Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
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1. 자연 환경으로부터의 격리
참고 : 녹조류, 규조류, 사상 시아 노 박테리아 및 기타 미세 조류를 분리 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 조건에서 자라는 암석 풀의 모든 미세 조류 종에 사용할 수 있습니다. Oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노 박테리아는 움직임과 필라멘트 모양으로 쉽게 인식 할 수 있습니다. 상기 종은 게놈 시퀀싱 또는 16S rRNA 시퀀싱?...

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시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션32,33,34,35,36으로부터 이용가능하지만, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도30...

시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA3으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은몇몇 종 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며, 배양 수집 또는 야생 8로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염 농도 또는 온도와 같은 환경 조건이 시간이 지남에 따라 변동하는 해양 암석 풀에서 분리되었습니다. 이 필라멘트 시아 노 박테리아는 그들이 속한 Oscillatoriales12 순서에 대한 모델 유기체로 사용될 수 있습니다.
전기천공에 의한 유전자 전달을 시험하는 시험 동안 13,14는 P. lacuna가 자연 형질전환(15)에 의해 형질전환될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 과정에서 DNA는 일부 세포에 의해 자연적으로 흡수됩니다. 변환16,17의 다른 방법과 비교할 때, 자연 변환은 절차를 복잡하게 만들 수있는 추가 도구가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 전기 천공에는 적절한 큐벳, 손상되지 않은 와이어 및 적절한 전압의 선택이 필요합니다. P. lacuna는 현재 자연 변형에 취약한 유일한 Oscillatoriales 회원입니다. 원래 프로토콜은 전기 천공 프로토콜을 기반으로하기 때문에 여전히 불필요 할 수있는 몇 가지 세척 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜을 단순화하기 위해 다양한 접근 방식을 테스트하여 여기에 제시된 변환 프로토콜로 이어졌습니다.
게놈 서열은 유전자 녹아웃 또는 과발현에 기초한 추가 분자 연구에 필수적이다. 게놈 서열은 단기간 내에 차세대 시퀀싱 기계로 얻을 수 있지만, DNA의 추출은 어려울 수 있으며 종에 따라 다릅니다. P. lacuna를 사용하면 몇 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 그런 다음 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 기반 방법이 확립되어 실험실에서 계속 작업하기 위해 각 정제주기의 DNA 순도 및 DNA 수율을 수용할 수 있게 되었습니다. 다섯 균주의 게놈은 이 프로토콜로 시퀀싱될 수 있었다. 다음 논리적 형질전환 단계는 P. lacuna에서 단백질 발현을 확립하는 것이었다.
이 프로토콜에서 마커 단백질로서 사용된 sfGFP는 임의의 형광 현미경으로 검출될 수 있다. 시험된 모든 프로모터는 P. lacuna sfGFP 발현을 위해 사용될 수 있었다. 형질전환으로부터 발생하는 균주의 수가 증가함에 따라 배양물을 저장하는 방법이 필요하게 되었다. 이러한 방법은 에스케리치아 콜라이 및 다른 많은 박테리아(18)에 대해 확립된다. 표준 프로토콜에서, 글리세롤 배양물을 제조하고, 액체 질소로 옮기고, -80°C에서 저장한다. 이 방법은 몇 단계 만 거치면 되며 확립 된 종에 대해 매우 신뢰할 수 있습니다. P. lacuna에 대한 표준 프로토콜은 살아있는 세포가 모든 경우에 회복 될 수 없었기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 그러나 해동 후 글리세롤을 제거했을 때 모든 시험의 세포는 생존했습니다. P. lacuna의 운동성 분석을 위해 간단한 방법이 제시되며, 이는 IV 형 필리 또는 광수용체의 역할을 조사하기 위해 녹아웃 돌연변이 유발과 결합 될 수 있습니다. 이들 검정은 단세포 시아노박테리아19,20,21의 분석과 다르며 또한 다른 오실라토리아에 유용할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.

상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르?...

