Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

העבודה נתמכה על ידי המכון הטכנולוגי של קרלסרוהר.

1. בידוד מהסביבה הטבעית
הערה: ניתן לבודד אצות ירוקות, דיאטומים, ציאנובקטריה נימה ומיקרו-אצות אחרות. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מיני מיקרו-אלגה מבורות סלעים הגדלים בתנאי מעבדה. ציאנובקטריה נימה השייכת לתנודות ניתן לזהות בקלות על ידי תנועתם וצורתם החוטית. ניתן לזהות ?...

<ol>
	<li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories.">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li><li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria.">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515 (2019).</li><li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria.">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).</li><li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria:+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant.">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li><li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+cyanobacteria.">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li><li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803:+preparation+of+chromosomal+DNA.">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li><li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination.">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li><li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria.">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li><li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation.">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277.">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li><li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806.">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp,+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp.">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li><li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+(Subsection+V)+Fischerella+and+Chlorogloeopsis.">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li><li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying.">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454 (2020).</li><li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li><li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light.">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li><li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803.">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+artificial+seawater.">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTAB+DNA+extraction+buffer.">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li><li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., H&#228;der, D. -. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria.">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology &amp; Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li><li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion.">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii.">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li><li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp,+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin.">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li><li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997.">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li><li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902.">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li><li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco.">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li><li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells.">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li><li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria.">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).</li></ol>

למרות שזנים רבים של ציאנובקטריה זמינים מאוספי תרביות 32,33,34,35,36, עדיין יש ביקוש לציאנובקטריה חדשה מהטבע מכיוון שמינים אלה מותאמים לתכונות ספציפיות. P. lacuna נאסף מבורות סלעים והוא מותאם לווריאציות ש...

ציאנובקטריה הם אורגניזמים פרוקריוטים המשתמשים בפוטוסינתזה כמקור אנרגיה 1,2. המחקר מתמקד יותר ויותר במינים ציאנובקטריאליים. ניתן לשנות מספר ציאנובקטריה באמצעות DNA3. גנים יכולים להיות מופלים או ביטוי יתר במינים אלה. עם זאת, השינוי מוגבל למינים בודדים 4,5,6,7,8,9,10,11, וזה יכול להיות קשה לבסס טרנספורמציה בזנים מאוספי תרבויות או 8 בטבע. זנים של המין הנימה Phormidium lacuna (איור 1) בודדו מבורות סלעים ימיים, שבהם התנאים הסביבתיים, כגון ריכוזי מלחים או טמפרטורה, משתנים עם הזמן. ציאנובקטריה נימה זו יכולה לשמש כאורגניזמים לדוגמה לסדר Oscillatoriales12 שאליו הם שייכים.
במהלך ניסויים שבדקו העברת גנים על ידי אלקטרופורציה13,14 נמצא כי P. lacuna יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית15. בתהליך זה, הדנ"א נקלט באופן טבעי על ידי תאים מסוימים. בהשוואה לשיטות אחרות של טרנספורמציה16,17, לטרנספורמציה טבעית יש יתרון בכך שאינה דורשת כלים נוספים שעלולים לסבך את ההליך. לדוגמה, אלקטרופורציה דורשת cuvettes תקין, חוטים שלמים, ובחירת המתח הנכון. P. lacuna הוא כיום חבר המתנדים היחיד הרגיש לטרנספורמציה טבעית. מכיוון שהפרוטוקול המקורי מבוסס על פרוטוקולי אלקטרופורציה, הוא עדיין כלל מספר שלבי כביסה שעשויים להיות מיותרים. גישות שונות נבדקו כדי לפשט את הפרוטוקול, מה שהוביל לפרוטוקול הטרנספורמציה שהוצג כאן.
רצף הגנום חיוני למחקרים מולקולריים נוספים המבוססים על נוקאאוט גנים או ביטוי יתר. למרות שניתן להשיג רצפי גנום עם מכונות ריצוף מהדור הבא תוך תקופות קצרות, מיצוי הדנ"א יכול להיות קשה ותלוי במין. עם P. lacuna נבדקו מספר פרוטוקולים. לאחר מכן הוקמה שיטה שונה המבוססת על צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB), וכתוצאה מכך נוצרה טוהר מקובל של דנ"א ותפוקות DNA של כל מחזור טיהור להמשך העבודה במעבדה. ניתן לרצף את הגנום של חמישה זנים באמצעות פרוטוקול זה. שלב הטרנספורמציה ההגיונית הבא היה לבסס ביטוי חלבונים ב-P. lacuna.
ניתן לזהות את ה-sfGFP המשמש כחלבון סמן בפרוטוקול זה באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל היזמים שנבדקו יכלו לשמש לביטוי P. lacuna sfGFP. המספר ההולך וגדל של זנים הנובעים מטרנספורמציה הביא לצורך בשיטה לאחסון התרבויות. שיטות כאלה הוקמו עבור Escherichia coli וחיידקים רבים אחרים18. בפרוטוקולים סטנדרטיים, תרביות גליצרול מוכנות, מועברות בחנקן נוזלי ומאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שיטה זו דורשת רק כמה צעדים והיא אמינה מאוד עבור אותם מינים שעבורם היא הוקמה. הפרוטוקול הסטנדרטי לא היה אפשרי עבור P. lacuna מכיוון שלא ניתן היה לשחזר תאים חיים בכל המקרים. עם זאת, כאשר הגליצרול הוסר לאחר ההפשרה, תאים של כל הניסויים שרדו. שיטות פשוטות מוצגות לניתוח תנועתיות של P. lacuna, אשר ניתן לשלב עם מוטגנזה נוקאאוט כדי לחקור סוג IV pili או את התפקיד של photoreceptors. מבחנים אלה שונים מאלו של ציאנובקטריה חד-תאית 19,20,21 ויכולים להיות שימושיים גם עבור תנודות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

