Name: natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Arbetet stöddes av Karlsruher Institute of Technology.

1. Isolering från den naturliga miljön
OBS: Gröna alger, kiselalger, trådformiga cyanobakterier och andra mikroalger kan isoleras. Protokollet kan användas för alla mikroalgerter från stenpooler som växer under laboratorieförhållanden. Filamentösa cyanobakterier som tillhör Oscillatoriales kan lätt kännas igen av deras rörelse och trådformiga form. Arten kan identifieras i ett halvrent tillstånd genom genomsekvensering eller 16S rRNA-sekvensering.
<ol><li>Ö...

<ol>
	<li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories.">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li><li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria.">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515 (2019).</li><li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria.">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).</li><li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria:+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant.">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li><li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+cyanobacteria.">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li><li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803:+preparation+of+chromosomal+DNA.">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li><li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination.">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li><li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria.">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li><li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation.">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li><li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium,+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1.">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li><li>Vioque, A., Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cyanobacteria.">Transformation of cyanobacteria.</a> Transgenic Microalgae as Green Cell. , 12-22 (2007).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277.">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li><li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806.">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li><li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).</li><li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp,+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp.">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li><li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+(Subsection+V)+Fischerella+and+Chlorogloeopsis.">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li><li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying.">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454 (2020).</li><li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP.">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li><li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light.">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li><li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803.">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li><li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li><li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+artificial+seawater.">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , (2001).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTAB+DNA+extraction+buffer.">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li><li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., H&#228;der, D. -. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria.">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology &amp; Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li><li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion.">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , (1989).</li><li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility,+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna.">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+(vitamin+B2).">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li><li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon.">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li><li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii.">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li><li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp,+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin.">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li><li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997.">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li><li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902.">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li><li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco.">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li><li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells.">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li><li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria.">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).</li></ol>

Även om många stammar av cyanobakterier finns tillgängliga från odlingssamlingar 32,33,34,35,36, finns det fortfarande en efterfrågan på nya cyanobakterier från naturen eftersom dessa arter är anpassade till specifika egenskaper. P. lacuna samlades in från stenpooler och är anpassad till variationer av saltkoncentrationer och temperatur<sup ...