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Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

이 프로토콜은 oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노박테리움이 자연 변형에 의해 어떻게 변형 될 수 있는지를 설명합니다. 또한 다양한 종류의 움직임을 어떻게 연구 할 수 있는지 보여줍니다. 자연 변환은 작동하는 경우 가장 간단한 변환 기술입니다.DNA, 세포 및 성장 배지 만 필요합니다. 지금까지 다른 진동 부재는 자연 변형으로 변형 될 수 없었습니다. 우리는 우리의 연구가 다른 그룹이 다른 oscillatoria를 시도하도록 자극하기를 바랍니다.변형을 위해서는 건강하고 건강한 문화와 좋은 DNA 준비를하십시오. 모션 연구의 경우 항상 초음파 처리 문화를 사용하십시오. 치료는 신선해야합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 Nora Weber가 될 것입니다. 50 밀리리터의 액체 F2 배지를 실행 중인 배양물에서 나온 P.lacuna 필라멘트 한 밀리리터와 함께 두 개의 250밀리리터 플라스크 각각에 접종하여 시작하십시오. 섭씨 25도에서 약 5 일 동안 동요 아래 흰 빛으로 재배하십시오.5일 후, 100 밀리리터의 P.lacuna 세포 현탁액을 10, 000 RPM에서 3분 동안 균질화하고 750 나노미터에서 광학 밀도를 측정하였다. 이어서, 세포 현탁액을 6, 000 배 G.에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 800 마이크로리터의 나머지 액체 및 추가 F2+ 배지에 현탁시킨다. 밀리리터 카나마이신 당 120마이크로그램의 DNA와 10마이크로그램의 DNA를 포함하는 8개의 F2+Bacto 한천 플레이트를 각 한천 플레이트의 중앙에 취하십시오.즉시 DNA 위에 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫한다. 여분의 액체가 증발 할 수 있도록 깨끗한 벤치에 뚜껑이없는 한천 판을 유지하십시오. 접시를 닫고 이틀 동안 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하십시오.이틀 후, 각 한천 플레이트의 필라멘트를 접종 루프가있는 밀리리터 카나마이신 당 120 마이크로 그램을 함유 한 여러 개의 신선한 F2 + Bacto 한천 플레이트에 배포하십시오. 접시를 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하고 현미경으로 정기적으로 배양물을 확인하십시오. 14 ~ 28 일 후에 죽은 갈색 필라멘트를 확인하고 현미경으로 변형 된 필라멘트를 검색하십시오.변형 된 필라멘트는 건강하고 녹색으로 보이며 대부분의 필라멘트와 다릅니다. 각 단일 변형 필라멘트를 밀리리터 카나마이신 당 250 마이크로그램의 F2 + 배지 10 밀리리터가있는 50 밀리리터 플라스크로 옮깁니다. 셰이커에서 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하고 최대 4 주 동안 성장을 관찰하십시오.필라멘트를 밀리리터 카나마이신 당 250 마이크로그램을 함유하는 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 성장할 때까지 기다립니다. 그런 다음, 카나마이신 농도를 다시 증가시켜 분리를 가속화시킨다. GFP 발현을 위해, 40X 또는 63X 배율에서 형광 현미경으로 단일 필라멘트를 관찰하고 밝은 필드 전송 이미지 및 형광 이미지를 캡처한다.750 나노 미터에서 추정 된 광학 밀도가 0.35가 될 때까지 약 5 일 동안 백색광에서 50RPM 수평 교반하에 F2 배지에서 P.lacuna를 배양하십시오. 샘플을 섭씨 네 도에 보관합니다. 필라멘트를 초음파로 균질화하여 최대 전력과 사이클에서 일분 동안 균질화하십시오.750 나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 P.lacuna를 함유하는 배지 여덟 밀리리터를 여섯 센티미터 페트리 접시에 옮긴다. 샘플이 실온에 도달 할 때까지 몇 분 동안 기다린 다음 셀로판 호일로 페트리 접시를 덮으십시오. 현미경 슬라이드를 카메라로 표준 현미경의 X-Y 테이블에 놓습니다.현미경 조명을 켜고 4X 또는 10X 대물렌즈를 빛의 경로로 이동합니다. 그런 다음 페트리 접시를 슬라이드 위에 놓습니다. 테이블의 X, Y 및 Z 움직임에 따라 단일 필라멘트 또는 필라멘트 번들을 조정합니다.