ציאנובקטריה הם המוקד של מחקר בסיסי ופרויקטים ביוטכנולוגיים שבהם אנרגיה סולארית מנוצלת לייצור ביומסה. פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד לאחרונה. מאמר זה מתאר כיצד ניתן לבודד ציאנובקטריה נימה חדשה מבורות סלעים ימיים. הוא גם מתאר כיצד ניתן לחלץ דנ"א מחוטים וכיצד ניתן לרצף את הגנומים. אף על פי שהטרנספורמציה נוצרת עבור מינים חד-תאיים רבים, היא מדווחת בתדירות נמוכה יותר על ציאנובקטריה נימה. שיטה פשוטה לטרנספורמציה הטבעית של P. lacuna מתוארת כאן. P. lacuna הוא החבר היחיד במסדר מתנדים שעבורו נוצרת טרנספורמציה טבעית. מאמר זה גם מראה כיצד טרנספורמציה טבעית משמשת לביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בעל קיפול יתר (sfGFP). מקדם cpcB אנדוגני גרם לביטוי חזק בערך פי 5 מאשר מקדמי cpc560, A2813 או psbA2 מ- Synechocystis sp. PCC6803. יתר על כן, הוקמה שיטה לשמירת ההקפאה של P. lacuna ו - Synechocystis sp.CPP 6803, ותוארו שיטות להערכת תנועתיות בתווך נוזלי ועל משטחי אגר ופלסטיק.

