Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door het Karlsruher Institute of Technology.

1. Isolatie van de natuurlijke omgeving
OPMERKING: Groene algen, diatomeeën, filamenteuze cyanobacteriën en andere microalgen kunnen worden geïsoleerd. Het protocol kan worden gebruikt voor alle microalgensoorten uit steenpoelen die onder laboratoriumomstandigheden groeien. Filamenteuze cyanobacteriën die behoren tot Oscillatoriales kunnen gemakkelijk worden herkend aan hun beweging en filamenteuze vorm. De soort kan in een semipure toestand worden geïdentificeerd door geno...

<ol>
	<li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories.">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li><li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria.">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515 (2019).</li><li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria.">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).</li><li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria:+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant.">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li><li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+cyanobacteria.">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li><li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803:+preparation+of+chromosomal+DNA.">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li><li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination.">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li><li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria.">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li><li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation.">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277.">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li><li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806.">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp,+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp.">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li><li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+(Subsection+V)+Fischerella+and+Chlorogloeopsis.">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li><li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying.">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454 (2020).</li><li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li><li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light.">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li><li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803.">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+artificial+seawater.">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTAB+DNA+extraction+buffer.">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li><li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., H&#228;der, D. -. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria.">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology &amp; Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li><li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion.">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii.">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li><li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp,+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin.">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li><li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997.">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li><li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902.">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li><li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco.">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li><li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells.">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li><li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria.">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).</li></ol>

Hoewel veel soorten cyanobacteriën beschikbaar zijn uit kweekcollecties 32,33,34,35,36, is er nog steeds vraag naar nieuwe cyanobacteriën uit het wild omdat deze soorten zijn aangepast aan specifieke eigenschappen. P. lacune werd verzameld uit rotsspoelen en is aangepast aan variaties van zoutconcentraties en temperatuur30. S...

Cyanobacteriën zijn prokaryote organismen die fotosynthese gebruiken als energiebron 1,2. Het onderzoek richt zich steeds meer op cyanobacteriële soorten. Verschillende cyanobacteriën kunnen worden getransformeerd met DNA3. Genen kunnen bij deze soorten worden uitgeschakeld of overexpressie krijgen. De transformatie is echter beperkt tot enkele soorten 4,5,6,7,8,9,10,11, en het kan moeilijk zijn om transformatie vast te stellen in stammen uit kweekcollecties of het wild 8. Stammen van de filamenteuze soort Phormidium lacuna (figuur 1) werden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen, waarin omgevingsomstandigheden, zoals zoutconcentraties of temperatuur, in de loop van de tijd fluctueren. Deze filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden gebruikt als modelorganismen voor de orde Oscillatoriales12 waartoe ze behoren.
Tijdens proeven met genoverdracht door elektroporatie13,14 werd ontdekt dat P. lacune kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie15. In dit proces wordt DNA op natuurlijke wijze opgenomen door sommige cellen. In vergelijking met andere transformatiemethoden 16,17 heeft natuurlijke transformatie het voordeel dat er geen extra hulpmiddelen nodig zijn die de procedure kunnen bemoeilijken. Elektroporatie vereist bijvoorbeeld de juiste cuvetten, intacte draden en selectie van de juiste spanning. P. lacune is momenteel het enige Oscillatoriales-lid dat vatbaar is voor natuurlijke transformatie. Omdat het oorspronkelijke protocol is gebaseerd op elektroporatieprotocollen, bevatte het nog steeds verschillende wasstappen die mogelijk onnodig zijn. Verschillende benaderingen werden getest om het protocol te vereenvoudigen, wat leidde tot het hier gepresenteerde transformatieprotocol.
De genoomsequentie is essentieel voor verdere moleculaire studies op basis van gen knock-out of overexpressie. Hoewel genoomsequenties binnen korte tijd kunnen worden verkregen met sequencingmachines van de volgende generatie, kan de extractie van DNA moeilijk zijn en afhankelijk van de soort. Bij P. lacune werden verschillende protocollen getest. Vervolgens werd een op gemodificeerde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) gebaseerde methode vastgesteld, wat resulteerde in een aanvaardbare zuiverheid van DNA en DNA-opbrengsten van elke zuiveringscyclus voor voortgezet werk in het laboratorium. Het genoom van vijf stammen zou met dit protocol gesequenced kunnen worden. De volgende logische transformatiestap was het vaststellen van eiwitexpressie in P. lacune.
De sfGFP die in dit protocol als markereiwit wordt gebruikt, kan met elke fluorescentiemicroscoop worden gedetecteerd. Alle promotors die werden getest, konden worden gebruikt voor P. lacuna sfGFP-expressie. Het toenemende aantal stammen dat voortkomt uit transformatie heeft geleid tot de behoefte aan een methode voor het opslaan van de culturen. Dergelijke methoden zijn vastgesteld voor Escherichia coli en vele andere bacteriën18. In standaardprotocollen worden glycerolculturen bereid, overgebracht in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. Deze methode vereist slechts een paar stappen en is zeer betrouwbaar voor die soorten waarvoor het is vastgesteld. Het standaardprotocol was niet haalbaar voor P. lacune omdat levende cellen niet in alle gevallen konden worden teruggevonden. Toen glycerol echter na het ontdooien werd verwijderd, overleefden cellen van alle onderzoeken. Eenvoudige methoden worden gepresenteerd voor de analyse van de beweeglijkheid van P. lacune, die kan worden gecombineerd met knock-out mutagenese om type IV pili of de rol van fotoreceptoren te onderzoeken. Deze testen verschillen van die van eencellige cyanobacteriën 19,20,21 en kunnen ook nuttig zijn voor andere Oscillatoria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