Cyanobakterier är prokaryota organismer som använder fotosyntes som energikälla 1,2. Forskningen är alltmer inriktad på cyanobakteriella arter. Flera cyanobakterier kan transformeras med DNA3. Gener kan slås ut eller överuttryckas hos dessa arter. Omvandlingen är dock begränsad till ett fåtal arter 4,5,6,7,8,9,10,11, och det kan vara svårt att fastställa omvandling i stammar från kultursamlingar eller det vilda 8. Stammar av den trådformiga arten Phormidium lacuna (figur 1) isolerades från marina stenpooler, där miljöförhållanden, såsom saltkoncentrationer eller temperatur, fluktuerar över tiden. Dessa trådformiga cyanobakterier kan användas som modellorganismer för den ordning Oscillatoriales12 som de tillhör.
Under försök som testade genöverföring genom elektroporering13,14 fann man att P. lacuna kan transformeras genom naturlig transformation15. I denna process tas DNA upp naturligt av vissa celler. Jämfört med andra omvandlingsmetoder16,17 har naturlig omvandling fördelen att det inte krävs ytterligare verktyg som kan komplicera proceduren. Till exempel kräver elektroporering korrekta kyvetter, intakta ledningar och val av rätt spänning. P. lacuna är för närvarande den enda Oscillatoriales-medlemmen som är mottaglig för naturlig omvandling. Eftersom det ursprungliga protokollet är baserat på elektroporeringsprotokoll inkluderade det fortfarande flera tvättsteg som kan vara onödiga. Olika tillvägagångssätt testades för att förenkla protokollet, vilket ledde till transformationsprotokollet som presenteras här.
Genomsekvensen är avgörande för ytterligare molekylära studier baserade på genknockout eller överuttryck. Även om genomsekvenser kan erhållas med nästa generations sekvenseringsmaskiner inom korta perioder, kan extraktionen av DNA vara svår och beror på arten. Med P. lacuna testades flera protokoll. En modifierad cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB)-baserad metod fastställdes sedan, vilket resulterade i acceptabel renhet av DNA och DNA-utbyten för varje reningscykel för fortsatt arbete i laboratoriet. Genomet av fem stammar kan sekvenseras med detta protokoll. Nästa logiska transformationssteg var att etablera proteinuttryck i P. lacuna.
SFGFP som används som markörprotein i detta protokoll kan detekteras med vilket fluorescensmikroskop som helst. Alla promotorer som testades kunde användas för P. lacuna sfGFP-uttryck. Det ökande antalet stammar som uppstår genom omvandling har resulterat i behovet av en metod för lagring av kulturerna. Sådana metoder är etablerade för Escherichia coli och många andra bakterier18. I standardprotokoll framställs glycerolkulturer, överförs i flytande kväve och lagras vid -80 °C. Denna metod kräver bara några steg och är mycket tillförlitlig för de arter för vilka den är etablerad. Standardprotokollet var inte genomförbart för P. lacuna eftersom levande celler inte kunde återvinnas i alla fall. Men när glycerol avlägsnades efter upptining överlevde celler från alla försök. Enkla metoder presenteras för analys av rörligheten hos P. lacuna, som kan kombineras med knockout-mutagenes för att undersöka typ IV pili eller fotoreceptorernas roll. Dessa analyser skiljer sig från de hos encelliga cyanobakterier 19,20,21 och kan också vara användbara för andra Oscillatoria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave 3870 ELV</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870 ELV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>OttoNorwald</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 Freshwater Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>73816-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>H3BO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>CaCl2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>601975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge LYNX 4000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75006580</td>
			<td>and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge microstar 17</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for up to 13,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>57-09-0</td>
			<td>C19H42BrN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td> 
			A1935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7758-99-8</td>
			<td>&#160;CuSO4 &#183; 5 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>&#160;C10H16N2O3S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 1 kb</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical pipetting help accujet-pro S</td>
			<td>Brand GmbH</td>
			<td>26360</td>
			<td>for pipetting 1-25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>C2H6O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>EDTA-Na2 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope ApoTome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell Press</td>
			<td>American Instrument Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documation System Saffe Image</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td>
			<td>ADVANCED</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware, different</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>C3H8O3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10025-77-1</td>
			<td>&#160;FeCl3 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>C18H36N4O11 &#183; H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>137-16-6</td>
			<td>C15H28NO3 &#183; Na</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X964.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td></td>
			<td>cultivation of cyanobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source, LED panel XL 6500K 140 W</td>
			<td>Bloom Star</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 &#181;mol m-2 s-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>MgCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td>MnCl2 &#183; 4 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DM750</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit</td>
			<td>Macherey-NAGEL GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>REF740410.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td>2138863-YD</td>
			<td>for time-lapse recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera EC3</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for continuous recording up to 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular camera MikrOkular Full HD</td>
			<td>Bresser</td>
			<td></td>
			<td>for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5606-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Nanodrop ND-1000</td>
			<td>Peqlab Biotechnologie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer Uvikon XS</td>
			<td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman 10-100 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>SKU: FA10004M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 10 mL, sterile</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 15 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube, sterile, 50 mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7758-02-3</td>
			<td>KBr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Statron 3252-1</td>
			<td>Statron Ger&#228;tetechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply Voltcraft PPS 16005</td>
			<td>Conrad Electronics</td>
			<td></td>
			<td>for LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>MC500C</td>
			<td>from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td>NaCH3COO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>NaH2PO4 &#183; H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>10102-40-6</td>
			<td>Na2MoO4 &#183; 2 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7631-99-4</td>
			<td>NaNO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7757-82-6</td>
			<td>Na2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride hexahydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>10025-70-4</td>
			<td>SrCl2 &#183; 6 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-03-8</td>
			<td>C12H17ClN4OS &#183; HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>C4H11NO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3</td>
			<td>Hielscher Ultrasound Technology</td>
			<td>UP100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraturrax Silent Crusher M</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td></td>
			<td>homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>CH4N2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td>C63H88CoN14O14P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Stills, Water treatment</td>
			<td>VEOLIA water technologies</td>
			<td>ELGA_21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulphate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7446-20-0</td>
			<td>ZnSO4 &#183; 7 H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software, URL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gatb-minia program for DNA assembly</td>
			<td>https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td>
			<td>makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAST annotation server</td>
			<td>https://rast.nmpdr.org</td>
			<td>input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial seawater</td>
			<td colspan="3">0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&#160; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &#181;M SrCl2, 72 &#181;M NaF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2 -liquid medium</td>
			<td colspan="3">artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+ liquid medium</td>
			<td colspan="3">f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2+-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>f/2-agar</td>
			<td colspan="3">3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 &#181;M NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace element solution</td>
			<td colspan="3">0.36 mM NaH2PO4, 12 &#181;M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 &#181;M MnCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin solution</td>
			<td colspan="2">0.3 &#181;M thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural transformation, protein expression, and cryoconservation of the filamentous cyanobacterium phormidium lacuna

