Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

O trabalho contou com o apoio do Instituto de Tecnologia Karlsruher.

1. Isolamento do ambiente natural
NOTA: Algas verdes, diatomas, cianobactérias filamentosas e outras microalgas podem ser isoladas. O protocolo pode ser usado para qualquer espécie de microalga de piscinas de rochas que crescem em condições laboratoriais. Cianobactérias filamentosas que pertencem aos Oscillatoriales podem ser facilmente reconhecidas por seu movimento e forma filamentosa. A espécie pode ser identificada em um estado semiuso por sequenciamento de genoma ou s...

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PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. 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F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. 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Embora muitas cepas de cianobactérias estejam disponíveis a partir de coleções culturais 32,33,34,35,36, ainda há uma demanda por novas cianobactérias da natureza porque essas espécies são adaptadas a propriedades específicas. P. lacuna foi coletado a partir de piscinas rochosas e é adaptado a variações de concentrações de sal e temperat...

Cianobactérias são organismos procarióticos que utilizam a fotossíntese como fonte de energia 1,2. A pesquisa está cada vez mais focada em espécies cianobacterianas. Várias cianobactérias podem ser transformadas com DNA3. Genes podem ser eliminados ou superexpressos nestas espécies. No entanto, a transformação é restrita a algumas espécies 4,5,6,7,8,9,10,11, e pode ser difícil estabelecer transformação em cepas de coleções culturais ou selvagens 8. Cepas da espécie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) foram isoladas de piscinas marinhas, nas quais as condições ambientais, como concentrações de sal ou temperatura, flutuam ao longo do tempo. Estas cianobactérias filamentosas podem ser usadas como organismos modelo para a ordem Oscillatoriales12 a que pertencem.
Durante os testes testando a transferência de genes por eletroporação13,14, descobriu-se que a P. lacuna pode ser transformada pela transformação natural15. Nesse processo, o DNA é tomado naturalmente por algumas células. Em comparação com outros métodos de transformação16,17, a transformação natural tem a vantagem de não exigir ferramentas adicionais que possam complicar o procedimento. Por exemplo, a eletroporação requer cuvetas adequadas, fios intactos e seleção da tensão adequada. P. lacuna é atualmente o único membro oscillatoriales suscetível à transformação natural. Como o protocolo original é baseado em protocolos de eletroporação, ele ainda incluía várias etapas de lavagem que podem ser desnecessárias. Diferentes abordagens foram testadas para simplificar o protocolo, levando ao protocolo de transformação aqui apresentado.
A sequência do genoma é essencial para outros estudos moleculares baseados em nocaute genético ou superexpressão. Embora as sequências de genoma possam ser obtidas com máquinas de sequenciamento de última geração em curtos períodos, a extração do DNA pode ser difícil e depende da espécie. Com P. lacuna, vários protocolos foram testados. Um método modificado de cetil trimethyl amônio (CTAB) foi então estabelecido, resultando em pureza aceitável dos rendimentos de DNA e DNA de cada ciclo de purificação para o trabalho contínuo em laboratório. O genoma de cinco cepas pode ser sequenciado com este protocolo. O próximo passo de transformação lógica foi estabelecer expressão proteica em P. lacuna.
O sfGFP usado como proteína marcadora neste protocolo pode ser detectado com qualquer microscópio de fluorescência. Todos os promotores que foram testados poderiam ser usados para a expressão P. lacuna sfGFP. O aumento do número de cepas decorrentes da transformação resultou na necessidade de um método para armazenar as culturas. Tais métodos são estabelecidos para Escherichia coli e muitas outras bactérias18. Nos protocolos padrão, culturas de glicerol são preparadas, transferidas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. Este método requer apenas alguns passos e é altamente confiável para as espécies para as quais é estabelecido. O protocolo padrão não era viável para P. lacuna porque as células vivas não podiam ser recuperadas em todos os casos. No entanto, quando o glicerol foi removido após o descongelamento, células de todos os ensaios sobreviveram. Métodos simples são apresentados para a análise da motilidade de P. lacuna, que pode ser combinada com mutagênese nocaute para investigar pili tipo IV ou o papel dos fotorreceptores. Estes ensaios são diferentes dos de cianobactériasunicelulares 19,20,21 e também podem ser úteis para outras Oscillatoria.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

As cianobactérias são o foco de pesquisas básicas e projetos biotecnológicos nos quais a energia solar é utilizada para a produção de biomassa. Phormidium lacuna é um recém-isolado cianobacterium filamentous. Este artigo descreve como novas cianobactérias filamentosas podem ser isoladas das piscinas marinhas. Também descreve como o DNA pode ser extraído de filamentos e como os genomas podem ser sequenciados. Embora a transformação seja estabelecida para muitas espécies unicelulares, é menos frequentemente relatada para cianobactérias filamentosas. Um método simplificado para a transformação natural de P. lacuna é descrito aqui. P. lacuna é o único membro da ordem Oscillatoriales para o qual a transformação natural é estabelecida. Este artigo também mostra como a transformação natural é usada para expressar proteína fluorescente verde superpatos (sfGFP). Um promotor endógeno do CPCB induziu aproximadamente 5 vezes mais expressão do que os promotores do CPC560, A2813 ou psbA2 do Synechocystis sp. PCC6803. Além disso, foi estabelecido um método para a criopreservação de P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803, e são descritos métodos para avaliação da motilidade em meio líquido e em superfícies de ágar e plástico.