Cyanobacteriën zijn de focus van fundamenteel onderzoek en biotechnologische projecten waarin zonne-energie wordt gebruikt voor de productie van biomassa. Phormidium lacuna is een nieuw geïsoleerde filamenteuze cyanobacterie. Dit artikel beschrijft hoe nieuwe filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen. Het beschrijft ook hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit filamenten en hoe de genomen kunnen worden gesequenced. Hoewel transformatie is vastgesteld voor veel eencellige soorten, wordt het minder vaak gemeld voor filamenteuze cyanobacteriën. Een vereenvoudigde methode voor de natuurlijke transformatie van P. lacune wordt hier beschreven. P. lacuna is het enige lid van de orde Oscillatoriales waarvoor natuurlijke transformatie is vastgesteld. Dit artikel laat ook zien hoe natuurlijke transformatie wordt gebruikt om superfolder groen fluorescerend eiwit (sfGFP) tot expressie te brengen. Een endogene cpcB-promotor induceerde ongeveer 5 keer sterkere expressie dan cpc560, A2813 of psbA2-promotors van Synechocystis sp. PCC6803. Verder werd een methode voor de cryopreservatie van P. lacuna en Synechocystis sp.CPP 6803 vastgesteld en worden methoden beschreven voor het beoordelen van de beweeglijkheid in een vloeibaar medium en op agar- en plastic oppervlakken.

Volgens de bovengenoemde methoden werden 5 verschillende stammen van P. lacune geïsoleerd uit rotsspoelen en gesequenced (figuur 1 en tabel 1). Alle culturen waren steriel na ~1 jaar subculturering behalve P. lacuna HE10JO. Deze stam is nog steeds besmet met Marivirga atlantica, een mariene bacterie. Tijdens daaropvolgende Helgoland-excursies werden andere filamenteuze cyanobacteriën geïsoleerd uit rotspoelen, die verschillen van P. lacune</...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is een filamenteuze cyanobacterie die werd geïsoleerd uit mariene rotspoelen. Dit artikel beschrijft de isolatie van filamenten uit natuurlijke bronnen, DNA-extractie, genoomsequencing, natuurlijke transformatie, expressie van sfGFP, cryoconservatie en motiliteitsmethoden.

