Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

تم دعم العمل من قبل معهد كارلسروهر للتكنولوجيا.

1. العزلة عن البيئة الطبيعية
ملاحظة: يمكن عزل الطحالب الخضراء والدياتومات والبكتيريا الزرقاء الخيطية والطحالب الدقيقة الأخرى. يمكن استخدام البروتوكول لأي نوع من أنواع الطحالب الدقيقة من برك الصخور التي تنمو تحت ظروف المختبر. يمكن التعرف بسهولة على البكتيريا الزرق?...

<ol>
	<li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories.">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li><li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria.">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515 (2019).</li><li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria.">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).</li><li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria:+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant.">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li><li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+cyanobacteria.">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li><li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803:+preparation+of+chromosomal+DNA.">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li><li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination.">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li><li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria.">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li><li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation.">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277.">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li><li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806.">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp,+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp.">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li><li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+(Subsection+V)+Fischerella+and+Chlorogloeopsis.">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li><li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying.">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454 (2020).</li><li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li><li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light.">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li><li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803.">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+artificial+seawater.">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTAB+DNA+extraction+buffer.">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li><li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., H&#228;der, D. -. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria.">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology &amp; Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li><li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion.">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii.">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li><li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp,+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin.">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li><li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997.">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li><li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902.">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li><li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco.">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li><li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells.">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li><li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria.">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).</li></ol>

على الرغم من أن العديد من سلالات البكتيريا الزرقاء متوفرة من مجموعات الاستزراع32،33،34،35،36 ، لا يزال هناك طلب على البكتيريا الزرقاء الجديدة من البرية لأن هذه الأنواع تتكيف مع خصائص محددة. تم جمع P. ثغ?...

البكتيريا الزرقاء هي كائنات بدائية النواة تستخدم التمثيل الضوئي كمصدر للطاقة 1,2. تركز الأبحاث بشكل متزايد على أنواع البكتيريا الزرقاء. يمكن تحويل العديد من البكتيريا الزرقاء باستخدام الحمض النووي3. يمكن إخراج الجينات أو المبالغة في التعبير عنها في هذه الأنواع. ومع ذلك ، يقتصر التحول على عدد قليل من الأنواع4،5،6،7،8،9،10،11 ، وقد يكون من الصعب إنشاء تحول في السلالات من مجموعات الاستزراع أوالبرية 8. تم عزل سلالات الأنواع الخيطية Phormidium gapuna (الشكل 1) من برك الصخور البحرية ، حيث تتقلب الظروف البيئية ، مثل تركيزات الملح أو درجة الحرارة ، بمرور الوقت. يمكن استخدام هذه البكتيريا الزرقاء الخيطية ككائنات حية نموذجية لترتيب Oscillatoriales12 الذي تنتمي إليه.
خلال التجارب التي تختبر نقل الجينات عن طريق الكهربية13,14 ، وجد أن P. ثغرة يمكن تحويلها عن طريق التحول الطبيعي 15. في هذه العملية ، يتم تناول الحمض النووي بشكل طبيعي من قبل بعض الخلايا. بالمقارنة مع طرق التحول الأخرى16,17 ، يتمتع التحول الطبيعي بميزة عدم الحاجة إلى أدوات إضافية يمكن أن تعقد الإجراء. على سبيل المثال ، يتطلب الكهربية الكافيت المناسب ، والأسلاك السليمة ، واختيار الجهد المناسب. P. ثغرة هي حاليا العضو الوحيد في الذبذبات المعرضة للتحول الطبيعي. نظرا لأن البروتوكول الأصلي يعتمد على بروتوكولات الكهربية ، فإنه لا يزال يتضمن العديد من خطوات الغسيل التي قد تكون غير ضرورية. تم اختبار مناهج مختلفة لتبسيط البروتوكول ، مما أدى إلى بروتوكول التحويل المعروض هنا.
تسلسل الجينوم ضروري لمزيد من الدراسات الجزيئية القائمة على الضربة القاضية الجينية أو الإفراط في التعبير. على الرغم من أنه يمكن الحصول على تسلسل الجينوم باستخدام آلات تسلسل الجيل التالي في غضون فترات قصيرة ، إلا أن استخراج الحمض النووي قد يكون صعبا ويعتمد على الأنواع. مع P. ثغرة ، تم اختبار العديد من البروتوكولات. ثم أنشئت طريقة معدلة قائمة على بروميد الأمونيوم ثلاثي ميثيل سيتيل (CTAB)، مما أدى إلى نقاء مقبول للحمض النووي وإنتاج الحمض النووي لكل دورة تنقية لمواصلة العمل في المختبر. يمكن تسلسل جينوم خمس سلالات باستخدام هذا البروتوكول. كانت خطوة التحول المنطقي التالية هي إنشاء تعبير البروتين في P. ثغرة.
يمكن الكشف عن sfGFP المستخدم كبروتين علامة في هذا البروتوكول باستخدام أي مجهر فلوري. يمكن استخدام جميع المروجين الذين تم اختبارهم لتعبير P. lacuna sfGFP. أدى العدد المتزايد من السلالات الناشئة عن التحول إلى الحاجة إلى طريقة لتخزين الثقافات. يتم إنشاء هذه الطرق للإشريكية القولونية والعديد من البكتيريا الأخرى18. في البروتوكولات القياسية ، يتم إعداد مزارع الجلسرين ، ونقلها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. لا تتطلب هذه الطريقة سوى بضع خطوات وهي موثوقة للغاية لتلك الأنواع التي تم تأسيسها من أجلها. ولم يكن البروتوكول الموحد ممكنا بالنسبة للثغرة المتصورة لأن الخلايا الحية لا يمكن استردادها في جميع الحالات. ومع ذلك ، عندما تمت إزالة الجلسرين بعد ذوبان الجليد ، نجت خلايا جميع التجارب. يتم تقديم طرق بسيطة لتحليل حركية P. ثغرة ، والتي يمكن دمجها مع طفرات الضربة القاضية للتحقيق في النوع الرابع pili أو دور المستقبلات الضوئية. تختلف هذه الفحوصات عن تلك الخاصة بالبكتيريا الزرقاء أحادية الخلية19،20،21 ويمكن أن تكون مفيدة أيضا للذبذبات الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