Cyanobakterier är i fokus för grundforskning och biotekniska projekt där solenergi används för produktion av biomassa. Phormidium lacuna är en nyligen isolerad trådformig cyanobakterie. Denna uppsats beskriver hur nya trådformiga cyanobakterier kan isoleras från marina stenpooler. Den beskriver också hur DNA kan extraheras från filament och hur genomerna kan sekvenseras. Även om omvandling är etablerad för många encelliga arter, rapporteras det mindre ofta för trådformiga cyanobakterier. En förenklad metod för den naturliga omvandlingen av P. lacuna beskrivs här. P. lacuna är den enda medlemmen i ordningen Oscillatoriales för vilken naturlig omvandling är etablerad. Detta dokument visar också hur naturlig omvandling används för att uttrycka superfolder grönt fluorescerande protein (sfGFP). En endogen cpcB-promotor inducerade cirka 5 gånger starkare uttryck än cpc560, A2813 eller psbA2-promotorer från Synechocystis sp. Vidare fastställdes en metod för kryokonservering av P. lacuna och Synechocystis sp.CPP 6803, och metoder för att bedöma motilitet i ett flytande medium och på agar- och plastytor beskrivs.

Enligt ovan nämnda metoder isolerades 5 olika stammar av P. lacuna från stenpooler och sekvenserades (figur 1 och tabell 1). Alla kulturer var sterila efter ~ 1 års subkulturering utom P. lacuna HE10JO. Denna stam är fortfarande förorenad med Marivirga atlantica, en marin bakterie. Under efterföljande Helgoland-utflykter isolerades andra trådformiga cyanobakterier från bergpooler, som skiljer sig från P. lacuna och måste karakter...

Watch this Scientific Journal Video about Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna at JoVE.com

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna är en trådformig cyanobakterie som isolerades från marina stenpooler. Denna artikel beskriver isolering av filament från naturliga källor, DNA-extraktion, genomsekvensering, naturlig transformation, uttryck av sfGFP, kryokonservation och motilitetsmetoder.

