3.0K Views
•
13:21 min
•
April 6th, 2022
DOI :
April 6th, 2022
•0:04
Introduction
0:48
Preparing Micro-Patterned Agarose Coated Tissue Culture Plate
2:27
Preparing Oxygen Probe-Loaded Spheroids
3:50
Spheroids Bioprinting Procedure
5:48
Preparation of Spheroids for Live Imaging Analysis
7:10
Image Acquisition and Presentation
10:22
Results: Kinetic Study of Oxygen Probe and Comparative Analysis of Spheroids
12:18
Conclusion
Transcript
Vårt protokoll hjälper till att avbilda syresättning av multicellulära sfäroider med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop. Med hjälp av denna metod kan man producera tusentals syresondfärgade sfäroidmikrotissuer och därefter använda dem i 3D-utskriftsapplikationer. Till exempel vaskulariserade benvävnadstransplantat.
nära-infraröd syresond är kompatibel med användningen av andra färgämnen såsom grön fluorescensfärgning av I slutändan möjliggör detta levande och långsiktig analys med flera parametrar. Överför mikromönstrade PDMS-stämplar från en förvaringsflaska till en steril petriskål och lufttorka med den släta ytan uppåt under de sterila laminära luftflödesförhållandena i 10 minuter. Lägg varje stämpel i mitten av brunnen på en 12-brunns steril vävnadsodlingsplatta.
Lufttorka i en till två minuter med ett öppet lock. Förbered 50 ml 3% homogen agaroslösning och tillsätt omedelbart cirka två milliliter varm agaroslösning till varje brunn av 12-brunnsplattorna för att täcka den införda PDMS-stämpeln. Stelna agarosen i 20 minuter genom att inkubera den under sterilt luftflöde.
Vänd agarosen med den inbäddade PDMS-stämpeln upp och ner i varje brunn med en steril spatel. Tillsätt cirka 200 mikroliter sterilt vatten på stämpelns släta ovansida. Lossa den från agarosen med en spatel och ta bort den från brunnen.
Tillsätt en milliliter motsvarande sterila cellodlingsmedier till agarosstämplarna för direkt användning. Täck plattan med locket och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Före användning, värm agarosmikromönstrade plattor i en timme vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator.
Skölj 70% till 90% sammanflödescellodling med förvärmd PBS. Tillsätt dissocierande enzymlösning och inkubera i tre till fem minuter vid 37 grader Celsius. Senare neutralisera trypsin med komplett cellodlingsmedier innehållande 10% FBS.
För att erhålla en enda cellsuspension, dissociera cellaggregat med användning av en 1000 mikroliter pipettspets på toppen av den serologiska pipetten. Använd en räknekammare, räkna antalet celler per milliliter av cellsuspensionen. Späd cellsuspensionen till 500 000 celler per milliliter och tillsätt koncentrerad syresondlösning till den.
Ta bort gamla medier från mikromönstrade brunnar på den 12-brunns agarosbelagda cellodlingsplattan och tillsätt en milliliter av den beredda cellsuspensionen till brunnarna. Odla sfäroiderna i en koldioxidinkubator i två till fem dagar i kontinuerlig närvaro av syresonden för att säkerställa att den laddas under sfäroidbildning och komprimering. Stäng änden av en steril tre kubikcentimeter patron med ett spetslock och fyll med biobläck genom pipettering.
Sätt i en kolv i patronen och håll den upp och ner. Ta bort spetslocket och tryck kolven mot biobläcket tills all luft från patronen har tagits bort. Kyl biobläcket i bioprinterns värmemantle vid 23 grader Celsius.
Spraya bioskrivaren med 70% etanol och torka den med absorberande papper. Skruva i en tryckadapter på toppen av patronen. Montera en 22 gauge konisk polyetennål på patronen.
Montera patronen i värmemanteln på det extruderingsbaserade skrivhuvudet. Anslut tryckinloppet och öppna klämman på inloppet. Ladda G-kodfilen för din design i utskriftsprogrammet.
Starta mätning av nållängd. Reglera trycktrycket genom att dosera lite biobläck i en steril petriskål. Installera en sexbrunnsplatta, öppna brunnsplattan, stäng huven och skriv ut.
Efter utskrift, låt byggnadsställningarna vara fysiskt tvärbundna i 10 minuter vid fem grader Celsius. Bestråla de tryckta byggnadsställningarna i 60 sekunder med en ultraviolett LED-lampa. Tillsätt omedelbart motsvarande tillväxtmedier som innehåller dubbel antibiotikalösning till alla brunnar med bioprintade galler.
Odla byggnadsställningarna vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator. För mikroskopiobservation, överför ett tryckt våffelnät till ett mikroskopifat med bildbehandling. Använd en milliliter pipett, tvätta försiktigt ut syresondens förfärgade sfäroider från agarosmikrobrunnarna och överför dem till ett 15 ml koniskt bottenrör.
För att säkerställa insamling av alla sfäroider från en mikromönstrad brunn, skölj brunnen en till tre gånger med ytterligare en milliliter odlingsmedia och kombinera alla sfäroidsuspensioner i en injektionsflaska. Låt injektionsflaskan vara vertikal i upp till 10 minuter för att låta sfäroiderna sätta sig ner på botten. Ta försiktigt bort mediet från röret och lämna sfäroiderna ostörda.
