Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

この研究はカールスルーハー工科大学の支援を受けた。

1. 自然環境からの隔離
注:緑藻、珪藻、糸状シアノバクテリア、および他の微細藻類を単離することができる。このプロトコルは、実験室条件下で成長するロックプールからの任意の微細藻類種に使用することができる。オシラトリアル属に属する糸状シアノバクテリアは、その動きや糸状形状によって容易に認識することができる。種は、ゲノムシーケンシ?...

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PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. 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シアノバクテリアの多くの株が培養コレクション32、33、34、35、36から入手可能であるが、これらの種は特定の特性に適応しているため、野生からの新しいシアノバクテリアの需要が依然としてある。P. lacunaは岩溜まりから採取され、塩濃度および温度<sup class="xref...

シアノバクテリアは、光合成をエネルギー源として利用する原核生物である1,2。研究はますますシアノバクテリア種に焦点を当てています。いくつかのシアノバクテリアをDNA3で形質転換することができる。遺伝子は、これらの種においてノックアウトまたは過剰発現され得る。しかしながら、形質転換は、数種4、5、6、7、8、9、10、11に限定されており、培養コレクションまたは野生8からの系統において形質転換を確立することは困難であり得る。糸状種Phormidium lacuna(図1)の菌株は、塩濃度や温度などの環境条件が経時的に変動する海洋岩溜まりから単離された。これらの糸状シアノバクテリアは、それらが属する秩序振動子12のモデル生物として用いることができる。
エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試験する試験中13、14は、P.ラクナが天然形質転換によって形質転換され得ることを見出した15。このプロセスでは、DNAはいくつかの細胞によって自然に取り込まれます。変換の他の方法16,17と比較して、自然な変換は、手順を複雑にする可能性のある追加のツールを必要としないという利点を有する。たとえば、エレクトロポレーションには、適切なキュベット、無傷のワイヤ、および適切な電圧の選択が必要です。P. lacunaは現在、自然変換の影響を受けやすい唯一のオシラトリアルメンバーです。元のプロトコルはエレクトロポレーションプロトコルに基づいているため、不要な洗浄ステップがいくつか含まれていました。プロトコルを簡素化するためにさまざまなアプローチがテストされ、ここで紹介する変換プロトコルが導かれました。
ゲノム配列は、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現に基づくさらなる分子研究に不可欠である。ゲノム配列は次世代のシーケンシングマシンで短期間で取得できますが、DNAの抽出は難しく、種によっても異なります。 P. lacunaでは、いくつかのプロトコルがテストされました。その後、修飾セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)ベースの方法が確立され、実験室での継続的な作業のために、各精製サイクルのDNAおよびDNA収率の許容可能な純度が得られました。5つの株のゲノムをこのプロトコールで配列決定することができた。次の論理変換ステップは、 P. lacunaにおけるタンパク質発現を確立することでした。
このプロトコールにおいてマーカータンパク質として使用されるsfGFPは、任意の蛍光顕微鏡で検出することができる。試験された全てのプロモーターは、P. lacuna sfGFP発現に使用できた。形質転換から生じる株数の増加は、培養物を保存する方法の必要性をもたらした。このような方法は、大腸菌および他の多くの細菌について確立されている18。標準的なプロトコールでは、グリセロール培養物を調製し、液体窒素中で移し、−80°Cで保存する。 この方法はほんの数ステップしか必要とせず、それが確立された種にとって高い信頼性があります。P. lacunaでは、生細胞をすべてのケースで回収できなかったため、標準プロトコルは実現不可能でした。しかしながら、融解後にグリセロールを除去した場合、全ての試験の細胞は生存した。P. lacunaの運動性の分析のために簡単な方法が提示され、これはIV型ピリまたは光受容体の役割を調査するためにノックアウト突然変異誘発と組み合わせることができる。これらのアッセイは、単細胞シアノバクテリア19、20、21のアッセイとは異なり、他の発振器にも有用であり得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