Naturlig transformation, proteinuttryck och kryokonservering av den trådformiga cyanobakterien Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Detta protokoll beskriver hur trådformig cyanobakterie som tillhör oscillatoriales kan omvandlas genom naturlig transformation. Den visar också hur olika typer av rörelse kan studeras. Naturlig omvandling är den enklaste transformationstekniken, om den fungerar.Endast DNA, celler och tillväxtmedium krävs. Hittills har ingen annan oscillatorialesmedlem kunnat omvandlas genom naturlig omvandling. Vi hoppas att våra studier stimulerar andra grupper att prova andra oscillatorier.För transformation, gör en bra, hälsosam utseende-kultur och en bra DNA-beredning. För rörelsestudier, använd alltid en ultraljudsbehandlad kultur. Behandlingen ska vara fräsch.Demonstrerar proceduren gör Nora Weber, tekniker från mitt laboratorium. Börja med att inokulera 50 ml flytande F2-medium i var och en av de två 250 ml kolvarna med en milliliter P.lacuna-filament från en löpande kultur. Odla i vitt ljus under omrörning i cirka fem dagar vid 25 grader Celsius.Efter fem dagar homogenisera 100 ml P.lacuna-cellsuspension vid 10 000 varv / min i tre minuter och mät den optiska densiteten vid 750 nanometer. Centrifugera sedan cellsuspensionen i 15 minuter vid 6 000 gånger G.Ta bort supernatanten och suspendera pelleten i 800 mikroliter av den återstående vätskan och ytterligare F2 + medium. Ta åtta F2 + Bacto agarplattor som innehåller 120 mikrogram per milliliter kanamycin och pipett 10 mikrogram DNA i mitten av varje agarplatta.Pipettera omedelbart 100 mikroliter av cellsuspensionen ovanpå DNA. Förvara agarplattan utan lock på den rena bänken så att överskottsvätskan avdunstar. Stäng plattan och odla den i vitt ljus vid 25 grader Celsius i två dagar.Efter två dagar, fördela filamenten på varje agarplatta på flera färska F2 + Bacto agarplattor som innehåller 120 mikrogram per milliliter kanamycin med en ympningsslinga. Odla plattorna i vitt ljus vid 25 grader Celsius och kontrollera kulturerna regelbundet under ett mikroskop. Efter 14 till 28 dagar, identifiera de döda brunaktiga filamenten och sök efter transformerade filament under mikroskopet.De transformerade filamenten ser friska och gröna ut och skiljer sig från huvuddelen av filamenten. Överför varje enskilt transformerat filament till 50 ml kolvar med 10 ml F2 + medium med 250 mikrogram per milliliter kanamycin. Odla i vitt ljus vid 25 grader Celsius på en shaker och observera tillväxten i upp till fyra veckor.Överför filamenten tillbaka till agarmediet som innehåller 250 mikrogram per milliliter kanamycin och vänta tills filamenten växer. Öka sedan kanamycinkoncentrationen igen för att påskynda segregeringen. För GFP-uttryck observerar man enstaka filament med ett fluorescensmikroskop vid 40X eller 63X förstoring och fångar en ljusfältsöverföringsbild och en fluorescensbild.Odla P.lacuna i F2-medium under 50 rpm horisontell omrörning i vitt ljus i cirka fem dagar tills den uppskattade optiska densiteten vid 750 nanometer blir 0,35. Förvara provet vid fyra grader Celsius. Homogenisera filamenten med ultraljud i en minut vid maximal effekt och cykel av en.Mät den optiska densiteten vid 750 nanometer och överför åtta milliliter av mediet som innehåller P.lacuna till en sex centimeter petriskål. Vänta några minuter tills provet når rumstemperatur och täck sedan petriskålen med cellofanfolie. Placera en mikroskopbild på X-Y-bordet i ett standardmikroskop med en kamera.Slå på mikroskopljuset och flytta ett 4X eller 10X mål in i ljusets väg. Lägg sedan petriskålen ovanpå bilden. Justera enkla filament eller filamentbuntar efter bordets X-, Y- och Z-rörelser.Observera rörelserna hos enskilda filament eller buntar och spela in rörelserna med en vanlig mikroskopkamera. Se till att objektivlinsen inte vidrör vätskan. Pipett 0,5 ml av en lösning innehållande P.lacuna på Bacto-agarytan på en sex centimeter petriskål.Låt vätskan komma in i ytan. Efter cirka 20 minuter stänger du petriskålen och observerar filamentens rörelse på ytan med