Tillsätt ett nytt odlingsmedium som kommer att räcka för minst 20 sfäroider per provskål och försiktigt resuspendera sfäroiderna genom pipettering. Tillsätt omedelbart en lika stor volym sfäroidsuspension till varje förbelagd mikroskopibrunn. Lämna sfäroiderna i en timme vid 37 grader Celsius för att fästa vid mikroskopibrunnens yta.
Ta bort mediet från mikroskopin väl och skölj en gång med bildbehandling. Lägg till den exakta mängden bildbehandlingsmedier i provet. Ställ in mikroskopin väl med färgade sfäroider på mikroskopistadiet.
Förhandsgranska provet i överföringsljus med förstoringsmålet 10X. Gör preliminärt fokus på sfäroider, lokalisera dem i mitten av bilden och ta målet med den nödvändiga höga förstoringen till arbetspositionen. Fokusera på överföringsljusläge i sfäroidens ekvatorialtvärsnitt.
Justera inställningarna för insamling av fluorescens- eller fosforescenssignaler från syresondens referens- och känsliga spektralkanaler och starta avbildningsprocessen. Öppna vsi-filen med syresondintensitetsdata från referens- och känsliga spektralkanaler i sammanslaget läge. Öppna fönstret för förhållandeanalysfunktionen från måttmenyn.
Välj referenskanalens intensitet som täljare och intensiteten för den känsliga kanalen som nämnare för R-beräkning. I förhållandeanalysfönstret tillämpar du motsvarande intensitetströskelinställningar för varje spektralkanal för att subtrahera bakgrunden från den sammanslagna intensitetsbilden. ROI-masker som appliceras på sfäroidbilder bestämmer sfäroidgränser.
Öka tröskelvärdena tills bildbakgrunden är jämnt svart. I fönstret för förhållandeanalys justerar du skalningsfaktorn till förhållandebilden tills förhandsgranskningsbilden ger önskad upplösning av R-gradienten. Bilden av intensitetsförhållandefördelningen läggs till som ett lager till den ursprungliga flerkanaliga bilden.
I fönstret i flerkanalsbilden aktiverar du lagret med en falsk färgfält. Bestäm manuellt länknings- och avlänkningsgränserna för ett förhållandefördelnings histogram med hjälp av alternativet för fast skalning i fönstret Justera visning. Öppna motsvarande överföringsljusbild av sfäroider.
Välj linjär linjalfunktion och mät diametern på sfäroider. Exportera data som en kalkylarkstabellfil. Välj ROI för önskad storlek och form och applicera den på periferin och hypoxiska kärnan i sfäroiden.
Omvandla ROI till mätobjektet för att analysera den genomsnittliga R inuti den valda ROI. Exportera data i ett kalkylbladskompatibelt tabellformat. Applicera mätningar på varje mikroskopisektion av sfäroider för att erhålla datasetet av sfäroiddiametrar RC och RP för att utföra ytterligare beräkningar och statistisk jämförelse.
Kombinera all data i en kalkylarksfil. MMIR1-sonden har låg fotoblekning och är lämplig för realtidsstudier av snabb andningsrespons i hDPSC-sfäroider mot olika mitokondrierstimuli. FCCP visade endast en mild frikopplingseffekt i vissa områden och minskade sedan cellandningen något.
Å andra sidan hämmade rotenon starkt andningen vilket ledde till sfäroidreoxygenering och avledning av periferin-till-kärn-syregradienterna inom cirka 80 sekunder efter stimulering. Med hjälp av det automatiska protokollet för beräkningar av pixel-för-pixelintensitetsförhållande som tillhandahålls av bildprogramvaran visualiseras realtidsdecerade periferi-till-kärn-syregradienter i alla sfäroidtyper med den syresatta periferin och hypoxiska nischer i mitten. Graferna här visar förhållandeprofiler för ekvatorialsfäroidtvärsnitten för olika sfäroidtyper.
Jämfört med homocellulära hDPSC-sfäroider hade heterocellulära hDPSC till HUVEC-sfäroider signifikant brantare gradienter. Den perifera syregradienten från kärna till kärna i heterocellulära sfäroider genereras sannolikt av hDPSC i deras sammansättning enligt hDPSC-sfäroiders syresättning med stark andningsaktivitet. Graferna visar att bioprintade hDPSC-sfäroider hade en signifikant syresatt periferi än sfäroider uppmätta före bioprinting medan deras kärnsyresättning hade liknande värden.
Om enstaka sondutfällningar stör enhetlig sfäroidbildning, filtrera eller centrifuera sondlösningen med hög hastighet före användning. Korrigering av nållängdsmätning och tryckreglering är viktiga steg för att matcha bioprinthastigheten och fjäderbensdiametern och bioprintmikroaggregaten i en porös byggnadsställning. Välj mikroskopiinställningar för syrekänslig sondavbildning, med tanke på deras effekt på sondens fotostabilitet.
Syreavbildning är kompatibel med många typer av levande mikroskopimätningar. Efter avbildning kan man också utföra immunofluorescens, extrahera proteiner för västerländsk blotting eller utföra genuttrycksanalys.
Protokollet beskriver sfäroidgenerering med hög genomströmning för bioprinting med hjälp av den multiparametriska analysen av deras syresättning och celldöd på ett standardfluorescensmikroskop. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas för att kontrollera sfäroidernas livskraft och utföra standardisering, vilket är viktigt vid modellering av 3D-vävnad, tumörmikromiljö och framgångsrik (mikro) vävnadsbiofabricering.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved