Rimelig oksygenmikroskopiassistert biofabrikasjon av multicellulære sfæroider

Vår protokoll hjelper til med å avbilde oksygenering av multicellulære sfæroider ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Ved hjelp av denne metoden kan man produsere tusenvis av oksygensondefargede sfæroidmikrotissues og deretter bruke dem i 3D-utskriftsapplikasjoner. For eksempel vaskulære beinvevstransplantasjoner.

nær-infrarød oksygen sonde er kompatibel med bruk av andre fargestoffer som grønn fluorescens farging av Til slutt, dette muliggjør live og multi-parameter langsiktig analyse. Overfør mikromønstrede PDMS-stempler fra et oppbevaringshette hetteglass til en steril Petri-tallerken og lufttørk med den glatte overflaten opp under de sterile laminære luftstrømforholdene i 10 minutter. Sett hvert stempel midt i brønnen på en 12-brønns steril vevskulturplate.

Lufttørk i ett til to minutter med åpent lokk. Forbered 50 milliliter 3% homogen agaroseløsning og tilsett umiddelbart omtrent to milliliter varm agaroseløsning til hver brønn av de 12-brønnsplatene for å dekke det innsatte PDMS-stempelet. Størkne agarose i 20 minutter ved å inkubere den under steril luftstrøm.

Bruk en steril spatel til å snu agarose med det innebygde PDMS-stempelet opp ned i hver brønn. Tilsett ca. 200 mikroliter sterilt vann på den glatte oversiden av stempelet. Løsne den fra agarose med en spatel og fjern den fra brønnen.

Tilsett en milliliter tilsvarende sterile cellekulturmedier til agarose-frimerkene for direkte bruk. Dekk platen med lokket og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Før bruk, varm de agarose mikromønstrede platene i en time ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator.

Skyll cellekulturen på 70 % til 90 % med forvarmet PBS. Tilsett dissosierende enzymoppløsning og inkuber i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Senere nøytraliserer du trypsin med komplette cellekulturmedier som inneholder 10% FBS.

For å oppnå en enkelt celle suspensjon, dissosiere celleaggregater ved hjelp av en 1000 mikroliter pipettespiss på toppen av den serologiske pipetten. Bruk et tellekammer til å telle antall celler per milliliter av celleopphenget. Fortynn cellefjæringen til 500 000 celler per milliliter og tilsett konsentrert oksygensondeløsning til den.

Fjern gamle medier fra mikromønstrede brønner av den 12-brønns agarosebelagte cellekulturplaten og tilsett en milliliter av den tilberedte cellefjæringen til brønnene. Kultur sfæroidene i en karbondioksidinkubator i to til fem dager i kontinuerlig tilstedeværelse av oksygensonden for å sikre at den lastes under sfæroiddannelse og komprimering. Lukk enden av en steril tre kubikkcentimeter patron med en spisshette og fyll med bioblekk ved pipettering.

Sett inn et stempel i patronen og hold det opp-ned. Fjern spisshetten og skyv stempelet mot bioblekk til all luft fra patronen er fjernet. Avkjøl bioblekk i varmemantelen på bioprinteren ved 23 grader Celsius.

Spray bioprinteren med 70% etanol og tørk den med absorberende papir. Skru inn en trykkadapter på toppen av patronen. Monter en 22 gauge konisk polyetylennål på sylinderampullen.

Monter patronen i varmemantelen på det ekstruderingsbaserte skrivehodet. Koble til trykkinntaket og åpne klipsen på innløpet. Last inn G-kodefilen for utformingen i utskriftsprogramvaren.

Start måling av nålelengde. Reguler utskriftstrykket ved å dispensere litt bioblekk i en steril Petri-tallerken. Monter en seksbrønnsplate, åpne brønnplaten, lukk hetten og skriv ut.

Etter utskrift, la stillasene være fysisk krysskoblet i 10 minutter ved fem grader Celsius. Bestråle de trykte stillasene i 60 sekunder med en ultrafiolett LED-lampe. Tilsett umiddelbart tilsvarende vekstmedier som inneholder dobbel antibiotikaløsning i alle brønner med biotrykte nett.

Kultur stillasene ved 37 grader Celsius i en karbondioksidinkubator. For mikroskopiobservasjon, overfør et trykt vaffelgitter til et mikroskopirettdeksel med bildemedier. Bruk en en milliliter pipette, vask forsiktig ut oksygensonden forfargede sfæroider fra de agarose mikrobrønnene og overfør dem til et 15 milliliter konisk bunnrør.

For å sikre innsamling av alle sfæroider fra en mikromønstret brønn, skyll brønnen en til tre ganger med den ekstra milliliteren kulturmedier og kombiner alle sfæroidfjæringer i ett hetteglass. La hetteglasset stå vertikalt i opptil 10 minutter for å la sfæroidene slå seg ned på bunnen. Fjern forsiktig mediet fra røret og la sfæroidene være uforstyrret.