ett 4X eller 10X mål. Fånga timelapse-inspelningarna med en okulär kamera och ett minidatorsystem.Filamenten måste först fokuseras med ögat och sedan genom den okulära kameran. Se till att tidsintervallet mellan de efterföljande bilderna är fem sekunder till en minut. Programmera Linux-skriptet på minidatorn för att styra timelapse-inspelningen.Förbered LED-hållare där fem millimeter lysdioder är monterade för att bestråla ett område på 20 millimeter kvadrat från under till ovan. Mät och justera LED-intensiteterna. Se till att hela inställningen är i ett mörkt rum eller en sluten, mörk behållare.Placera åtta milliliter av mediet som innehåller P.lacuna i en sex centimeter petriskål, stäng petriskålen med locket och placera den på en LED-hållare så att lysdioden är i mitten av petriskålen. Efter vanligtvis två dagar, ta en bild av petriskålen med en smartphone-kamera riktad direkt mot ljusbehandlingens position. Använd en hållare och ett vitt ark som bakgrund för att säkerställa samma avstånd och ljusförhållanden för varje bild.Öppna ImageJ-programvaran, klicka på Arkiv, Öppna och välj filen. Välj den raka knappen och tryck på vänster musknapp för att rita en linje från ena änden av petriskålen till motsatt ände.Se till att linjen passerar genom mitten av cirkeln av filament. Klicka på Analysera och mät för att se petriskålens längd. Klicka sedan på Analysera och plotta profil i ImageJ-menyn.Uppskatta ett medelvärde för pixelintensiteten utanför cirkeln och ett annat medelvärde för pixelintensiteten inuti cirkeln. Rikta musen på Y-positionen mellan dessa värden för att uppskatta X-värdena på båda sidor av cirkeln. Notera båda värdena och beräkna skillnaden.Välj sedan den raka knappen och rita en linje vid det mellersta maximala värdet av pixelintensiteten. Slutligen klickar du på Analysera och sedan På Mät för att få längden på den inre cellcirkeln. Integration och segregering av infoga efter omvandlingen av P.lacuna med PAK1 visas här.Ett PCR-test med yttre primers ungefär en vecka efter transformationen har vanligtvis två band på elektroforesgelen, ett med storleken på vildtypsbandet och ett långsammare migrationsband som indikerar införandet av motståndskassetten. Här representerar banorna 1 till 4 PCR-produkter av filament efter sju dagar, 11 dagar, 14 dagar och 17 dagar efter isoleringen av ett resistent filament, och lane 5 representerar PCR-produkt av vild typ. I det sju dagar långa provet är insatsen närvarande i en liten del av kromosomerna.Denna fraktion ökar fram till 17 dagar, där inget vildtypsband är synligt; det vill säga segregeringen är fullständig. Denna bild representerar vektorn pMH1 för sfGHP-uttryck under kontroll av endogen fykocyanin betapromotor. P.lacuna homolog sekvens, pUC19 vektor ryggrad, och infoga med sfGFP och kanamycinresistens visas här.I pMH1 placeras sfGHP-genen tre prima av fykocyanin beta-genen; därför drivs den av den endogena cpc beta-promotorn. Fluorescensbilder av P.lacuna vildtypsfilament och efter transformation med PAK1, PAK2, PAK3 och pMH1 visas här. Uttrycket av sfGFP drivs av cpc 560-promotorn, a2813-promotorn, psbA2S-promotorn eller den endogena cpc beta-promotorn.De sammanslagna bilderna som presenteras här visar rörligheten hos Phormidium lacuna. Rörelsen på agarytan visas här. Tidsintervallet var en minut.Rörelsen i det flytande mediet presenteras här. Tidsintervallet var 10 sekunder. Naturlig omvandling är en enkel metod.Blanda bara plasmid-DNA med en resistenskassett i homologa sekvenser med cellerna och låt cellerna växa på ett medium med antibiotika. Gener kan inaktiveras och proteiner kan överuttryckas. Detta är viktigt för all grundforskning och för biotekniska studier.I encelliga cyanobakterier där naturlig transformation också etableras behandlades molekylära studier på fotosyntes eller fotoreceptorer, et cetera.

Research

JoVE Journal

Biology

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Blom-dip Omvandling av Arabidopsis thaliana För att undersöka PTSO2:: β-glukuronidasaktivitet Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...