בעקבות השיטות הנ"ל, 5 זנים שונים של P. lacuna בודדו מבורות סלעים ורוצפו (איור 1 וטבלה 1). כל התרבויות היו סטריליות לאחר ~ שנה אחת של תת-תרבות למעט P. lacuna HE10JO. זן זה עדיין מזוהם ב-Marivirga atlantica, חיידק ימי. במהלך טיולי הלגולנד הבאים, ציאנובקטריה נימה אחרים בודדו מברי...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ציאנובקטריום נימה השייך למתנדים יכול להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית. הוא גם מראה כיצד ניתן לחקור סוגים שונים של תנועה. טרנספורמציה טבעית היא טכניקת הטרנספורמציה הפשוטה ביותר, אם היא עובדת.רק דנ"א, תאים ואמצעי גדילה נדרשים. עד כה, אף חבר אחר במערכת המתנדים לא יכול היה להשתנות על ידי טרנספורמציה טבעית. אנו מקווים שהמחקרים שלנו יעוררו קבוצות אחרות לנסות תנודות אחרות.לשם שינוי, הכינו תרבות טובה ובריאה למראה והכנת דנ"א טובה. עבור מחקרי תנועה, השתמש תמיד בתרבית שטופלה באולטרסאונד. הטיפול צריך להיות טרי.מי שתדגים את ההליך תהיה נורה ובר, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל על ידי חיסון 50 מיליליטר נוזלי F2 בינוני לתוך כל אחד משני צלוחיות 250 מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוטי P.lacuna מתרבית ריצה. מטפחים באור לבן תחת תסיסה במשך כחמישה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.לאחר חמישה ימים, הומוגניזציה של 100 מיליליטרים של תרחיף תאי P.lacuna ב-10, 000 סל"ד במשך שלוש דקות ומדוד את הצפיפות האופטית ב-750 ננומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 15 דקות ב-6, 000 פעמים G.הסר את הסופרנטנט והשעה את הכדור ב-800 מיקרוליטרים של הנוזל הנותר ותוספת F2+medium. קחו שמונה צלחות אגר F2+Bacto המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין ופיפטה 10 מיקרוגרם של דנ"א באמצע כל צלחת אגר.מיד פיפט 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא על גבי הדנ"א. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לנוזל העודף להתאדות. סגרו את הצלחת וטפחו אותה באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים.לאחר יומיים, פזרו את החוטים של כל צלחת אגר על מספר צלחות אגר F2+Bacto טריות המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין עם לולאת חיסון. טפחו את הלוחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע תחת מיקרוסקופ. לאחר 14 עד 28 ימים, זהו את החוטים החומים המתים וחפשו חוטים שעברו טרנספורמציה מתחת למיקרוסקופ.החוטים שעברו טרנספורמציה נראים בריאים וירוקים ושונים מרוב החוטים. העבר כל נימה אחת שהתהפכה לבקבוקי 50 מיליליטר עם 10 מיליליטרים של F2+ בינוני עם 250 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין. מטפחים באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר וצפו בצמיחה עד ארבעה שבועות.מעבירים את החוטים בחזרה למדיום האגר המכיל 250 מיקרוגרם למיליליטר קנאמיצין ומחכים שהחוטים יגדלו. לאחר מכן, הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה. עבור ביטוי GFP, מתבונן בחוטים בודדים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 או 63X ולוכד תמונת שידור בשדה בהיר ותמונת פלואורסצנציה.טפחו P.lacuna ב-F2 בינוני מתחת ל-50 סל"ד תסיסה אופקית באור לבן במשך כחמישה ימים עד שהצפיפות האופטית המשוערת ב-750 ננומטר תהפוך ל-0.35. אחסן את המדגם בארבע מעלות צלזיוס. הומוגניזציה של החוטים עם אולטרסאונד למשך דקה אחת בעוצמה מקסימלית ומחזור של אחד.מדוד את הצפיפות האופטית ב-750 ננומטר והעביר שמונה מיליליטרים של המדיום המכיל P.lacuna לתוך צלחת פטרי של שישה סנטימטרים. המתן מספר דקות עד שהדגימה תגיע לטמפרטורת החדר ולאחר מכן כיסה את צלחת פטרי בנייר כסף צלופן. הניחו שקופית מיקרוסקופ על טבלת X-Y של מיקרוסקופ סטנדרטי עם מצלמה.הפעילו את אור המיקרוסקופ והזיזו מטרה של פי 4 או 10X לנתיב האור. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על גבי המגלשה. התאם חוטים בודדים או צרורות נימה לפי תנועות X, Y ו-Z של הטבלה.