البكتيريا الزرقاء هي محور البحوث الأساسية ومشاريع التكنولوجيا الحيوية التي تستخدم فيها الطاقة الشمسية لإنتاج الكتلة الحيوية. ثغرة Phormidium هي بكتيريا زرقاء خيطية معزولة حديثا. تصف هذه الورقة كيف يمكن عزل البكتيريا الزرقاء الخيطية الجديدة من برك الصخور البحرية. كما يصف كيف يمكن استخراج الحمض النووي من الخيوط وكيف يمكن تسلسل الجينومات. على الرغم من أن التحول قد تم تأسيسه للعديد من الأنواع أحادية الخلية ، إلا أنه يتم الإبلاغ عنه بشكل أقل تواترا للبكتيريا الزرقاء الخيطية. يتم وصف طريقة مبسطة للتحول الطبيعي ل P. lacuna هنا. P. lacuna هو العضو الوحيد في ترتيب الذبذبات الذي تم إنشاء التحول الطبيعي له. توضح هذه الورقة أيضا كيفية استخدام التحول الطبيعي للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (sfGFP). قام مروج cpcB داخلي المنشأ بتحفيز تعبير أقوى بنحو 5 مرات من مروجي cpc560 أو A2813 أو psbA2 من Synechocystis sp. PCC6803. علاوة على ذلك ، تم إنشاء طريقة للحفظ بالتبريد ل P. lacuna و Synechocystis sp.CPP 6803 ، وتم وصف طرق لتقييم الحركة في وسط سائل وعلى الأسطح الخضراء والبلاستيكية.

وباتباع الطرق المذكورة أعلاه، عزلت 5 سلالات مختلفة من الثغرة المتصورة من برك الصخور وتسلسلت (الشكل 1 والجدول 1). كانت جميع الثقافات عقيمة بعد ~ 1 سنة من الزراعة الفرعية باستثناء P. lacuna HE10JO. لا تزال هذه السلالة ملوثة بماريفيرغا أتلانتيك ، وهي بكتيريا بحر?...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna هي بكتيريا زرقاء خيطية تم عزلها من برك الصخور البحرية. تصف هذه المقالة عزل الخيوط عن المصادر الطبيعية ، واستخراج الحمض النووي ، وتسلسل الجينوم ، والتحول الطبيعي ، والتعبير عن sfGFP ، والحفظ بالتبريد ، وطرق الحركة.