Tilsett et friskt kulturmedium som vil være tilstrekkelig for minst 20 sfæroider per prøverett og forsiktig gjenopplive sfæroidene ved pipettering. Tilsett umiddelbart et likt volum sfæroid suspensjon til hver forhåndsbelagte mikroskopibrønn. La sfæroidene stå i en time ved 37 grader Celsius for å feste seg til overflaten av mikroskopibrønnen.

Fjern mediet fra mikroskopi godt og skyll en gang med bildemedier. Legg til den nøyaktige mengden bildemedier i eksemplet. Sett opp mikroskopibrønnen med fargede sfæroider på mikroskopistadiet.

Bruk 10X-forstørrelsesmålet til å forhåndsvise prøven i overføringslys. Gjør foreløpig fokus på sfæroider, finn dem i midten av bildet og ta målet med den nødvendige høye forstørrelsen til arbeidsposisjonen. Fokuser på transmisjonslysmodus i det ekvatoriale tverrsnittet av sfæroiden.

Juster innstillingene for innsamling av fluorescens- eller fosforescenssignaler for referanse og sensitive spektralkanaler i oksygensonden og start avbildningsprosessen. Åpne vsi-filen med oksygensondeintensitetsdata fra referanse og sensitive spektralkanaler i sammenslått modus. Åpne vinduet for forholdsanalysefunksjon fra målemenyen.

Velg intensiteten til referansekanalen som teller og intensiteten til den sensitive kanalen som nevner for R-beregning. I forholdsanalysevinduet bruker du tilsvarende innstillinger for intensitetsterskel på hver spektralkanal for å trekke bakgrunnen fra det sammenslåtte intensitetsbildet. ROI-masker som brukes på sfæroidbilder, bestemmer sfæroidkanter.

Øk terskelverdiene til bildebakgrunnen er jevnt svart. I forholdsanalysevinduet justerer du skaleringsfaktoren til forholdsbildet til forhåndsvisningsbildet gir ønsket oppløsning for R-graderingen. Bildet av intensitetsforholdsfordeling legges til som et lag i det opprinnelige flerkanalsbildet.

I vinduet til flerkanalsbildet aktiverer du laget med en falsk fargelinje. Angi koblings- og koblingsgrensene for et forholdsfordelings histogram manuelt ved hjelp av alternativet for fast skalering i juster visningsvinduet. Åpne det tilsvarende transmisjonslysbildet av sfæroider.

Velg lineær linjalfunksjon og mål diameteren på sfæroider. Eksporter data som en regnearktabellfil. Velg avkastningen av ønsket størrelse og form og bruk den på periferien og hypoksiske kjernen av sfæroiden.

Transformer avkastningen til måleobjektet for å analysere gjennomsnittlig R i den valgte avkastningen. Eksportere data i et regnearkkompatibelt tabellformat. Påfør målinger på hver mikroskopidel av sfæroider for å få datasettet av sfæroiddiametre RC og RP for å utføre ytterligere beregninger og statistisk sammenligning.

Kombiner alle dataene i én regnearkfil. MMIR1-sonden har lav fotobleaching og er egnet for sanntidsstudie av rask respiratorisk respons i hDPSC-sfæroider til forskjellige mitokondristimuli. FCCP viste bare en mild frakoblingseffekt i noen områder og deretter litt redusert celle respirasjon.

På den annen side hemmet rotenon sterkt respirasjon som førte til sfæroid reoksygenering og spredning av periferi-til-kjerne oksygengradienter innen ca. 80 sekunder etter stimulering. Ved hjelp av den automatiserte protokollen av pixel by pixel intensity ratio beregninger levert av bildebehandling programvare, sanntid oppdaget periferi-til-kjerne oksygen gradienter i alle sfæroid typer er visualisert med oksygenert periferi og hypoksiske nisjer i sentrum. Grafene heri skildrer forholdsprofiler av ekvatorial sfæroid tverrsnitt for forskjellige sfæroidtyper.

Sammenlignet med homocellulære hDPSC-sfæroider hadde heterocellulær hDPSC til HUVEC sfæroider betydelig brattere gradienter. Den periferi-til-kjerne oksygen gradient i heterocellulære sfæroider er sannsynligvis generert av hDPSC i deres sammensetning i henhold til hDPSC sfæroider oksygenering har sterk respirasjon aktivitet. Grafene viser at bioprinted hDPSC sfæroider hadde en betydelig oksygenert periferi enn sfæroider målt før bioprint mens deres kjerne oksygenering hadde lignende verdier.

Hvis sporadisk sondenedbør forstyrrer jevn sfæroiddannelse, må probeløsningen filtreres eller sentrifugeres ved høy hastighet før bruk. Korrigering av nålelengdemåling og trykkregulering er viktige trinn for å matche bioprinthastigheten og stiverdiameteren og biotrykkmikroaggregatene i et porøst stillas. Velg mikroskopiinnstillingene for oksygenfølsom sondeavbildning, med tanke på effekten på sondens fotostabilitet.

Oksygenavbildning er kompatibel med mange typer levende mikroskopimålinger. Etter avbildning kan man også utføre immunfluorescens, trekke ut proteiner for vestlig blotting eller utføre genuttrykksanalyse.