Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Unterstützt wurde die Arbeit vom Karlsruher Institut für Technologie.

1. Isolierung von der natürlichen Umwelt
HINWEIS: Grünalgen, Kieselalgen, fadenförmige Cyanobakterien und andere Mikroalgen können isoliert werden. Das Protokoll kann für alle Mikroalgenarten aus Gesteinsbecken verwendet werden, die unter Laborbedingungen wachsen. Filamentöse Cyanobakterien, die zu Oscillatoriales gehören, sind leicht an ihrer Bewegung und filamentösen Form zu erkennen. Die Spezies kann in einem halbreinen Zustand durch Genomsequenzierung oder 16S rRNA-S...

<ol>
	<li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories.">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li><li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria.">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515 (2019).</li><li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria.">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).</li><li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria:+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant.">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li><li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+cyanobacteria.">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li><li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803:+preparation+of+chromosomal+DNA.">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li><li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination.">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li><li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria.">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li><li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation.">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277.">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li><li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806.">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp,+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp.">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li><li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+(Subsection+V)+Fischerella+and+Chlorogloeopsis.">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li><li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying.">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454 (2020).</li><li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li><li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light.">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li><li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803.">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+artificial+seawater.">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTAB+DNA+extraction+buffer.">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li><li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., H&#228;der, D. -. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria.">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology &amp; Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li><li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion.">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii.">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li><li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp,+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin.">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li><li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997.">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li><li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902.">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li><li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco.">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li><li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells.">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li><li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria.">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).</li></ol>

Obwohl viele Stämme von Cyanobakterien aus den Kultursammlungen 32,33,34,35,36 verfügbar sind, besteht immer noch eine Nachfrage nach neuen Cyanobakterien aus der Wildnis, da diese Arten an bestimmte Eigenschaften angepasst sind. P. lacuna wurde aus Felsenbecken gesammelt und ist an Variationen der Salzkonzentrationen und der Temperatur<sup class="x...

Cyanobakterien sind prokaryotische Organismen, die die Photosynthese als Energiequelle nutzen 1,2. Die Forschung konzentriert sich zunehmend auf Cyanobakterienarten. Mehrere Cyanobakterien können mit DNA3 transformiert werden. Gene können bei diesen Arten ausgeschaltet oder überexprimiert werden. Die Transformation ist jedoch auf einige Arten beschränkt 4,5,6,7,8,9,10,11, und es kann schwierig sein, die Transformation in Stämmen aus Kultursammlungen oder der Wildnis 8 festzustellen. Stämme der fadenförmigen Art Phormidium lacuna (Abbildung 1) wurden aus marinen Gesteinsbecken isoliert, in denen die Umweltbedingungen wie Salzkonzentrationen oder Temperatur im Laufe der Zeit schwanken. Diese fadenförmigen Cyanobakterien können als Modellorganismen für die Ordnung Oscillatoriales12 verwendet werden, zu der sie gehören.
Während Versuchen, den Gentransfer durch Elektroporation zu testen 13,14, wurde festgestellt, dass P. lacuna durch natürliche Transformationtransformiert werden kann15. Dabei wird DNA auf natürliche Weise von einigen Zellen aufgenommen. Im Vergleich zu anderen Transformationsmethoden16,17 hat die natürliche Transformation den Vorteil, dass keine zusätzlichen Werkzeuge erforderlich sind, die das Verfahren erschweren könnten. Zum Beispiel erfordert die Elektroporation richtige Küvetten, intakte Drähte und die Auswahl der richtigen Spannung. P. lacuna ist derzeit das einzige Oscillatoriales-Mitglied, das anfällig für natürliche Transformation ist. Da das ursprüngliche Protokoll auf Elektroporationsprotokollen basiert, enthielt es immer noch mehrere Waschschritte, die möglicherweise unnötig sind. Verschiedene Ansätze wurden getestet, um das Protokoll zu vereinfachen, was zu dem hier vorgestellten Transformationsprotokoll führte.
Die Genomsequenz ist essentiell für weitere molekulare Studien, die auf Gen-Knockout oder Überexpression basieren. Obwohl Genomsequenzen mit Next-Generation-Sequenziermaschinen innerhalb kurzer Zeit erhalten werden können, kann die Extraktion von DNA schwierig sein und hängt von der Spezies ab. Mit P. lacuna wurden mehrere Protokolle getestet. Eine modifizierte Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-basierte Methode wurde dann etabliert, was zu einer akzeptablen Reinheit der DNA und DNA-Ausbeuten jedes Reinigungszyklus für die weitere Arbeit im Labor führte. Das Genom von fünf Stämmen könnte mit diesem Protokoll sequenziert werden. Der nächste logische Transformationsschritt bestand darin, die Proteinexpression in P. lacuna zu etablieren.
Das in diesem Protokoll als Markerprotein verwendete sfGFP kann mit jedem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Alle getesteten Promotoren konnten für den P. lacuna sfGFP-Ausdruck verwendet werden. Die zunehmende Anzahl von Belastungen, die sich aus der Transformation ergeben, hat dazu geführt, dass eine Methode zur Speicherung der Kulturen erforderlich ist. Solche Methoden sind für Escherichia coli und viele andere Bakterienetabliert 18. In Standardprotokollen werden Glycerinkulturen hergestellt, in flüssigem Stickstoff übertragen und bei -80 °C gelagert. Diese Methode erfordert nur wenige Schritte und ist für die Arten, für die sie etabliert ist, sehr zuverlässig. Das Standardprotokoll war für P. lacuna nicht durchführbar, da lebende Zellen nicht in allen Fällen wiederhergestellt werden konnten. Als jedoch Glycerin nach dem Auftauen entfernt wurde, überlebten die Zellen aller Studien. Für die Analyse der Motilität von P. lacuna werden einfache Methoden vorgestellt, die mit der Knockout-Mutagenese kombiniert werden können, um Typ-IV-Pili oder die Rolle von Photorezeptoren zu untersuchen. Diese Assays unterscheiden sich von denen der einzelligen Cyanobakterien 19,20,21 und können auch für andere Oszillatorien nützlich sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