Seguindo os métodos acima mencionados, 5 cepas diferentes de P. lacuna foram isoladas de balanços e sequenciadas (Figura 1 e Tabela 1). Todas as culturas foram estéreis após ~1 ano de subcultura, exceto P. lacuna HE10JO. Esta cepa ainda está contaminada com Marivirga Atlantica, uma bactéria marinha. Durante as excursões subsequentes de Helgoland, outras cianobactérias filamentosas foram isoladas das piscinas rochosas, que são diferentes de...

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Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna é um cianobacterium filamentoso que foi isolado de piscinas marinhas. Este artigo descreve o isolamento de filamentos de fontes naturais, extração de DNA, sequenciamento de genomas, transformação natural, expressão de sfGFP, crioconservação e motilidade.

Transformação Natural, Expressão proteica e Crioconservação da Cicocrias Cianobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Este protocolo descreve como o cianobacterium filamentoso que pertence aos oscillatoriales pode ser transformado pela transformação natural. Também mostra como diferentes tipos de movimento podem ser estudados. A transformação natural é a técnica de transformação mais simples, se funcionar.Apenas DNA, células e meio de crescimento são necessários. Até agora, nenhum outro membro oscillatorial poderia ser transformado pela transformação natural. Esperamos que nossos estudos estimulem outros grupos a tentar outras oscilações.Para a transformação, faça uma boa e saudável cultura de aparência e uma boa preparação de DNA. Para estudos de movimento, use sempre uma cultura tratada com ultrassom. O tratamento deve ser fresco.Demonstrando o procedimento estará Nora Weber, técnica do meu laboratório. Comece inoculando 50 mililitros líquidos F2 em cada um dos dois frascos de 250 mililitros com um mililitro de filamentos P.lacuna de uma cultura em execução. Cultive com luz branca sob agitação por cerca de cinco dias a 25 graus Celsius.Após cinco dias, homogeneize 100 mililitros de suspensão celular P.lacuna a 10.000 RPM por três minutos e meça a densidade óptica em 750 nanômetros. Em seguida, centrifuse a suspensão celular por 15 minutos a 6.000 vezes G.Remova o supernascer e suspenda a pelota em 800 microliters do líquido restante e adicional F2+médio. Leve oito placas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por mililitro kanamycin e pipeta 10 microgramas de DNA no meio de cada placa de ágar.Imediatamente pipeta 100 microliters da suspensão celular em cima do DNA. Mantenha a placa de ágar sem tampa no banco limpo para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 graus Celsius por dois dias.Após dois dias, distribua os filamentos de cada placa de ágar em várias placas frescas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por kanamicina mililitro com um laço de inoculação. Cultive as placas em luz branca a 25 graus Celsius e verifique as culturas regularmente sob um microscópio. Após 14 a 28 dias, identifique os filamentos acastúsis mortos e procure filamentos transformados sob o microscópio.Os filamentos transformados parecem saudáveis e verdes e são diferentes da maior parte dos filamentos. Transfira cada filamento transformado em frascos de 50 mililitros com 10 mililitros de F2+médio com 250 microgramas por kanamicina mililitro. Cultive em luz branca a 25 graus Celsius em um agitador e observe o crescimento por até quatro semanas.Transfira os filamentos de volta para o meio ágar contendo 250 microgramas por mililitro kanamycin e espere que os filamentos cresçam. Então, aumente a concentração de kanamicina novamente para acelerar a segregação. Para a expressão GFP, observa filamentos únicos com um microscópio de fluorescência a ampliação de 40X ou 63X e captura uma imagem de transmissão de campo brilhante e uma imagem de fluorescência.Cultivar P.lacuna em f2 médio sob agitação horizontal de 50 RPM em luz branca por cerca de cinco dias até que a densidade óptica estimada em 750 nanômetros se torne 0,35. Armazene a amostra a 4 graus Celsius. Homogeneize os filamentos com ultrassom por um minuto na potência máxima e ciclo de um.Meça a densidade óptica em 750 nanômetros e transfira oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros. Aguarde alguns minutos até que a amostra atinja a temperatura ambiente e cubra a placa de Petri com papel alumínio. Coloque um slide de microscópio na tabela X-Y de um microscópio padrão com uma câmera.Ligue a luz do microscópio e mova um objetivo 4X ou 10X para o caminho da luz. Em seguida, coloque a placa de Petri em cima do slide. Ajuste filamentos individuais ou pacotes de filamentos pelos movimentos X, Y e Z da tabela.Observe os movimentos de filamentos ou feixes únicos e grave os movimentos com uma