofloresan görüntüleme, bu teknolojilerin mekansal çözünürlük engelinin üstesinden gelir ve hücresel metabolizmayı ölçmek için invaziv olmayan bir yöntem sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Şekil 1: Ortak metabolik yollarda NADH ve FAD. NADH ve FAD, glikoliz, Krebs döngüsü ve elektron taşıma zincirinde kullanılan koenzimlerdir. Bu moleküllerin otofloresan görüntülemesi hücresel metabolizma hakkında bilgi sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İndirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotid (FAD), glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve glutaminoliz dahil olmak üzere metabolik reaksiyonların koenzimleridir (Şekil 1). Hem NAD(P)H hem de FAD otofloresandır ve floresan görüntüleme için endojen kontrast sağlar1,15. NADPH, NADH'ye benzer floresan özelliklere sahiptir. Bu nedenle, NAD (P) H genellikle NADH ve NADPH2,16'nın birleşik sinyalini temsil etmek için kullanılır.
Floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM), floresan ömrünü veya bir floroforun uyarılmış durumda olduğu süreyi ölçer. Floresan ömürleri, floroforların mikro ortamına duyarlıdır ve hücresel metabolizma hakkında bilgi sağlar17. NAD (P) H ve FAD, her biri farklı bir ömre sahip olan proteine bağlı veya serbest konformasyonlardaki hücrelerde bulunabilir. Serbest NAD (P) H, proteine bağlı NAD (P) H'den daha kısa bir ömre sahiptir; tersine, serbest FAD, bağlı FAD18,19'dan daha uzun bir ömre sahiptir. Yaşam süreleri ve ömür boyu bileşen ağırlıkları, floresan ömür boyu bozunma verilerinden Ek. (1)20 aracılığıyla ölçülebilir:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1), zamanın bir fonksiyonu olarak normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu temsil eder. Bu denklemdeki α 1 ve α 2, sırasıyla kısa ve uzun ömürlerin orantılı bileşenlerini temsil eder (α 1+ α 2=1), τ1 ve τ2 sırasıyla kısa ve uzun ömürleri temsil eder ve C, arka plan ışığını7,20 oluşturur. Burada τm olarak temsil edilen genlik ağırlıklı yaşam süresi, Ek. (2) kullanılarak hesaplanır.
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Ortalama bir ömür, floroforun yoğunluk bozunumu üzerinde ortalama "t" ile hesaplanabilir, bu da iki üstel bir bozunma için Eq. (3) 17,21 ile gösterilir.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Bir floresan yoğunluğu görüntüsü, floresan ömür boyu bozunumu entegre edilerek ömür boyu görüntüden hesaplanabilir. Otofloresan görüntüleme, canlı hücrelerin metabolizmasını hücre altı çözünürlükte karakterize etmek için kullanılabilecek tahribatsız ve etiketsiz bir yöntemdir. Optik redoks oranı, hücrenin kimyasal redoks durumunun optik analog metriğini sağlar ve NAD (P) H ve FAD yoğunluklarının oranı olarak hesaplanır. Optik redoks oranının hesaplanması için formül standartlaştırılmamış olsa da22,23,24,25, burada NAD (P) H ve FAD'nin birleşik yoğunlukları üzerindeki FAD yoğunluğu olarak tanımlanmaktadır. Bu tanım kullanılır, çünkü paydadaki toplam yoğunluk metriği 0 ile 1 arasında normalleştirir ve siyanür inhibisyonunun beklenen sonucu redoks oranında bir azalmadır. Serbest NAD(P)H ve FAD'ın floresan ömürleri, pH, sıcaklık, oksijene yakınlık ve ozmolarite dahil olmak üzere metabolik çözücü mikro ortamındaki değişiklikler hakkında fikir verir17.
