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April 6th, 2022
DOI :
April 6th, 2022
•0:04
Introduction
0:48
Preparing Micro-Patterned Agarose Coated Tissue Culture Plate
2:27
Preparing Oxygen Probe-Loaded Spheroids
3:50
Spheroids Bioprinting Procedure
5:48
Preparation of Spheroids for Live Imaging Analysis
7:10
Image Acquisition and Presentation
10:22
Results: Kinetic Study of Oxygen Probe and Comparative Analysis of Spheroids
12:18
Conclusion
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल एक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बहुकोशिकीय गोलाकार के इमेजिंग ऑक्सीकरण में मदद करता है। इस विधि का उपयोग करके, कोई भी हजारों ऑक्सीजन प्रोब-दाग वाले गोलाकार माइक्रोटिस्यू का उत्पादन कर सकता है और बाद में उन्हें 3 डी प्रिंटिंग अनुप्रयोगों में उपयोग कर सकता है। उदाहरण के लिए, संवहनी हड्डी ऊतक grafts.
निकट-अवरक्त ऑक्सीजन जांच अन्य रंगों के उपयोग के साथ संगत है जैसे कि अंततः हरे रंग की प्रतिदीप्ति धुंधला, यह लाइव और बहु-पैरामीटर दीर्घकालिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। एक भंडारण शीशी से एक बाँझ पेट्री डिश के लिए माइक्रो-पैटर्न वाले पीडीएमएस टिकटों को स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए बाँझ लैमिनर एयरफ्लो स्थितियों के तहत चिकनी सतह के साथ हवा सूखी हो। एक 12-अच्छी तरह से बाँझ ऊतक संस्कृति प्लेट के कुएं के बीच में प्रत्येक टिकट रखो।
एक खुले ढक्कन के साथ एक से दो मिनट के लिए हवा सूखी। 3% समरूप agarose समाधान के 50 milliliters तैयार करें और तुरंत सम्मिलित PDMS टिकट को कवर करने के लिए 12-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं के लिए गर्म agarose समाधान के लगभग दो milliliters जोड़ें। बाँझ airflow के तहत incubating द्वारा 20 मिनट के लिए agarose ठोस.
एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके, एम्बेडेड पीडीएमएस स्टैंप के साथ एगारोज़ को प्रत्येक कुएं में उल्टा करें। स्टांप के चिकनी शीर्ष पक्ष पर बाँझ पानी के लगभग 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसे स्पैटुला के साथ एगरोज़ से अलग करें और इसे कुएं से हटा दें।
प्रत्यक्ष उपयोग के लिए agarose टिकटों के लिए इसी बाँझ सेल संस्कृति मीडिया के एक मिलीलीटर जोड़ें। प्लेट को ढक्कन के साथ कवर करें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। उपयोग करने से पहले, कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए एगारोज़ माइक्रो-पैटर्न वाली प्लेटों को गर्म करें।
पूर्व गर्म पीबीएस के साथ 70% से 90% संगम सेल संस्कृति कुल्ला। पृथक्करण एंजाइम समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन से पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, 10% FBS युक्त पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए, सीरोलॉजिकल पिपेट के शीर्ष पर 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट टिप का उपयोग करके सेल समुच्चय को अलग करें। एक गिनती कक्ष का उपयोग करते हुए, सेल निलंबन के प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। सेल निलंबन को 500, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर तक पतला करें और इसमें केंद्रित ऑक्सीजन जांच समाधान जोड़ें।
12-अच्छी तरह से agarose-लेपित सेल संस्कृति प्लेट के सूक्ष्म पैटर्न वाले कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें और तैयार सेल निलंबन का एक मिलीलीटर कुओं में जोड़ें। ऑक्सीजन जांच की निरंतर उपस्थिति में दो से पांच दिनों के लिए कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में गोलाकार को संस्कृति करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह गोलाकार गठन और संघनन के दौरान लोड हो रहा है। एक टिप कैप के साथ एक बाँझ तीन घन सेंटीमीटर कारतूस के अंत को बंद करें और पिपेटिंग द्वारा जैव स्याही से भरें।
कारतूस में एक प्लंजर डालें और इसे उल्टा रखें। टिप कैप निकालें और बायो स्याही की ओर प्लंजर को धक्का दें जब तक कि कारतूस से सभी हवा हटा न दी जाए। बायोप्रिंटर के हीटिंग मेंटल में बायो इंक को 23 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
बायोप्रिंटर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे अवशोषित कागज के साथ सुखाएं। कारतूस के शीर्ष पर एक दबाव एडाप्टर में पेंच. कारतूस पर एक 22 गेज शंक्वाकार polyethylene सुई माउंट.
एक्सट्रूज़न-आधारित प्रिंट हेड पर हीटिंग मेंटल में कारतूस स्थापित करें। दबाव इनलेट को प्लग करें और इनलेट पर क्लिप खोलें। मुद्रण सॉफ़्टवेयर में अपने डिज़ाइन की G-कोड फ़ाइल लोड करें.