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تحويل البكتيريا الزرقاء الخيطية التي تنتمي إلى المذبذبات عن طريق التحول الطبيعي. كما يوضح كيف يمكن دراسة أنواع مختلفة من الحركة. التحول الطبيعي هو أبسط تقنية تحويل ، إذا كانت تعمل.مطلوب فقط الحمض النووي والخلايا ووسط النمو. حتى الآن ، لا يمكن تحويل أي عضو آخر في الذبذبات عن طريق التحول الطبيعي. نأمل أن تحفز دراساتنا المجموعات الأخرى على تجربة الذبذبات الأخرى.من أجل التحول ، قم بعمل ثقافة جيدة وصحية المظهر وإعداد جيد للحمض النووي. بالنسبة لدراسات الحركة ، استخدم دائما ثقافة معالجة بالموجات فوق الصوتية. يجب أن يكون العلاج طازجا.ستوضح الإجراء نورا ويبر ، وهي فنية من مختبري. ابدأ بتلقيح 50 ملليلتر سائل F2 متوسط في كل من قارورتين سعة 250 ملليلتر مع ملليلتر واحد من خيوط P.lacuna من ثقافة الجري. تزرع في ضوء أبيض تحت الإثارة لمدة خمسة أيام تقريبا عند 25 درجة مئوية.بعد خمسة أيام ، قم بتجانس 100 ملليلتر من تعليق خلية P.lacuna عند 10،000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق وقياس الكثافة البصرية عند 750 نانومتر. ثم ، الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 15 دقيقة في 6،000 مرات G.قم بإزالة المادة الفائقة وتعليق الكريات في 800 ميكرولتر من السائل المتبقي و F2 + الوسط الإضافي. خذ ثمانية ألواح F2 + Bacto agar تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين وماصة 10 ميكروغرام من الحمض النووي في منتصف كل صفيحة أجار.ماصة على الفور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على رأس الحمض النووي. احتفظ بلوحة الأجار بدون غطاء على المقعد النظيف للسماح للسائل الزائد بالتبخر. أغلق اللوحة وازرعها في ضوء أبيض عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.بعد يومين ، قم بتوزيع خيوط كل صفيحة أجار على عدة ألواح أجار F2 + Bacto طازجة تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين مع حلقة تلقيح. قم بزراعة الألواح في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية وتحقق من الثقافات بانتظام تحت المجهر. بعد 14 إلى 28 يوما ، حدد الخيوط البنية الميتة وابحث عن الخيوط المتحولة تحت المجهر.تبدو الخيوط المحولة صحية وخضراء وتختلف عن الجزء الأكبر من الخيوط. انقل كل خيط محول إلى قوارير سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من F2 + متوسطة مع 250 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين. تزرع في الضوء الأبيض عند 25 درجة مئوية على شاكر ومراقبة النمو لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.انقل الخيوط مرة أخرى إلى وسط الأجار الذي يحتوي على 250 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين وانتظر حتى تنمو الخيوط. ثم ، قم بزيادة تركيز الكاناميسين مرة أخرى لتسريع الفصل. بالنسبة لتعبير GFP ، لاحظ خيوط مفردة باستخدام مجهر فلوري عند تكبير 40X أو 63X والتقط صورة انتقال المجال الساطع وصورة التألق.قم بزراعة P.lacuna في وسط F2 أقل من 50 دورة في الدقيقة في الضوء الأبيض لمدة خمسة أيام تقريبا حتى تصبح الكثافة البصرية المقدرة عند 750 نانومتر 0.35. قم بتخزين العينة عند أربع درجات مئوية. تجانس الخيوط بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة بأقصى طاقة ودورة واحدة.قياس الكثافة البصرية عند 750 نانومتر ونقل ثمانية ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على P.lacuna إلى طبق بتري بطول ستة سنتيمترات. انتظر لبضع دقائق حتى تصل العينة إلى درجة حرارة الغرفة ثم قم بتغطية طبق بتري بورق السيلوفان. ضع شريحة مجهر على طاولة X-Y الخاصة بالمجهر القياسي باستخدام كاميرا.قم بتشغيل ضوء المجهر وحرك هدفا 4X أو 10X في مسار الضوء. ثم ضع طبق بتري فوق الشريحة. اضبط الخيوط المفردة أو حزم الخيوط حسب حركات X و Y و Z في الجدول.راقب حركات خيوط أو حزم مفردة وسجل الحركات باستخدام كاميرا مجهر قياسية. تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تلمس السائل. ماصة 0.5 ملليلتر من محلول يحتوي على P.lacuna على سطح Bacto agar لطبق بتري طوله ستة سنتيمترات.