Denne tilnærmingen etablerer pålitelig retrograd perfusjon av neonatal ex vivo musehjerte på under tre minutter. Dermed reduseres den yngste mulige studiealderen fra flere uker til 10 barseldager. Denne isolerte retrograd perfused modellen tillater studiet av neonatal hjerte i en kritisk periode med hjerteutvikling i en genetisk modifiserbar og lav pris art.
Mens denne modellen gir seg til studiet av fysiologiske og farmakologiske responser på iskemi-reperfusjon i neonatalhjertet. Det kan også brukes til kardiomyocyttisolasjon. For å fremstille den nyfødte musen aorta kanyle bruke skarp saks for å kutte av spissen og stumpe enden av en 26 gauge rustfritt stål nål, pass på ikke å krympe eller begrense diameteren på nål lumen.
Deretter glatter du ut skjærekanten for å fjerne eventuelle burrs ved å skrape den stumpe enden forsiktig på laboratoriebenken ved hjelp av en til-og-fro-bevegelse. Deretter fester du den fabrikkerte kanylen til Langendorff-apparatet og vurderer strømning og motstand. Mål strømningshastigheten gjennom kanylen ved å samle inn og måle bufferantallet over ett minutts intervall.
For å kvantifisere trykkforskjellen over kanylen mens Krebs-Heneseleit-bufferen strømmer, måler du trykket i systemet med og uten kanylen festet. Beregn deretter kanylemotstanden ved hjelp av følgende formel. Deretter fjerner du 26 gauge kanylen fra Langendorff-apparatet og fester et høytrykksrør til kanyleringsstedet på apparatet.
Fest deretter aortakanylen til den distale enden av slangen og luft slangen og kanylen med oksygenert buffer, og sørg for at alle bobler fjernes. For å forhindre dannelse av koronarmikrotrombi, administrer en intraperitoneal injeksjon av heparin til en 10 dager gammel musepupp ved hjelp av en 26 gauge nål på en milliliter sprøyte. La det være flere minutter før heparinet sirkulerer før du fortsetter med injeksjonen av bedøvelse.
Deretter plasserer du den bedøvede musen i liggende stilling og sikrer lemmer umiddelbart ved tap av bevissthet. Begynn å høste så snart dyret ikke reagerer på tåklemme når dyret puster spontant under den første disseksjonen. Ved hjelp av rett dissekering av saks gjør et tverrgående subksiphoid snitt over dyrenes bredde som utsetter bukhulen.
Be en assistent om å gripe xiphoid-prosessen med tang, klipp deretter ribbeina bilateralt langs midtaksillærlinjen i cephalad retning og reflektere brystbenet og ribbeina kranialt for å avsløre thoracic organene. Etter å ha identifisert membranen overlegent, oppstyr den fremre delen helt. Identifiser den infradiafragmatiske dårligere vena cava over leveren og transekter den med en buet Iris saks mens du opprettholder lite interiør i cephalad spenning på det proksimale segmentet med Iris tang.
Klipp deretter bakre langs ryggradens indre overflate ved hjelp av buet Iris saks mens du trekker den dårligere vena cava opp og ut av thoracic hulrommet. Når hjertet mobiliseres, vinkler du saksen fremre og kutter de store karene overlegent for å fjerne hjertet og lungene helt. Senk straks prøven i iskald Krebs-Henseleit buffer eller saltvann.
Hjertet skal slutte å slå i løpet av sekunder. Legg et stykke papirhåndkle på bunnen av en grunn Petri-tallerken for å gi friksjon for å stabilisere hjertet under kannasjon. Fukt papirhåndkleet med iskald Krebs-Henseleit-buffer for å hindre at hjertet holder seg til det.
Plasser den tilberedte Petri-retten under dissekeringsmikroskopet og juster fokuset. Plasser nå aortakanylen festet til høytrykksforlengelsesslangen under dissekeringsmikroskopet, sammen med en 5-0 silke sutur løst bundet rundt navet. Etter å ha plassert de utskilte thoraxorganene i Petri-parabolen, identifiser thymus ved sin hvite glans og to lober og orienter prøven slik at tymusen er fremre og overlegen.
Deretter skiller du tymusens lober direkte ved hjelp av tang som utsetter de store karene. Identifiser deretter aorta ved å finne særegne forgreningsegenskaper i aortabuen og transekter den bare proksimal til den subklavisanske arterieavrenningen ved hjelp av fin skarp saks. Ta tak i den transekterte aortaen forsiktig ved hjelp av finbuede tang i smykkestil og kanyler forsiktig aortaen med en 26 gauge stump nål, pass på at du ikke skader aortaventilen.
Ved hjelp av fine buede tang, ta tak i aorta rundt kanylen og initier retrograd perfusjon for å begrense iskemisk tid. Be assistenten gripe endene av den løst bundet suturen og forsiktig fange aorta rundt kanylen. Legg suturen over eller under de fine buede tangene, stram deretter suturen og bekreft tilstrekkelig koronarstrøm.
Koble høytrykksslangen fra Langendorff-apparatet, ta tak i kanylens nav og koble den stumpe nålen fra høytrykksforlengelsesslangen. Fest deretter raskt kanylens nav til apparatet. Når hjertet er hengt på Langendorff-apparatet i vanlig posisjon, bekreftes en tilstrekkelig perfusjon.
Trim forsiktig av lungen, tymus og overflødig vev. Deretter insosierer du riktig atrium for å tillate koronar sinusavløp å dryppe fritt. Lag en liten knute på slutten av en 5-0 silke sutur, deretter pierce et lite stykke parafinfilm med nålen og skyv parafinen til den knutede enden.
Pass nålen forsiktig gjennom toppen av ventrikelen og trekk suturen gjennom hjertet til parafinfilmen er tett mot ventrikelens laterale vegg. Før nålen gjennom åpningen av den vannfylte varmejakken på Langendorff-apparatet slik at hjertet kan omsluttes og varmes opp. Fest deretter nålen til krafttransduseren og unngå koronar sinus drypp.
Juster suturen for å påføre en til to gram basalspenning som angitt av diastolisk spenning eller nadir intensjonssporing. Plasser deretter overflateelektroder på hjertets overlegne og dårligere poler for å registrere elektrokardiogrammet. Til slutt, prøv koronar sinusavløpsmiddelet for analyse ved hjelp av et 24 gauge intravenøst kateter.
Overflateelektroder ble brukt til å registrere et kontinuerlig elektrokardiogram, som tillot å bestemme egenhastighet og rytme. Alle tilstrekkelig perfused hjerter slår spontant i sinus rytme. Denne perfusjonsstrategien oppfylte de metabolske behovene til det nyfødte musehjertet, gitt den ubetydelige laktatproduksjonen og lavt oksygenekstraksjons- og glukoseforbruk.
Fysiologiske variable midler, som gjennomsnittlig denervated iboende hjertefrekvens og gjennomsnittlig observert aorta perfusjonstrykk ble også registrert og beregnet. Noen eksklusjonskriterier som tiden det tar å initiere reperfusjon, arytmivarighet og aortaperfusjonstrykk må vurderes for å sikre konsistens av neonatalpreparatet. Etter etablering av perfusjon kan intervensjon som legemiddellevering, induksjon av iskemi-reperfusjonsskade, endringer av metabolitter eller levering av enzymatiske midler for kardiomyocytisolasjon forekomme.