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Dit protocol beschrijft hoe filamenteuze cyanobacterie die tot oscillatoriales behoort, kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. Het laat ook zien hoe verschillende soorten beweging kunnen worden bestudeerd. Natuurlijke transformatie is de eenvoudigste transformatietechniek, als het werkt.Alleen DNA, cellen en groeimedium zijn nodig. Tot nu toe kon geen enkel ander oscillatoriales-lid worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. We hopen dat onze studies andere groepen stimuleren om andere oscillatoria te proberen.Maak voor transformatie een goede, gezond uitziende cultuur en een goede DNA-voorbereiding. Gebruik voor bewegingsstudies altijd een met echografie behandelde cultuur. De behandeling moet vers zijn.De procedure wordt gedemonstreerd door Nora Weber, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het inenten van 50 milliliter vloeibaar F2-medium in elk van de twee kolven van 250 milliliter met één milliliter P.lacuna filamenten uit een lopende cultuur. Kweek in wit licht onder agitatie gedurende ongeveer vijf dagen bij 25 graden Celsius.Homogeniseer na vijf dagen 100 milliliter P.lacuna celluspensie bij 10.000 RPM gedurende drie minuten en meet de optische dichtheid bij 750 nanometer. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 6.000 keer G.Verwijder het supernatant en suspensie de pellet in 800 microliter van de resterende vloeistof en extra F2 + medium. Neem acht F2+Bacto agar platen met 120 microgram per milliliter kanamycine en pipetteer 10 microgram DNA in het midden van elke agarplaat.Pipetteer onmiddellijk 100 microliter van de celsuspensie bovenop het DNA. Houd de agarplaat zonder deksel op de schone bank om de overtollige vloeistof te laten verdampen. Sluit het bord en kweek het twee dagen in wit licht bij 25 graden Celsius.Verdeel na twee dagen de filamenten van elke agarplaat over verschillende verse F2 + Bacto-agarplaten met 120 microgram per milliliter kanamycine met een inentingslus. Kweek de platen in wit licht bij 25 graden Celsius en controleer de culturen regelmatig onder een microscoop. Identificeer na 14 tot 28 dagen de dode bruinachtige filamenten en zoek naar getransformeerde filamenten onder de microscoop.De getransformeerde filamenten zien er gezond en groen uit en zijn anders dan de bulk van filamenten. Breng elk getransformeerd filament over in kolven van 50 milliliter met 10 milliliter F2+medium met 250 microgram per milliliter kanamycine. Kweek in wit licht bij 25 graden Celsius op een shaker en observeer de groei gedurende maximaal vier weken.Breng de filamenten terug naar het agarmedium dat 250 microgram per milliliter kanamycine bevat en wacht tot de filamenten zijn gegroeid. Verhoog vervolgens de kanamycineconcentratie opnieuw om de segregatie te versnellen. Voor GFP-expressie observeert u afzonderlijke filamenten met een fluorescentiemicroscoop bij 40X of 63X vergroting en legt een helder veld transmissiebeeld en een fluorescentiebeeld vast.Cultiveer P.lacune in F2-medium onder 50 RPM horizontale agitatie in wit licht gedurende ongeveer vijf dagen totdat de geschatte optische dichtheid bij 750 nanometer 0,35 wordt. Bewaar het monster bij vier graden Celsius. Homogeniseer de filamenten met ultrageluid gedurende één minuut bij maximaal vermogen en cyclus van één.Meet de optische dichtheid op 750 nanometer en breng acht milliliter van het medium met P.lacuna over in een petrischaaltje van zes centimeter. Wacht een paar minuten totdat het monster op kamertemperatuur is en bedek de petrischaal met cellofaanfolie. Plaats een microscoopglaasje op de X-Y tafel van een standaard microscoop met een camera.Schakel het microscooplicht in en verplaats een 4X of 10X objectief in het pad van het licht. Plaats vervolgens de petrischaal bovenop de dia. Pas afzonderlijke filamenten of filamentbundels aan met de X-, Y- en Z-bewegingen van de tafel.Observeer de bewegingen van afzonderlijke filamenten of bundels en registreer de bewegingen met een standaard microscoopcamera. Zorg ervoor dat de objectieflens de vloeistof niet raakt. Pipetteer 0,5 milliliter van een oplossing met P.lacuna op het Bacto agar-oppervlak van een petrischaaltje van zes centimeter.Laat de vloeistof het oppervlak binnendringen. Sluit na ongeveer 20 minuten de petrischaal en observeer de beweging van de filamenten op het oppervlak met behulp van een 4X of 10X objectief. Leg de timelapse-opnames vast met een oculaire camera en een minicomputersysteem.De filamenten moeten eerst met het oog worden scherpgesteld