שימו לב לתנועות של חוטים בודדים או צרורות ותעדו את התנועות באמצעות מצלמת מיקרוסקופ סטנדרטית. ודא שהעדשה האובייקטיבית אינה נוגעת בנוזל. פיפטה 0.5 מיליליטר של תמיסה המכילה P.lacuna על פני השטח של בקט אגר של צלחת פטרי של שישה סנטימטרים.אפשרו לנוזל להיכנס לפני השטח. לאחר כ-20 דקות, סגרו את צלחת פטרי והתבוננו בתנועת החוטים על פני השטח באמצעות מטרה של 4X או 10X. צלם את הקלטות קיטועי הזמן באמצעות מצלמת עיניים ומערכת מחשב קטנה.החוטים חייבים להיות ממוקדים תחילה על ידי העין ולאחר מכן דרך המצלמה העין. ודא שמרווח הזמן בין התמונות הבאות הוא חמש שניות עד דקה אחת. תכנת את סקריפט הלינוקס של המיני-מחשב כדי לשלוט בהקלטת קיטועי הזמן.הכן מחזיקי LED שבהם נוריות ה- LED של חמישה מילימטרים מותקנות כדי להקרין שטח של 20 מילימטרים מרובעים מלמטה למעלה. מדוד והתאם את עוצמות ה-LED. ודאו שהסביבה כולה נמצאת בחדר חשוך או במיכל סגור וחשוך.מניחים שמונה מיליליטרים של המדיום המכיל P.lacuna לתוך צלחת פטרי של שישה סנטימטרים, סוגרים את צלחת הפטרי עם המכסה, ומניחים אותה על מחזיק LED כך שהנורית נמצאת במרכז צלחת הפטרי. לאחר יומיים בדרך כלל, צלמו תמונה של צלחת פטרי עם מצלמת סמארטפון המכוונת ישירות למיקום הטיפול באור. השתמש במחזיק ובגיליון לבן כרקע כדי להבטיח את אותו מרחק ותנאי תאורה עבור כל תמונה.פתח את תוכנת ImageJ, לחץ על קובץ, פתח ובחר את הקובץ. לאחר מכן, לחץ על Enter. בחר את הכפתור הישר ולחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו מקצה אחד של צלחת פטרי לקצה הנגדי.ודא שהקו עובר דרך מרכז מעגל החוטים. לחץ על נתח ומדוד כדי לראות את אורך צלחת הפטרי. לאחר מכן, לחץ על ניתוח ופרופיל עלילה בתפריט ImageJ.הערך ערך ממוצע עבור עוצמת הפיקסלים מחוץ למעגל וערך ממוצע נוסף עבור עוצמת הפיקסל בתוך העיגול. כוון את העכבר למיקום Y בין ערכים אלה כדי להעריך את ערכי X משני צידי המעגל. שים לב לשני הערכים וחשב את ההפרש.לאחר מכן בחר בלחצן הישר וצייר קו בערך האמצעי-מקסימלי של עוצמת הפיקסל. לבסוף, לחץ על נתח ולאחר מכן מדוד כדי לקבל את אורך מעגל התא הפנימי. אינטגרציה והפרדה של הוספה לאחר הטרנספורמציה של P.lacuna עם PAK1 מוצגת כאן.בדיקת PCR עם פריימרים חיצוניים כשבוע לאחר הטרנספורמציה כוללת בדרך כלל שני פסים על ג'ל האלקטרופורזה, אחד בגודל של פס מסוג פראי, ורצועה נודדת איטית יותר אחת המציינת את החדרת קלטת ההתנגדות. כאן, נתיבים 1 עד 4 מייצגים תוצרי PCR של חוטים לאחר שבעה ימים, 11 ימים, 14 ימים ו-17 ימים של בידוד של נימה עמידה, ומסלול 5 מייצג תוצר PCR מסוג פראי. במדגם של שבעה ימים, התוספת נמצאת בחלק קטן של הכרומוזומים.שבר זה גדל עד 17 יום, שבהם לא נראה להקה מסוג פראי;כלומר, ההפרדה הושלמה. תמונה זו מייצגת את הווקטור pMH1 עבור ביטוי sfGHP תחת שליטה של מקדם בטא של פיקוציאנין אנדוגני. הרצף ההומולוגי P.lacuna, עמוד השדרה הווקטורי pUC19, וההוספה עם sfGFP ועמידות קנאמיצין מוצגים כאן.ב-pMH1, הגן sfGHP ממוקם בשלושה ראשונים של גן הבטא phycocyanin;ולכן, הוא מונע על ידי מקדם הבטא האנדוגני cpc. תמונות פלואורסצנטיות של חוטי בר מסוג P.lacuna ולאחר טרנספורמציה עם PAK1, PAK2, PAK3 ו- pMH1 מוצגות כאן. הביטוי של sfGFP מונע על ידי מקדם cpc 560, מקדם a2813, מקדם psbA2S, או מקדם ביתא cpc אנדוגני.התמונות הממוזגות המוצגות כאן מראות את תנועתיות הפורמידיום לקונה. התנועה על פני האגר מוצגת כאן. מרווח הזמן היה דקה אחת.התנועה במדיום הנוזלי מוצגת כאן. מרווח הזמן היה 10 שניות. טרנספורמציה טבעית היא שיטה פשוטה.פשוט ערבבו דנ"א פלסמידי עם קלטת עמידות ברצפים הומולוגיים עם התאים ותנו לתאים לגדול על מדיום עם אנטיביוטיקה. גנים יכולים להיות מושתקים וחלבונים יכולים להיות ביטוי יתר. זה חשוב לכל מחקר בסיסי ולמחקרים ביוטכניים.בציאנובקטריה חד-תאית, שבה נוצרת גם טרנספורמציה טבעית, טופלו מחקרים מולקולריים על פוטוסינתזה או פוטורצפטורים וכו'.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...