シアノバクテリアは、太陽エネルギーをバイオマス生産に利用する基礎研究およびバイオテクノロジープロジェクトの焦点です。ホルミジウムラクナは、新たに単離された糸状シアノバクテリウムである。この論文では、新しい糸状シアノバクテリアを海洋の岩盤プールから単離する方法について説明します。また、フィラメントからDNAを抽出する方法と、ゲノムを配列決定する方法についても説明します。形質転換は多くの単細胞種で確立されているが、糸状シアノバクテリアについてはあまり報告されていない。P. lacunaの自然な変換のための単純化された方法がここで説明されています。P. lacunaは、自然変換が確立されているオシラトリアルの秩序の唯一のメンバーです。この論文はまた、スーパーフォルダ緑色蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するために自然形質転換がどのように使用されるかを示す。内因性cpcBプロモーターは、シネコシスティス・エスピーPCC6803由来のcpc560、A2813、またはpsbA2プロモーターよりも約5倍強い発現を誘導した。さらに、P. lacunaおよびSynechocystis sp.CPP 6803の凍結保存のための方法が確立され、液体培地中および寒天およびプラスチック表面上の運動性を評価するための方法が記載されている。

上記の方法に従って、 P. lacuna の5つの異なる株を岩溜まりから単離し、配列決定した(図 1および 表1)。全ての培養物は、 P. lacuna HE10JOを除く継代培養の〜1年後に無菌であった。この株はまだ海洋細菌である マリビルガ・アトランティカで汚染されています。その後のヘルゴランド遠足の間に、他の糸状シアノバクテリアが岩のプールか?...

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Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

ホルミジウムラクナは、 海洋の岩溜まりから単離された糸状シアノバクテリウムである。この記事では、天然源からのフィラメントの単離、DNA抽出、ゲノムシーケンシング、自然形質転換、sfGFPの発現、凍結保存、および運動性法について説明します。

糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

このプロトコルは、オシラトリアルに属する糸状シアノバクテリアが自然変換によってどのように変換され得るかを記述している。また、さまざまな種類の運動をどのように研究できるかも示しています。自然変換は、それが機能する場合、最も単純な変換手法です。DNA、細胞、および増殖培地のみが必要です。これまでのところ、他のオシレーター列メンバーは自然変換によって変換できませんでした。私たちの研究が、他のグループが他のオシレーターを試すように刺激することを願っています。形質転換のためには、健康的で見栄えの良い培養と良いDNA調製を行います。運動研究のために、常に超音波処理された培養物を使用してください。治療は新鮮でなければなりません。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるNora Weberです。まず、50ミリリットルの液体F2培地を、2つの250ミリリットルフラスコのそれぞれに、ランニング培養物からの1ミリリットルのP.lacunaフィラメントと共に接種することから始める。25°Cで約5日間、攪拌下で白色光で栽培する。5日後、100ミリリットルのP.lacuna細胞懸濁液を10,000RPMで3分間ホモジナイズし、750ナノメートルで光学密度を測定する。次いで、細胞懸濁液を6,000倍G.Moveで15分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを残りの液体の800マイクロリットルおよび追加のF2+培地に懸濁する。1ミリリットルあたり120マイクログラムのカナマイシンを含む8つのF2 + Bacto寒天プレートと10マイクログラムのDNAを各寒天プレートの中央にピペットで取ります。直ちにDNAの上に100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットする。余分な液体が蒸発するのを許すために、クリーンベンチに蓋なしで寒天プレートを保管してください。プレートを閉じ、25°Cの白色光で2日間栽培します。2日後、各寒天プレートのフィラメントを、接種ループを用いて1ミリリットル当たり120マイクログラムのカナマイシンを含むいくつかの新鮮なF2+Bacto寒天プレートに分配する。プレートを摂氏25度の白色光で培養し、顕微鏡下で定期的に培養物を確認する。14〜28日後、死んだ茶色がかったフィラメントを特定し、顕微鏡下で形質転換フィラメントを検索します。変換されたフィラメントは健康で緑色に見え、フィラメントの大部分とは異なります。各単一の形質転換フィラメントを、1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む10ミリリットルのF2+培地を含む50ミリリットルのフラスコに移す。シェーカーで摂氏25度の白色光で栽培し、最大4週間成長を観察します。フィラメントを1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待つ。その後、カナマイシン濃度を再び上げて偏析をスピードアップする。GFP発現の場合、1本のフィラメントを蛍光顕微鏡で40倍または63倍の倍率で観察し、明視野透過像と蛍光像を撮影します。P.lacunaをF2培地中で白色光中で50RPM水平攪拌下で、750ナノメートルでの推定光学濃度が0.35になるまで約5日間培養する。サンプルを摂氏 4 度で保存します。最大電力で1分間超音波でフィラメントを均質化し、1回のサイクルでフィラメントを均質化します。750ナノメートルで光学密度を測定し、P.lacunaを含む培地の8ミリリットルを6センチメートルのペトリ皿に移す。サンプルが室温に達するまで数分間待ってから、ペトリ皿をセロハン箔で覆います。カメラ付きの標準顕微鏡のX-Yテーブルの上に顕微鏡スライドを置きます。顕微鏡のライトをオンにして、4倍または10倍の対物レンズを光の経路に移動します。次に、スライドの上にペトリ皿を置きます。単一フィラメントまたはフィラメントバンドルを、テーブルの X、Y、Z の動きで調整します。単一のフィラメントまたはバンドルの動きを観察し、標準的な顕微鏡カメラで動きを記録します。対物レンズが液体に触れていないことを確認します。6センチメートルのペトリ皿のバクト寒天表面上のP.lacunaを含む溶液のピペット0.5ミリリットル。液体がサーフェスに入るのを待ちます。約20分後、シャーレを閉じ、4Xまたは10Xの対物レンズを使用して表面上のフィラメントの動きを観察します。眼カメラとミニコンピュータシステムを使用してタイムラプス録画をキャプチャします。フィラメントは、最初に目で焦点を合わせ、次に眼カメラを通して焦点を合わせる必要があります。後続の画像間の時間間隔が 5 秒から 1 分であることを確認します。ミニコンピュータのLinuxスクリプトをプログラムして、タイムラプス記録を制御します。5ミリのLEDを取り付けたLEDホルダーを用意し、下から上へ20ミリ四方の領域を照射します。LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または閉じた暗い容器にあることを確認します。P.lacunaを含む培地8ミリリットルを6センチのペトリ皿に入れ、蓋でペトリ皿を閉じ、LEDがペトリ皿の中央になるようにLEDホルダーの上に置きます。通常2日後、光処理の位置に直接向けたスマートフォンカメラでペトリ皿の画像を撮影します。ホルダーと白いシートを背景として使用して、すべての画像に同じ距離と光条件を確保します。ImageJソフトウェアを開き、[ファイル]、[開く]をクリックしてファイルを選択します。次に、Enter キーを押します。直線ボタンを選択し、マウスの左ボタンを押して、ペトリ皿の一端から反対側の端まで線を引きます。線がフィラメントの円の中心を通ることを確認します。[分析と測定]をクリックして、ペトリ皿の長さを確認します。次に、ImageJメニューの[プロファイルの分析とプロット]をクリックします。円の外側のピクセル強度の平均値と、円の内側のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の Y 位置にマウスをポイントして、円の両側の X 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。次に、直線ボタンを選択し、ピクセル強度の最大値の中間値に線を描画します。最後に、[分析]、[測定]をクリックして、内側のセル円の長さを取得します。P.lacuna と PAK1 との変換後のインサートの統合と分離をここに示します。形質転換の約1週間後に外側プライマーを用いたPCR試験では、通常、電気泳動ゲル上に2つのバンドがあり、1つは野生型バンドのサイズで、もう1つは耐性カセットの挿入を示すより遅い移行バンドです。ここで、レーン1~4は耐性フィラメントの単離の7日後、11日後、14日後、17日後のフィラメントのPCR産物を表し、レーン5は野生型のPCR産物を表す。7日間のサンプルでは、インサートは染色体のごく一部に存在する。この画分は、野生型のバンドが見えない17日まで増加し、すなわち、分離は完了する。この画像は、内因性フィコシアニンβプロモーターの制御下でsfGHP発現のためのベクターpMH1を表す。p.lacuna相同配列、pUC19ベクター骨格、ならびにsfGFPおよびカナマイシン耐性を有するインサートがここに示されている。pMH1では、sfGHP遺伝子はフィコシアニンβ遺伝子の3つのプライムに配置されているため、内因性のcpcβプロモーターによって駆動される。P.lacuna野生型フィラメントの蛍光画像、およびPAK1、PAK2、PAK3、およびpMH1による形質転換後をここに示す。sfGFPの発現は、cpc 560プロモーター、a2813プロモーター、psbA2Sプロモーター、または内因性cpcβプロモーターによって駆動される。ここに提示されたマージされた画像は、ホルミジウムラクナの運動性を示しています。寒天表面上の動きをここに示します。時間間隔は1分であった。液体媒体中の移動がここに提示される。時間間隔は10秒であった。自然な変換は簡単な方法です。プラスミドDNAと耐性カセットを細胞と相同な配列で混合し、抗生物質を含む培地上で細胞を成長させるだけです。遺伝子は不活性化され、タンパク質は過剰発現され得る。これは、あらゆる基礎研究やバイオテクノロジー研究にとって重要です。自然形質転換も確立されている単細胞シアノバクテリアでは、光合成や光受容体などの分子研究が取り組まれました。

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...