NAD(P)H ve FAD'nin bağlı fraksiyonlarının floresan ömründeki değişiklikler, metabolik yol kullanımını ve substrata özgü metabolizmayı gösterebilir26. Komponent ağırlıkları, koenzimlerin serbest ila bağlı fraksiyonundaki değişiklikler için yorumlanabilir18,19. Toplamda, bu kantitatif otofloresan yaşam boyu metrikleri hücresel metabolizmanın analizine izin verir ve otofloresan görüntüleme normal dokulardan neoplazmları tanımlamak27,28, kök hücreleri karakterize etmek29,30, bağışıklık hücresi fonksiyonunu değerlendirmek31,32,33,34,35, nörolojik aktiviteyi ölçmek için kullanılmıştır36, 37,38 ve meme kanseri ve baş boyun kanseri gibi kanser türlerinde ilaç etkinliğini anlamak21,39,40,41,42. Yüksek çözünürlüklü otofloresan görüntüleme, tek hücreli analiz ve popülasyon içi heterojenitenin nicelleştirilmesi için görüntü segmentasyonu ile birleştirilebilir43,44,45,46,47.
NAD (P) H ve FAD, yoğunluk veya ömür boyu görüntüleme için yapılandırılmış tek fotonlu veya çok fotonlu floresan mikroskoplarda görüntülenebilir. Tek fotonlu mikroskoplar için, NAD (P) H ve FAD, bu dalga boylarındaki ortak lazer kaynakları nedeniyle, sırasıyla 375-405 nm ve 488 nm dalga boylarında tipik olarak uyarılır48. İki fotonlu floresan uyarımında, NAD (P) H ve FAD sırasıyla yaklaşık 700 ila 750 nm ve 700 ila 900 nm dalga boylarında uyaracaktır, 15,49. Floroforlar uyarıldığında, NAD (P) H ve FAD sırasıyla ~ 410 nm ila ~ 490 nm ve ~ 510 nm ila ~ 640 nm arasındaki dalga boylarında fotonlar yayar15. NAD (P) H ve FAD maksimuma emisyon dalga boyları sırasıyla yaklaşık 450 nm ve 535 nm'dir48.
Farklı uyarma ve emisyon dalga boyları nedeniyle, iki metabolik koenzimin floresansı spektral olarak izole edilebilir. NAD(P)H ve FAD'ın spektral özelliklerinin anlaşılması, otofloresan görüntüleme protokollerinin tasarımı ve optimizasyonu için gereklidir. Siyanür bir elektron taşıma zinciri (ETC) kompleks IV inhibitörüdür. Siyanürün hücresel metabolizma üzerindeki etkileri ve hücrelerdeki NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan yoğunlukları ve ömürleri iyi karakterize edilmiştir27,40. Bu nedenle, bir siyanür pertürbasyon deneyi, NAD (P) H ve FAD görüntüleme protokollerini doğrulamak için etkili bir araçtır. Başarılı bir siyanür deneyi, NAD (P) H ve FAD görüntüleme protokolünün bilinmeyen grupların veya bozulmaların metabolizmasını değerlendirmek için kullanılabileceğine dair güven sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

Hücresel metabolizma, hücrelerin enerji ürettiği süreçtir ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık anormal metabolizma ile karakterizedir. İndirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD(P)H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotid (FAD) metabolik reaksiyonların koenzimleridir. NAD (P) H ve FAD otofloresan sergiler ve uyarma ve emisyon dalga boyları ile spektral olarak izole edilebilir. Her iki koenzim, NAD (P) H ve FAD, her biri ayrı bir floresan ömrüne sahip olan serbest veya proteine bağlı bir konfigürasyonda bulunabilir - floroforun uyarılmış durumda kaldığı süre. Floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM), hücresel metabolizmanın etiketsiz analizi için NAD (P) H ve FAD'nin floresan yoğunluğunun ve ömürlerinin ölçülmesini sağlar. Floresan yoğunluğu ve ömür boyu mikroskoplar, uygun uyarma ve emisyon dalga boyları seçilerek NAD(P)H ve FAD'yi görüntülemek için optimize edilebilir. Siyanür ile metabolik pertürbasyonlar, hücrelerdeki metabolik değişiklikleri tespit etmek için otofloresan görüntüleme protokollerini doğrular. Bu makalede, hücresel metabolizmayı ölçmek için NAD (P) H ve FAD'nin otofloresan görüntüleme tekniği gösterilecektir.