Cyanobakterien stehen im Mittelpunkt der Grundlagenforschung und biotechnologischer Projekte, in denen Sonnenenergie für die Biomasseproduktion genutzt wird. Phormidium lacuna ist ein neu isoliertes filamentöses Cyanobakterium. Dieses Papier beschreibt, wie neue filamentöse Cyanobakterien aus marinen Gesteinsbecken isoliert werden können. Es beschreibt auch, wie DNA aus Filamenten extrahiert werden kann und wie die Genome sequenziert werden können. Obwohl die Transformation für viele einzellige Arten etabliert ist, wird sie für filamentöse Cyanobakterien seltener berichtet. Eine vereinfachte Methode zur natürlichen Umwandlung von P. lacuna wird hier beschrieben. P. lacuna ist das einzige Mitglied der Ordnung Oscillatoriales, für das eine natürliche Transformation etabliert ist. Dieses Papier zeigt auch, wie die natürliche Transformation verwendet wird, um Superfolder Green Fluorescent Protein (sfGFP) zu exprimieren. Ein endogener cpcB-Promotor induzierte eine etwa 5-mal stärkere Expression als cpc560-, A2813- oder psbA2-Promotoren von Synechocystis sp. PCC6803. Weiterhin wurde ein Verfahren zur Kryokonservierung von P. lacuna und Synechocystis sp.CPP 6803 etabliert und Verfahren zur Beurteilung der Motilität in einem flüssigen Medium und auf Agar- und Kunststoffoberflächen beschrieben.

Nach den oben genannten Methoden wurden 5 verschiedene Stämme von P. lacuna aus Gesteinsbecken isoliert und sequenziert (Abbildung 1 und Tabelle 1). Alle Kulturen waren nach ~ 1 Jahr Subkulturation steril, mit Ausnahme von P. lacuna HE10JO. Dieser Stamm ist immer noch mit Marivirga atlantica, einem Meeresbakterium, kontaminiert. Bei anschließenden Helgoland-Exkursionen wurden weitere fadenförmige Cyanobakterien aus Gesteinsbecken isoliert, die s...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna ist ein fadenförmiges Cyanobakterium, das aus marinen Felsbecken isoliert wurde. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Filamenten aus natürlichen Quellen, DNA-Extraktion, Genomsequenzierung, natürliche Transformation, Expression von sfGFP, Kryokonservierung und Motilitätsmethoden.

Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie filamentöses Cyanobakterium, das zu Oszillatorien gehört, durch natürliche Umwandlung umgewandelt werden kann. Es zeigt auch, wie verschiedene Arten von Bewegung untersucht werden können. Natürliche Transformation ist die einfachste Transformationstechnik, wenn sie funktioniert.Es werden nur DNA, Zellen und Wachstumsmedium benötigt. Bisher konnte kein anderes oscillatoriales Mitglied durch natürliche Transformation transformiert werden. Wir hoffen, dass unsere Studien andere Gruppen dazu anregen, andere Oszillatorien auszuprobieren.Für die Transformation machen Sie eine gute, gesund aussehende Kultur und eine gute DNA-Vorbereitung. Verwenden Sie für Bewegungsstudien immer eine ultraschallbehandelte Kultur. Die Behandlung sollte frisch sein.Das Verfahren wird Nora Weber, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Beimpfung von 50 Millilitern flüssigem F2-Medium in jeden der beiden 250-Milliliter-Flaschen mit einem Milliliter P.lacuna-Filamenten aus einer Laufkultur. In weißem Licht unter Bewegung für etwa fünf Tage bei 25 Grad Celsius kultivieren.Nach fünf Tagen 100 Milliliter P.lacuna-Zellsuspension bei 10.000 U/min für drei Minuten homogenisieren und die optische Dichte bei 750 Nanometern messen. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 15 Minuten bei 6.000 mal G.Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern der verbleibenden Flüssigkeit und zusätzlichem F2 + -Medium. Nehmen Sie acht F2 + Bacto-Agarplatten mit 120 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und pipettieren Sie 10 Mikrogramm DNA in die Mitte jeder Agarplatte.Pipettieren Sie sofort 100 Mikroliter der Zellsuspension auf die DNA. Bewahren Sie die Agarplatte ohne Deckel auf der sauberen Bank auf, damit die überschüssige Flüssigkeit verdunsten kann. Schließen Sie den Teller und kultivieren Sie ihn zwei Tage lang in weißem Licht bei 25 Grad Celsius.Nach zwei Tagen verteilen Sie die Filamente jeder Agarplatte auf mehrere frische F2 + Bacto-Agarplatten, die 120 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin mit einer Impfschleife enthalten. Kultivieren Sie die Platten in weißem Licht bei 25 Grad Celsius und überprüfen Sie die Kulturen regelmäßig unter dem Mikroskop. Identifizieren Sie nach 14 bis 28 Tagen die toten bräunlichen Filamente und suchen Sie unter dem Mikroskop nach transformierten Filamenten.Die transformierten Filamente sehen gesund und grün aus und unterscheiden sich von der Masse der Filamente. Übertragen Sie jedes einzelne transformierte Filament in 50-Milliliter-Flaschen mit 10 Millilitern F2 + Medium mit 250 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. In weißem Licht bei 25 Grad Celsius auf einem Shaker kultivieren und das Wachstum bis zu vier Wochen beobachten.Übertragen Sie die Filamente zurück in das Agarmedium, das 250 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält, und warten Sie, bis die Filamente wachsen. Erhöhen Sie dann die Kanamycinkonzentration erneut, um die Segregation zu beschleunigen. Für die GFP-Expression werden einzelne Filamente mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher oder 63-facher Vergrößerung beobachtet und ein Hellfeld-Transmissionsbild und ein Fluoreszenzbild aufgenommen.Kultivieren Sie P.lacuna in F2-Medium unter 50 U / min horizontaler Bewegung in weißem Licht für etwa fünf Tage, bis die geschätzte optische Dichte bei 750 Nanometern 0,35 beträgt. Lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius. Homogenisieren Sie die Filamente mit Ultraschall für eine Minute bei maximaler Leistung und Zyklus von einem.Messen Sie die optische Dichte bei 750 Nanometern und übertragen Sie acht Milliliter des Mediums, das P.lacuna enthält, in eine sechs Zentimeter große Petrischale. Warten Sie einige Minuten, bis die Probe Raumtemperatur erreicht hat und bedecken Sie dann die Petrischale mit Zellophanfolie. Legen Sie einen Objektträger auf den X-Y-Tisch eines Standardmikroskops mit einer Kamera.Schalten Sie das Mikroskoplicht ein und bewegen Sie ein 4X- oder 10X-Objektiv in den Weg des Lichts. Legen Sie dann die Petrischale auf die Rutsche. Passen Sie einzelne Filamente oder Filamentbündel durch die X-, Y- und Z-Bewegungen des Tisches an.Beobachten Sie die Bewegungen einzelner Filamente oder Bündel und zeichnen Sie die Bewegungen mit einer Standard-Mikroskopkamera auf. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse die Flüssigkeit nicht berührt. Pipettieren Sie 0,5 Milliliter einer Lösung, die P.lacuna enthält, auf der Bacto-Agar-Oberfläche einer sechs Zentimeter großen Petrischale.Lassen Sie die Flüssigkeit in die Oberfläche eindringen. Schließen Sie nach etwa 20 Minuten die Petrischale und beobachten Sie die Bewegung der Filamente auf der Oberfläche mit einem 4X- oder 10X-Objektiv. Erfassen Sie die Zeitrafferaufnahmen mit einer Okularkamera und einem Minicomputersystem.Die Filamente müssen zuerst mit dem Auge und dann durch die Augenkamera fokussiert werden. Stellen Sie sicher, dass das Zeitintervall zwischen den nachfolgenden Bildern fünf Sekunden bis eine Minute beträgt. Programmieren Sie das Linux-Skript des Minicomputers, um die Zeitrafferaufzeichnung zu steuern.Bereiten Sie LED-Halter vor, an denen die Fünf-Millimeter-LEDs montiert sind, um eine Fläche von 20 Millimetern im Quadrat von unten nach oben zu bestrahlen. Messen und justieren Sie die LED-Intensitäten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Umgebung in einem dunklen Raum oder einem geschlossenen, dunklen Behälter befindet.Legen Sie acht Milliliter des Mediums, das P.lacuna enthält, in eine sechs Zentimeter große Petrischale, schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und legen Sie sie auf eine LED-Halterung, so dass sich die LED in der Mitte der Petrischale befindet. Nehmen Sie nach typischerweise zwei Tagen ein Bild der Petrischale mit einer Smartphone-Kamera auf, die direkt auf die Position der Lichtbehandlung gerichtet ist. Verwenden Sie eine Halterung und ein weißes Blatt als Hintergrund, um für jedes Bild den gleichen Abstand und die gleichen Lichtverhältnisse zu gewährleisten.Öffnen Sie die ImageJ-Software, klicken Sie auf Datei, Öffnen und wählen Sie die Datei aus. Klicken Sie dann auf Enter. Wählen Sie die gerade Taste und drücken Sie die linke Maustaste, um eine Linie von einem Ende der Petrischale zum gegenüberliegenden Ende zu zeichnen.Stellen Sie sicher, dass die Leitung durch die Mitte des Kreises der Filamente verläuft. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um die Länge der Petrischale anzuzeigen. Klicken Sie dann im Menü ImageJ auf Analyze and Plot Profile.Schätzen Sie einen Durchschnittswert für die Pixelintensität außerhalb des Kreises und einen weiteren Durchschnittswert für die Pixelintensität innerhalb des Kreises. Zeigen Sie mit der Maus auf die Y-Position zwischen diesen Werten, um die X-Werte beider Seiten des Kreises zu schätzen. Notieren Sie sich beide Werte und berechnen Sie die Differenz.Wählen Sie dann die gerade Schaltfläche und zeichnen Sie eine Linie im mittleren bis maximalen Wert der Pixelintensität. Klicken Sie abschließend auf Analysieren und dann auf Messen, um die Länge des inneren Zellkreises abzurufen. Die Integration und Trennung von Insert nach der Transformation von P.lacuna mit PAK1 ist hier dargestellt.Ein PCR-Test mit äußeren Primern etwa eine Woche nach der Transformation hat typischerweise zwei Banden auf dem Elektrophoresegel, eine mit der Größe des Wildtypbandes und ein langsameres Migrationsband, das das Einsetzen der Widerstandskassette anzeigt. Hier stellen die Bahnen 1 bis 4 PCR-Produkte von Filamenten nach sieben Tagen, 11 Tagen, 14 Tagen und 17 Tagen der Isolierung eines resistenten Filaments dar, und Lane 5 repräsentiert PCR-Produkt des Wildtyps. In der siebentägigen Probe ist der Einsatz in einem kleinen Bruchteil der Chromosomen vorhanden.Dieser Anteil erhöht sich bis zu 17 Tagen, wo kein Wildtypband sichtbar ist; das heißt, die Segregation ist vollständig. Dieses Bild stellt den Vektor pMH1 für die sfGHP-Expression unter der Kontrolle des endogenen Phycocyanin-Beta-Promotors dar. P.lacuna homologe Sequenz, pUC19-Vektor-Backbone und Insert mit sfGFP- und Kanamycin-Resistenz sind hier dargestellt.In pMH1 wird das sfGHP-Gen drei Primzahlen des Phycocyanin-Beta-Gens platziert; daher wird es vom endogenen cpc-Beta-Promotor angetrieben. Fluoreszenzbilder von P.lacuna-Wildtyp-Filamenten und nach Transformation mit PAK1, PAK2, PAK3 und pMH1 sind hier gezeigt. Der Ausdruck von sfGFP wird vom cpc 560-Promotor, dem a2813-Promotor, dem psbA2S-Promotor oder dem endogenen cpc-Beta-Promotor gesteuert.Die hier vorgestellten zusammengeführten Bilder zeigen die Motilität von Phormidium lacuna. Die Bewegung auf der Agaroberfläche wird hier gezeigt. Das Zeitintervall betrug eine Minute.Die Bewegung im flüssigen Medium wird hier dargestellt. Das Zeitintervall betrug 10 Sekunden. Natürliche Transformation ist eine einfache Methode.Mischen Sie einfach Plasmid-DNA mit einer Resistenzkassette in homologen Sequenzen mit den Zellen und lassen Sie die Zellen auf einem Medium mit Antibiotika wachsen. Gene können inaktiviert und Proteine überexprimiert werden. Dies ist wichtig für jede Grundlagenforschung und für biotechnische Studien.In einzelligen Cyanobakterien, bei denen auch die natürliche Transformation festgestellt wird, wurden molekulare Studien zur Photosynthese oder zu Photorezeptoren usw. durchgeführt.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...