اسمح للسائل بدخول السطح. بعد حوالي 20 دقيقة ، أغلق طبق بتري وراقب حركة الخيوط على السطح باستخدام هدف 4X أو 10X. التقط تسجيلات الفاصل الزمني باستخدام كاميرا العين ونظام الكمبيوتر الصغير.يجب أن تركز الخيوط أولا بالعين ثم من خلال كاميرا العين. تأكد من أن الفاصل الزمني بين الصور اللاحقة هو خمس ثوان إلى دقيقة واحدة. قم ببرمجة البرنامج النصي Linux للكمبيوتر المصغر للتحكم في تسجيل الفاصل الزمني.قم بإعداد حاملات LED حيث يتم تركيب مصابيح LED مقاس 5 ملليمترات لتشعيع مساحة 20 ملم مربع من الأسفل إلى الأعلى. قياس وضبط كثافة LED. تأكد من أن الإعداد بأكمله في غرفة مظلمة أو حاوية مغلقة مظلمة.ضع ثمانية ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على P.lacuna في طبق بتري بطول ستة سنتيمترات ، وأغلق طبق بتري بالغطاء ، وضعه على حامل LED بحيث يكون LED في وسط طبق Petri. بعد يومين عادة ، التقط صورة لطبق بتري باستخدام كاميرا هاتف ذكي موجهة مباشرة إلى موضع المعالجة الضوئية. استخدم حاملا وورقة بيضاء كخلفية لضمان نفس المسافة وظروف الإضاءة لكل صورة.افتح برنامج ImageJ ، وانقر فوق ملف ، وفتح ، وحدد الملف. ثم انقر فوق Enter. حدد الزر المستقيم واضغط على زر الماوس الأيسر لرسم خط من أحد طرفي طبق Petri إلى الطرف الآخر.تأكد من أن الخط يمر عبر مركز دائرة الخيوط. انقر على تحليل وقياس لمعرفة طول طبق بيتري. ثم انقر فوق تحليل ورسم ملف التعريف في قائمة ImageJ.تقدير قيمة متوسطة لكثافة البيكسل خارج الدائرة وقيمة متوسطة أخرى لكثافة البيكسل داخل الدائرة. أشر بالماوس على موضع Y بين هذه القيم لتقدير قيم X لكلا جانبي الدائرة. لاحظ كلا القيمتين واحسب الفرق.ثم حدد الزر المستقيم وارسم خطا عند القيمة القصوى المتوسطة لكثافة البكسل. أخيرا ، انقر فوق تحليل ثم قياس للحصول على طول دائرة الخلية الداخلية. يظهر هنا تكامل وفصل الإدراج بعد تحويل P.lacuna مع PAK1.عادة ما يحتوي اختبار PCR مع الاشعال الخارجي بعد حوالي أسبوع واحد من التحول على شريطين على هلام الرحلان الكهربائي ، أحدهما بحجم النطاق البري ، والآخر أبطأ في الترحيل يشير إلى إدخال كاسيت المقاومة. هنا ، تمثل الممرات من 1 إلى 4 منتجات PCR من الخيوط بعد سبعة أيام و 11 يوما و 14 يوما و 17 يوما من عزل خيوط مقاومة ، ويمثل الممر 5 منتج PCR من النوع البري. في عينة الأيام السبعة ، يكون الإدراج موجودا في جزء صغير من الكروموسومات.يزداد هذا الكسر حتى 17 يوما ، حيث لا يوجد نطاق من النوع البري مرئيا ؛ أي أن الفصل كامل. تمثل هذه الصورة المتجه pMH1 للتعبير عن sfGHP تحت سيطرة مروج بيتا فيكوسيانين الداخلي. يظهر تسلسل P.lacuna المتماثل ، والعمود الفقري المتجه pUC19 ، وإدراج مع مقاومة sfGFP و kanamycin هنا.في pMH1 ، يتم وضع جين sfGHP ثلاثة رئيس من جين بيتا phycocyanin ؛ وبالتالي ، يتم تشغيله من قبل مروج بيتا CPC الداخلي. يتم عرض صور التألق لخيوط P.lacuna من النوع البري وبعد التحول مع PAK1 و PAK2 و PAK3 و pMH1 هنا. يتم توجيه تعبير sfGFP بواسطة مروج cpc 560 أو مروج a2813 أو مروج psbA2S أو مروج بيتا CPC الداخلي.تظهر الصور المدمجة المعروضة هنا حركية ثغرة Phormidium. تظهر الحركة على سطح الأجار هنا. كان الفاصل الزمني دقيقة واحدة.يتم عرض الحركة في الوسط السائل هنا. كان الفاصل الزمني 10 ثوان. التحول الطبيعي هو طريقة بسيطة.ما عليك سوى خلط الحمض النووي البلازميدي مع كاسيت المقاومة في تسلسلات متماثلة مع الخلايا والسماح للخلايا بالنمو على وسط بالمضادات الحيوية. يمكن تعطيل الجينات ويمكن الإفراط في التعبير عن البروتينات. هذا مهم لأي بحث أساسي وللدراسات التقنية الحيوية.في البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية حيث يتم إنشاء التحول الطبيعي أيضا ، تمت معالجة الدراسات الجزيئية حول التمثيل الضوئي أو المستقبلات الضوئية ، وما إلى ذلك.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...