단일 필라멘트 또는 번들의 움직임을 관찰하고 표준 현미경 카메라로 움직임을 기록하십시오. 대물 렌즈가 액체에 닿지 않는지 확인하십시오. 피펫 0.5 밀리리터의 P.lacuna를 함유 한 용액의 6 센티미터 페트리 접시의 박토 한천 표면에.액체가 표면에 들어가도록하십시오. 약 20 분 후, 페트리 접시를 닫고 4X 또는 10X 목표를 사용하여 표면에서 필라멘트의 움직임을 관찰하십시오. 안구 카메라와 미니 컴퓨터 시스템을 사용하여 타임랩스 녹화를 캡처합니다.필라멘트는 먼저 눈으로 초점을 맞춘 다음 안구 카메라를 통해 초점을 맞추어야합니다. 후속 이미지 사이의 시간 간격이 다섯 초에서 한 분인지 확인하십시오. 미니 컴퓨터의 Linux 스크립트를 프로그래밍하여 타임랩스 기록을 제어합니다.다섯 밀리미터 LED가 장착된 LED 홀더를 준비하여 아래에서 위로 20mm 평방 면적을 조사합니다. LED 강도를 측정하고 조정합니다. 전체 설정이 어두운 방 또는 닫힌 어두운 컨테이너에 있는지 확인하십시오.P.lacuna가 들어있는 배지 여덟 밀리리터를 여섯 센티미터 페트리 접시에 넣고 뚜껑으로 페트리 접시를 닫은 다음 LED가 페트리 접시의 중앙에 오도록 LED 홀더에 놓습니다. 일반적으로 이틀 후, 광 처리의 위치를 직접 겨냥한 스마트 폰 카메라로 페트리 접시의 이미지를 캡처하십시오. 홀더와 흰색 시트를 배경으로 사용하여 모든 사진에 대해 동일한 거리와 조명 조건을 보장하십시오.ImageJ 소프트웨어를 열고 파일, 열기를 클릭하고 파일을 선택하십시오. 그런 다음 Enter 키를 클릭합니다. 직선 단추를 선택하고 마우스 왼쪽 단추를 눌러 페트리 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 선을 그립니다.선이 필라멘트 원의 중심을 통과하는지 확인하십시오. 분석 및 측정을 클릭하여 페트리 요리의 길이를 확인하십시오. 그런 다음 ImageJ 메뉴에서 프로파일 분석 및 플롯을 클릭하십시오.원 외부의 픽셀 강도에 대한 평균값과 원 내부의 픽셀 강도에 대한 또 다른 평균값을 추정합니다. 이 값 사이의 Y 위치에 마우스를 가리켜 원의 양쪽 면의 X 값을 추정합니다. 두 값을 모두 기록하고 차이를 계산합니다.그런 다음 직선 버튼을 선택하고 픽셀 강도의 중간 최대값으로 선을 그립니다. 마지막으로 분석을 클릭 한 다음 측정을 클릭하여 내부 셀 원의 길이를 가져옵니다. P.lacuna와 PAK1의 형질전환 후의 삽입물의 통합 및 분리가 여기에 도시되어 있다.형질전환 후 일주일 경에 외부 프라이머를 사용한 PCR 테스트에는 일반적으로 전기영동 젤 상에 두 개의 밴드가 있는데, 하나는 야생형 밴드의 크기를 가지며, 하나는 저항 카세트의 삽입을 나타내는 느린 이동 밴드입니다. 여기서, 레인 1 내지 4는 내성 필라멘트의 단리의 7일, 11일, 14일, 및 17일 후의 필라멘트의 PCR 산물을 나타내고, 레인 5는 야생형의 PCR 산물을 나타낸다. 칠일 샘플에서, 삽입물은 염색체의 작은 분획에 존재한다.이 분율은 야생형 밴드가 보이지 않는 17일까지 증가하며, 즉, 분리가 완료됩니다. 이 이미지는 내인성 피코시아닌 베타 프로모터의 조절하에 sfGHP 발현을 위한 벡터 pMH1을 나타낸다. P.lacuna 상동성 서열, pUC19 벡터 백본, 및 sfGFP 및 카나마이신 내성을 갖는 삽입물이 여기에 도시되어 있다.pMH1에서, sfGHP 유전자는 피코시아닌 베타 유전자의 세 개의 프라임으로 배치되고; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phy P.lacuna 야생형 필라멘트 및 PAK1, PAK2, PAK3, 및 pMH1로 형질전환한 후의 형광 이미지가 여기에 도시되어 있다. sfGFP의 발현은 cpc 560 프로모터, a2813 프로모터, psbA2S 프로모터, 또는 내인성 cpc 베타 프로모터에 의해 구동된다.여기에 제시된 병합 된 이미지는 Phormidium lacuna의 운동성을 보여줍니다. 한천 표면의 움직임이 여기에 표시됩니다. 시간 간격은 일분이었다.액체 매질에서의 움직임이 여기에 제시된다. 시간 간격은 10초였다. 자연 변환은 간단한 방법입니다.플라스미드 DNA와 상동 서열의 저항성 카세트를 세포와 혼합하고 항생제가있는 배지에서 세포가 자라게하십시오. 유전자는 불활성화될 수 있고 단백질은 과발현될 수 있다. 이것은 모든 기본 연구 및 생명 공학 연구에 중요합니다.자연 변형이 확립 된 단일 세포 시아 노 박테리아에서는 광합성 또는 광수용체에 대한 분자 연구 등이 다루어졌습니다.

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...