सुई लंबाई माप प्रारंभ करें। एक बाँझ पेट्री पकवान में एक छोटी सी जैव स्याही वितरित करके मुद्रण दबाव को विनियमित करें। एक छह-अच्छी तरह से प्लेट स्थापित करें, अच्छी तरह से प्लेट खोलें, हुड को बंद करें और प्रिंट करें।
मुद्रण के बाद, scaffolds शारीरिक रूप से पांच डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए crosslinked किया जा सकता है. एक पराबैंगनी एलईडी लैंप के साथ 60 सेकंड के लिए मुद्रित scaffolds विकिरण. तुरंत bioprinted ग्रिड के साथ सभी कुओं के लिए दोहरी एंटीबायोटिक समाधान युक्त इसी विकास मीडिया जोड़ें.
एक कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर scaffolds संस्कृति. माइक्रोस्कोपी अवलोकन के लिए, इमेजिंग मीडिया के साथ एक माइक्रोस्कोपी डिश कवर में एक मुद्रित वफ़ल ग्रिड स्थानांतरित करें। एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे ऑक्सीजन जांच को एगारोज़ माइक्रो कुओं से पूर्व-दाग वाले गोलाकार को धोएं और उन्हें 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में स्थानांतरित करें।
एक सूक्ष्म पैटर्न वाले अच्छी तरह से सभी गोलाकार के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति मीडिया के अतिरिक्त एक मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से एक से तीन बार अच्छी तरह से कुल्ला करें और एक शीशी में सभी गोलाकार निलंबन को संयोजित करें। गोलाकार को नीचे की ओर बसने के लिए 10 मिनट तक शीशी ऊर्ध्वाधर छोड़ दें। ध्यान से ट्यूब से मीडिया को हटाने के लिए गोलाकार अबाधित छोड़.
एक ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें जो प्रति नमूना डिश कम से कम 20 गोलाकार के लिए पर्याप्त होगा और धीरे से पिपेटिंग द्वारा गोलाकार को फिर से निलंबित कर देगा। तुरंत प्रत्येक पूर्व लेपित माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से करने के लिए गोलाकार निलंबन की एक समान मात्रा जोड़ें। माइक्रोस्कोपी की सतह पर अच्छी तरह से संलग्न करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए गोलाकार को छोड़ दें।
माइक्रोस्कोपी से माध्यम को अच्छी तरह से निकालें और इमेजिंग मीडिया के साथ एक बार कुल्ला करें। नमूने के लिए इमेजिंग मीडिया की सटीक मात्रा जोड़ें। माइक्रोस्कोपी चरण पर दाग गोलाकार के साथ माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से स्थापित करें।
10X आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करते हुए, संचरण प्रकाश में नमूने का पूर्वावलोकन करें। गोलाकार पर प्रारंभिक ध्यान केंद्रित करें, उन्हें छवि के केंद्र में खोजें और आवश्यक उच्च आवर्धन के साथ उद्देश्य को काम करने की स्थिति में लाएं। गोलाकार के भूमध्यरेखीय क्रॉस-सेक्शन में संचरण प्रकाश मोड पर ध्यान केंद्रित करें।
संदर्भ और ऑक्सीजन जांच के संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों के प्रतिदीप्ति या फॉस्फोरेसेंस संकेतों को इकट्ठा करने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करें और इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करें। मर्ज किए गए मोड में संदर्भ और संवेदनशील वर्णक्रमीय चैनलों से ऑक्सीजन जांच तीव्रता डेटा के साथ vsi फ़ाइल खोलें। माप मेनू से अनुपात विश्लेषण फ़ंक्शन विंडो खोलें।
अंश के रूप में संदर्भ चैनल की तीव्रता और R गणना के लिए एक हर के रूप में संवेदनशील चैनल की तीव्रता का चयन करें। अनुपात विश्लेषण विंडो में, मर्ज की गई तीव्रता छवि से पृष्ठभूमि को घटाने के लिए प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल पर संगत तीव्रता थ्रेशोल्ड सेटिंग्स लागू करें। गोलाकार छवियों पर लागू आरओआई मास्क गोलाकार सीमाओं को निर्धारित करता है।
जब तक छवि पृष्ठभूमि समान रूप से काली न हो जाए, तब तक थ्रेशोल्ड मान ों को बढ़ाएँ. अनुपात विश्लेषण विंडो में, स्केलिंग कारक को अनुपात छवि में तब तक समायोजित करें जब तक कि पूर्वावलोकन छवि R ग्रेडिएंट का वांछित रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करती है। तीव्रता अनुपात वितरण की छवि को मूल मल्टीचैनल छवि में एक परत के रूप में जोड़ा जाता है।