en vervolgens door de oculaire camera. Zorg ervoor dat het tijdsinterval tussen de volgende afbeeldingen vijf seconden tot één minuut is. Programmeer het Linux-script van de minicomputer om de timelapse-opname te regelen.Bereid LED-houders voor waar de vijf millimeter LED's zijn gemonteerd om een gebied van 20 millimeter vierkant van onder naar boven te bestralen. Meet en pas de LED-intensiteiten aan. Zorg ervoor dat de hele instelling zich in een donkere kamer of een gesloten, donkere container bevindt.Plaats acht milliliter van het medium met P.lacuna in een petrischaaltje van zes centimeter, sluit de petrischaal met het deksel en plaats deze op een LED-houder zodat de LED zich in het midden van de petrischaal bevindt. Maak na meestal twee dagen een foto van de petrischaal met een smartphonecamera die direct op de positie van de lichtbehandeling is gericht. Gebruik een houder en een wit vel als achtergrond om voor elke foto dezelfde afstand en lichtomstandigheden te garanderen.Open de ImageJ-software, klik op Bestand, Openen en selecteer het bestand. Klik vervolgens op Enter. Selecteer de rechte knop en druk op de linkermuisknop om een lijn te trekken van het ene uiteinde van de petrischaal naar het andere uiteinde.Zorg ervoor dat de lijn door het midden van de cirkel van filamenten loopt. Klik op Analyseren en meten om de lengte van de petrischaal te zien. Klik vervolgens op Profiel analyseren en plotten in het menu ImageJ.Schat een gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit buiten de cirkel en een andere gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit binnen de cirkel. Plaats de muisaanwijzer op de Y-positie tussen deze waarden om de X-waarden van beide zijden van de cirkel te schatten. Noteer beide waarden en bereken het verschil.Selecteer vervolgens de rechte knop en teken een lijn met de middelste maximale waarde van de pixelintensiteit. Klik ten slotte op Analyseren en vervolgens op Meten om de lengte van de binnenste celcirkel te krijgen. Integratie en segregatie van insert na de transformatie van P.lacuna met PAK1 wordt hier getoond.Een PCR-test met buitenste primers ongeveer een week na de transformatie heeft meestal twee banden op de elektroforesegel, één met de grootte van de wild-type band en één langzamer migrerende band die het inbrengen van de weerstandscassette aangeeft. Hier vertegenwoordigen de banen 1 tot en met 4 PCR-producten van filamenten na zeven dagen, 11 dagen, 14 dagen en 17 dagen van de isolatie van een resistent filament, en baan 5 vertegenwoordigt PCR-product van wild-type. In het zevendaagse monster is de insert aanwezig in een kleine fractie van de chromosomen.Deze fractie neemt toe tot 17 dagen, waar geen wild-type band zichtbaar is; dat wil zeggen, de segregatie is voltooid. Deze afbeelding vertegenwoordigt de vector pMH1 voor sfGHP-expressie onder controle van endogene phycocyanine bètapromotor. P.lacuna homologe sequentie, pUC19 vector backbone en insert met sfGFP en kanamycine resistentie worden hier getoond.In pMH1 wordt het sfGHP-gen drie priemgetallen van het phycocyanine bèta-gen geplaatst; daarom wordt het aangedreven door de endogene cpc bètapromotor. Fluorescentiebeelden van P.lacuna wild-type filamenten en na transformatie met PAK1, PAK2, PAK3 en pMH1 worden hier getoond. De expressie van sfGFP wordt aangestuurd door de cpc 560 promotor, de a2813 promotor, de psbA2S promotor, of de endogene cpc beta promotor.De hier gepresenteerde samengevoegde afbeeldingen tonen de beweeglijkheid van Phormidium lacune. De beweging op het agaroppervlak wordt hier weergegeven. Het tijdsinterval was één minuut.De beweging in het vloeibare medium wordt hier gepresenteerd. Het tijdsinterval was 10 seconden. Natuurlijke transformatie is een eenvoudige methode.Meng plasmide-DNA met een resistentiecassette in homologe sequenties met de cellen en laat de cellen groeien op een medium met antibiotica. Genen kunnen worden geïnactiveerd en eiwitten kunnen overexpressie krijgen. Dit is belangrijk voor elk fundamenteel onderzoek en voor biotechnische studies.In eencellige cyanobacteriën waar ook natuurlijke transformatie is vastgesteld, kwamen moleculaire studies over fotosynthese of fotoreceptoren, et cetera, aan bod.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Uitdrukking, Wasmiddel oplosbaar, en zuivering van een Membraan Transporter, de MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressie en zuivering van de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator Eiwit in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...