câmera de microscópio padrão. Certifique-se de que a lente objetiva não toque no líquido. Pipeta 0,5 mililitros de uma solução contendo P.lacuna na superfície do ágar Bacto de uma placa de Petri de seis centímetros.Deixe o líquido entrar na superfície. Após cerca de 20 minutos, feche a placa de Petri e observe o movimento dos filamentos na superfície usando um objetivo 4X ou 10X. Capture as gravações de lapso de tempo usando uma câmera ocular e um sistema de minicomp que o computador.Os filamentos devem primeiro ser focados pelos olhos e depois pela câmera ocular. Certifique-se de que o intervalo de tempo entre as imagens subsequentes é de cinco segundos a um minuto. Programe o script Linux do minicomp que o computador para controlar a gravação do lapso de tempo.Prepare os suportes de LED onde os LEDs de cinco milímetros são montados para irradiar uma área de 20 milímetros quadrados de baixo para cima. Meça e ajuste as intensidades do LED. Certifique-se de que toda a configuração está em uma sala escura ou em um recipiente fechado e escuro.Coloque oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros, feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED esteja no centro da placa de Petri. Após tipicamente dois dias, capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone voltada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um suporte e uma folha branca como plano de fundo para garantir a mesma distância e condições de luz para cada imagem.Abra o software ImageJ, clique em Arquivo, Abra e selecione o arquivo. Em seguida, clique em Enter. Selecione o botão reto e pressione o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri até a extremidade oposta.Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos. Clique em Analisar e Medir para ver o comprimento da placa de Petri. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil no menu ImageJ.Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel dentro do círculo. Aponte o mouse sobre a posição Y entre esses valores para estimar os valores X de ambos os lados do círculo. Observe ambos os valores e calcule a diferença.Em seguida, selecione o botão reto e desenhe uma linha no valor médio-máximo da intensidade do pixel. Por fim, clique em Analisar e, em seguida, Meça para obter o comprimento do círculo da célula interna. A integração e a segregação da inserção após a transformação de P.lacuna com PAK1 é mostrada aqui.Um teste pcr com primers externos cerca de uma semana após a transformação normalmente tem duas bandas no gel de eletroforese, uma com o tamanho da banda tipo selvagem, e uma banda migratória mais lenta que indica a inserção do de resistência. Aqui, as faixas 1 a 4 representam produtos PCR de filamentos após sete dias, 11 dias, 14 dias e 17 dias de isolamento de um filamento resistente, e a pista 5 representa produto PCR do tipo selvagem. Na amostra de sete dias, a inserção está presente em uma pequena fração dos cromossomos.Esta fração aumenta até 17 dias, onde nenhuma banda do tipo selvagem é visível;ou seja, a segregação está completa. Esta imagem representa o vetor pMH1 para expressão sfGHP sob o controle do promotor beta de ficocyanina endógena. P.lacuna sequência homólogo, espinha dorsal vetorial pUC19 e inserção com resistência sfGFP e kanamycin são mostrados aqui.No pMH1, o gene sfGHP é colocado três primos do gene beta de ficocyanina;portanto, é impulsionado pelo promotor beta do cpc endógeno. Imagens de fluorescência de filamentos do tipo selvagem P.lacuna e após a transformação com PAK1, PAK2, PAK3 e pMH1 são mostradas aqui. A expressão do SFGFP é impulsionada pelo promotor do CPC 560, pelo promotor a2813, pelo promotor do PSBA2S ou pelo promotor beta endógeno do CPC.As imagens mescladas aqui apresentadas mostram a motilidade da lacuna phormidium. O movimento na superfície do ágar é mostrado aqui. O intervalo de tempo foi de um minuto.O movimento no meio líquido é apresentado aqui. O intervalo de tempo foi de 10 segundos. Transformação natural é um método simples.Basta misturar DNA plasmídeo com uma fita de resistência em sequências homólogos com as células e deixar as células crescerem em um meio com antibióticos. Genes podem ser inativados e proteínas podem ser superexpressas. Isso é importante para qualquer pesquisa básica e para estudos biotécnicos.Em cianobactérias unicelulares onde a transformação natural também é estabelecida, foram abordados estudos moleculares sobre fotossíntese ou fotorreceptores, etc.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

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Biologia

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Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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