multichannel छवि की विंडो में, एक झूठी रंग पट्टी के साथ परत को सक्रिय करें। मैन्युअल रूप से समायोजित प्रदर्शन विंडो में निश्चित स्केलिंग विकल्प का उपयोग कर एक अनुपात वितरण हिस्टोग्राम की लिंकिंग और अनलिंकिंग सीमा निर्धारित करें। गोलाकार की संबंधित संचरण प्रकाश छवि खोलें।
रैखिक शासक समारोह चुनें और गोलाकार के व्यास को मापें। डेटा को स्प्रेडशीट तालिका फ़ाइल के रूप में निर्यात करें. आवश्यक आकार और आकार के ROI चुनें और इसे गोलाकार की परिधि और हाइपोक्सिक कोर पर लागू करें।
चुने गए ROI के अंदर औसत R का विश्लेषण करने के लिए ROI को माप ऑब्जेक्ट में बदलें। किसी स्प्रेडशीट संगत तालिका स्वरूप में डेटा निर्यात करें. आगे की गणना और सांख्यिकीय तुलना करने के लिए गोलाकार व्यास आर सी और आरपी के डेटासेट को प्राप्त करने के लिए गोलाकार के प्रत्येक माइक्रोस्कोपी अनुभाग पर माप लागू करें।
एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में सभी डेटा संयोजित करें. MMIR1 जांच में कम photobleaching है और विभिन्न माइटोकॉन्ड्रिया उत्तेजनाओं के लिए hDPSC गोलाकार में तेजी से श्वसन प्रतिक्रिया के वास्तविक समय के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। FCCP ने कुछ क्षेत्रों में केवल एक हल्के uncoupling प्रभाव प्रदर्शित किया और फिर सेल श्वसन में थोड़ी कमी आई।
दूसरी ओर, रोटेनोन ने उत्तेजना के बाद लगभग 80 सेकंड के भीतर गोलाकार रीऑक्सीजनेशन और परिधि-से-कोर ऑक्सीजन ग्रेडिएंट के अपव्यय के लिए अग्रणी श्वसन को दृढ़ता से रोक दिया। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान की गई पिक्सेल तीव्रता अनुपात गणना द्वारा पिक्सेल के स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सभी गोलाकार प्रकारों में वास्तविक समय का पता लगाया गया परिधि-से-कोर ऑक्सीजन ग्रेडिएंट केंद्र में ऑक्सीजन युक्त परिधि और हाइपोक्सिक niches के साथ कल्पना की जाती है। यहां रेखांकन विभिन्न गोलाकार प्रकारों के लिए भूमध्यरेखीय गोलाकार क्रॉस-सेक्शन के अनुपात प्रोफाइल को दर्शाते हैं।
होमोसेलुलर एचडीपीएससी गोलाकार की तुलना में, हेटरोसेलुलर एचडीपीएससी से एचयूवीईसी गोलाकार में काफी स्टीपर ग्रेडिएंट थे। हेटरोसेलुलर गोलाकार में परिधि-से-कोर ऑक्सीजन ग्रेडिएंट संभवतः एचडीपीएससी द्वारा उनकी संरचना में उत्पन्न होता है एचडीपीएससी गोलाकार ऑक्सीजनेशन के अनुसार मजबूत श्वसन गतिविधि होती है। रेखांकन से पता चलता है कि बायोप्रिंटेड एचडीपीएससी गोलाकार में बायोप्रिंटिंग से पहले मापा गया गोलाकार की तुलना में काफी ऑक्सीजन युक्त परिधि थी, जबकि उनके कोर ऑक्सीकरण में समान मूल्य थे।
यदि कभी-कभी जांच वर्षा समान गोलाकार गठन को परेशान करती है, तो उपयोग से पहले उच्च गति से जांच समाधान को फ़िल्टर या सेंट्रीफ्यूजेट करें। सुई लंबाई माप और दबाव विनियमन को सही करना बायोप्रिंटिंग दर और अकड़ व्यास और एक झरझरा पाड़ में बायोप्रिंट माइक्रोएग्रीगेट्स से मेल खाने के लिए आवश्यक कदम हैं। ऑक्सीजन संवेदनशील जांच इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स चुनें, जांच फोटोस्टेबिलिटी पर उनके प्रभाव पर विचार करते हुए।
ऑक्सीजन इमेजिंग कई प्रकार के लाइव माइक्रोस्कोपी माप के साथ संगत है। इमेजिंग के बाद, कोई भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस कर सकता है, पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए प्रोटीन निकाल सकता है, या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण कर सकता है।
प्रोटोकॉल एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर उनके ऑक्सीकरण और सेल मृत्यु के बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके बायोप्रिंटिंग के लिए उच्च-थ्रूपुट गोलाकार पीढ़ी का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को गोलाकार व्यवहार्यता को नियंत्रित करने और मानकीकरण करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो मॉडलिंग 3 डी ऊतक, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और सफल (सूक्ष्म) ऊतक बायोफैब्रिकेशन में महत्वपूर्ण है।
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