Epitelyal meme kanseri hücre hattı MCF-7, DMEM'de %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenerek kültüre alındı. Floresan görüntüleme için, hücreler görüntülemeden 48 saat önce 35 mm cam tabanlı görüntüleme kabı başına 4 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlandı. Hücreler, yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak siyanür tedavisinden önce ve sonra görüntülendi. Siyanür deneyinin amacı, NAD (P) H ve FAD floresansının spektral izolasyonunu doğ...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH ve FAD, farklı uyarma ve emisyon dalga boylarında otofloresan sergileyen endojen moleküllerdir. Metabolik reaksiyonların ko-enzimleri olarak kullanılmaları nedeniyle, otofloresan mikroskobu hücresel metabolizmayı değerlendirebilir. NADH ve FAD'nin otofloresan görüntülemesi eksojen etiketler gerektirmez ve hücre altı çözünürlükte tahribatsız bir yöntemdir.Otofloresan mikroskopisi canlı örneklerde ve zaman kursu çalışmalarında kullanılabilir. Otofloresan görüntüleme, herhangi bir canlı hücreye veya dokuya geniş çapta uygulanabilir. Otofloresan görüntüleme nöron, kanser hücresi, tümör, in-vivo, kök hücre ve bağışıklık hücrelerinde kullanılmıştır.Prosedürü gösteren, Texas A & M Üniversitesi'ndeki Kantitatif Optik Görüntüleme Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi olan Linghao Hu olacak. Lazer kaynağı ve dedektörler de dahil olmak üzere çoklu foton floresan ömür boyu mikroskobunun tüm bileşenlerini açarak deneye başlayın. Numune yerleştirmeden önce, parlak alan lambasını açın ve ışığın göz merceğinin içine girdiğinden emin olun.Ardından, hücre görüntüleme için bir hedef seçin. Bir hava hedefi kullanmıyorsanız, hedefin üzerine uygun daldırma ortamından bir damla uygulayın. Cam tabanlı kabı mikroskop aşamasındaki numune tutucuya yerleştirin.Ardından, X/Y aşama kontrolünü kullanarak numuneyi hedefle ortalayın Numunenin güvenli olduğundan ve görüntüleme sırasında hareket etmeyeceğinden emin olun. İşiniz bittiğinde, göz merceğine bakın ve hücrelere odaklanmak için hedefi yukarı doğru hareket ettirin. Mikroskop bir mahfaza içindeyse, ışık kutusu kapağını kapatın.Ardından, görüntü alma yazılımını açın ve çoklu foton görüntüleme parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlamak için Çoklu Foton Görüntüleme sekmesine tıklayın. Dedektörün kazancını, floresan ömrü görüntüleme veya FILM için en uygun değere ayarlayın. Ardından, numunenin her pikselindeki lazer harcamasının bekleme süresini istenen değere değiştirin.Nikotinamid adenin fosfat dinükleotid veya NADPH için, çoklu foton lazeri 750 nanometreye ayarlayın. Ardından, lazerin güç kontrolünün sıfıra ayarlandığını onaylayın, böylece lazer üzerindeki deklanşör açıldığında hücreler zarar görmez. Bir emisyon filtresini 400 ila 500 nanometreye ayarlayın.Parametreler ayarlandığında, görüntü ayarlarını optimize etmek için odaklama veya canlı görüntü biçiminde görüntülemeye başlayın. Hücrelerin odaklandığından emin olurken lazer gücünü yavaşça üç ila sekiz miliwatt artırın. Ayarlandıktan sonra, kullanılan maksimum gücü kaydedin.Petri kabının diğer segmentlerinde görüntüleme için kaydedilen maksimum güç ayarını kullanın. Görüntü entegrasyon süresi 60 saniye olan bir NADPH-FILM görüntüsü toplayın ve görüntünün, floresan ömrü bozunma eğrisi içindeki bir sitoplazma pikseli için 100 fotonun zirvesi gibi yeterli sayıda fotona sahip olup olmadığını kontrol edin. Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın.Flavin adenin dinükleotid veya FAD, görüntüleme için, çoklu foton lazeri 890 nanometreye ayarlayın ve lazerin yeni dalga boyunda mod kilitlemesini bekleyin. Lazer için güç kontrolünün başlangıçta sıfıra ayarlandığından emin olun. Bir emisyon filtresini 500 ila 600 nanometre olarak ayarlayın.Görüntü ayarlarını optimize etmek için, lazer gücünü 5 ila 10 miliwatt'a çıkararak ve kullanılan maksimum gücü kaydederek odaklama veya canlı görüntü şeklinde görüntülemeye başlayın. Sonraki görüş alanlarının FAD görüntülemesi için aynı güç ayarını kullanın. FAD-FILM görüntüsünü 60 saniyelik bir görüntü entegrasyon süresiyle toplayın ve görüntünün floresan ömrü bozunma eğrisi içinde yeterli foton olup olmadığını kontrol edin.Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın ve görüntülemeyi, her görüntü iki FOV uzağında aralıklı olarak dört ila beş görüş alanı veya FOV için tekrarlayın. 80 milimolar sodyum siyanür çözeltisi yapmak için, 25 mililitre PBS içinde 130.24 miligram sodyum siyanür çözün. Kültür kabından, çanakta dört milimolar bir siyanür konsantrasyonu elde etmek için 100 mikrolitre sodyum siyanür çözeltisi ile değiştirmek üzere 100 mikrolitre kültür ortamını aspire edin.Hücrelerin siyanür çözeltisi ile reaksiyona girmesine izin vermek için hücreleri beş dakika boyunca bir inkübatöre koyun. Siyanür maruziyetinden sonra, daha önce açıklandığı gibi hücrelerin NADPH ve FAD görüntülerini elde edin. Çalışma, üreden ölçülen cihaz yanıt fonksiyonunu veya IRF'yi kullanarak floresan ömür boyu parametrelerini hesapladı.Parametrelerin, segmentasyon için kullanılan her hücrenin sitoplazmasının pikselleri boyunca ortalaması alındı. Arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için tek tek hücreler tanımlandı ve maskelendi. Daha sonra, çekirdek tanımlandı ve hücre maskesine yansıtıldı.Ayrıca, hücreler, tipik hücrelerin boyutuna uymayan maskeli alanları çıkarmak için filtrelendi. NADPH ve FAD'ın çoklu foton floresan ömür boyu görüntülemesi, siyanür tedavisinden önce ve sonra hücre morfolojisinin ve metabolizmasının görselleştirilmesine izin verdi. Siyanür tedavisi ile NADPH ömrünün azaldığı, siyanür tedavisi sonrası FAD ömrünün arttığı gözlenmiştir.Temsili kutu grafiği, MCF7 hücrelerinin optik redoks oranının siyanür işleminden sonra azaldığını göstermiştir. Siyanür maruziyeti, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı NADPH ömrünü azalttı. Kısa ve uzun ömürler NADPH için azaldı, ancak NADPH alfa biri için arttı.FAD için, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı ömrü, siyanür maruziyetinden sonra artmıştır. Hem kısa hem de uzun ömürler FAD için arttı, ancak FAD alfa için azaldı. Numunelere giden yeterli lazer gücüne sahip olmak önemlidir, ancak unutmayın, çok fazla güç hücrelere zarar verebilir.Otofloresan görüntüleme hücrelere zarar vermediğinden, aynı numunelerde sonraki biyokimyasal testler kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biyomühendislik

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...