Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research van de Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 en 18K19288). Ruchika werd financieel ondersteund door de Japanse overheid (MEXT-beurs). We bedanken mevrouw Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) en Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) voor hulp bij elektroforese-gerelateerde experimenten.

1. Optimalisatie van het doelfragment
OPMERKING: Vier bewerkte genen werden gebruikt bij de ontwikkeling van dit protocol, waaronder twee nucleaire genen (AT2G16586 en AT5G02670) van A. thaliana, en de genen die coderen voor blauw fluorescerend eiwit (BFP) en verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitgedrukt in HEK293-cellen.
<ol><li>Om genfragmenten met verschillende smeltprofielen te identificeren, die bewerkte versus niet-bewerkte gebieden vertegenwoordigen, ...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites.">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li><li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+RNA+editing:+a+molecular+analysis+of+GluR2,+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation.">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li><li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

RNA-bewerking speelt een belangrijke rol in de biologie; de huidige methoden voor het detecteren van RNA-bewerking, zoals chromatografie en sequencing, vormen echter verschillende uitdagingen vanwege hun hoge kosten, overmatige tijdsvereisten en complexiteit. Het hier beschreven protocol is een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode voor het detecteren van RNA-bewerking die een draagbaar, gemicrosized, TGGE-gebaseerd systeem gebruikt. Dit systeem kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen bewerkte en niet...

Enkelvoudige nucleotidevarianten (SNV's) in genomisch RNA, waaronder A-to-I,C-to-U en U-to-C-varianten, kunnen wijzen op RNA-bewerkingsgebeurtenissen. De detectie van SNV's in RNA blijft echter een technisch uitdagende taak. Conventioneel wordt de verhouding tussen bewerkt en niet-bewerkt RNA bepaald door directe sequencing, allel-specifieke real-time polymerasekettingreactie (PCR) of denaturerende high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) benadert 1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen zijn echter niet bijzonder tijd- of kosteneffectief en hun lage nauwkeurigheid, veroorzaakt door hoge geluidsniveaus, vormt technologische knelpunten voor op RNA gebaseerde SNV-detectie 7,8. Hier beschrijven we een protocol op basis van temperatuurgradiëntgel-elektroforese (TGGE) om single nucleotide polymorfismen (SNP's) te identificeren als een alternatieve methode die de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen voor RNA-bewerkingsanalyses elimineert.
Elektroforese is een voorkeursmethode voor de scheiding en analyse van biomoleculen in life science laboratoria. TGGE maakt de scheiding mogelijk van dubbelstrengs DNA-fragmenten die even groot zijn maar verschillende sequenties hebben. De techniek is gebaseerd op sequentiegerelateerde verschillen in de smelttemperaturen van DNA-fragmenten en daaropvolgende veranderingen in hun mobiliteit in poreuze gels met een lineaire temperatuurgradiëntvan 9,10. Het smelten van DNA-fragmenten genereert specifieke smeltprofielen. Zodra het domein met de laagste smelttemperatuur de overeenkomstige temperatuur op een bepaalde positie in de gel bereikt, vindt de overgang van een spiraalvormige structuur naar een gedeeltelijk gesmolten structuur plaats en zal de migratie van het molecuul praktisch stoppen. Daarom maakt TGGE gebruik van zowel mobiliteit (grootte-informatie) als temperatuur-geïnduceerde structurele overgangen van DNA-fragmenten (sequentie-afhankelijke informatie), waardoor het een krachtige benadering is voor de karakterisering van DNA-fragmenten. De kenmerkpunten in een TGGE-smeltpatroon, die overeenkomen met drie structurele overgangen van het DNA-molecuul, zijn het strenginitiële-dissociatiepunt, het strengmiddendissociatiepunt en het einddissociatiepunt van de streng (figuur 1). Sequentievariaties binnen domeinen, zelfs single-base verschillen, beïnvloeden de smelttemperatuur, vandaar dat moleculen met verschillende sequenties discrete smeltpatronen (denaturatie) vertonen in TGGE-analyses. Daarom kan TGGE worden gebruikt om SNV's in genomisch RNA te analyseren en kan het een onschatbare high-throughput methode zijn voor het detecteren van RNA-bewerking. Deze winst met hoge doorvoer gaat verloren wanneer traditionele op gel-elektroforese gebaseerde TGGE wordt gebruikt. Een geminiaturiseerde versie van TGGE, genaamd microTGGE (μTGGE), kan echter worden gebruikt om de gel-elektroforetische tijd te verkorten en de analyse te versnellen met een 100-voudige toename van de productiviteit11. De eenvoud en compactheid van de μTGGE-methode zijn verbeterd door de introductie van PalmPAGE12, een in de praktijk toepasbaar, handheld en betaalbaar gel-elektroforesesysteem.
Hier wordt een nieuw op TGGE gebaseerd protocol gebruikt om drie soorten RNA-bewerkingsplaatsen (A-to-I, C-to-U en U-to-C) in vier genen te onderzoeken, waaronder twee van Arabidopsis thaliana-weefsels en twee tot expressie gebracht in HEK293-cellen van zoogdieren (figuur 1A). Het protocol integreert het gebruik van PalmPAGE (hardware), een draagbaar systeem voor de snelle detectie van RNA-bewerking, en uMelt (software)13. Met een gemiddelde looptijd van 15-30 minuten maakt dit protocol een snelle, betrouwbare en eenvoudige identificatie van RNA-bewerking mogelijk zonder de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

RNA-bewerking is een proces dat leidt tot posttranscriptionele sequentieveranderingen in RNA's. Detectie en kwantificering van RNA-bewerking zijn voornamelijk afhankelijk van Sanger-sequencing- en RNA-sequencingtechnieken. Deze methoden kunnen echter kostbaar en tijdrovend zijn. In dit protocol wordt een draagbaar microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) systeem gebruikt als een nonsequencing benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking. Het proces is gebaseerd op het principe van elektroforese, waarbij hoge temperaturen worden gebruikt om nucleïnezuurmonsters te denatureren terwijl ze over een polyacrylamidegel bewegen. Over een temperatuurbereik vormt een DNA-fragment een gradiënt van volledig dubbelstrengs DNA naar gedeeltelijk gescheiden strengen en vervolgens naar volledig gescheiden enkelstrengs DNA. RNA-bewerkte sites met verschillende nucleotidebasen produceren verschillende smeltprofielen in μTGGE-analyses. We gebruikten de op μTGGE gebaseerde benadering om de verschillen tussen de smeltprofielen van vier bewerkte RNA-fragmenten en hun overeenkomstige niet-bewerkte (wild-type) fragmenten te karakteriseren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) werden berekend door de bandpatronen geproduceerd door de bewerkte en niet-bewerkte RNA's te vergelijken en werden gebruikt om de reproduceerbaarheid van de methode te beoordelen. Over het algemeen maakt het hier beschreven platform de detectie van zelfs enkele basemutaties in RNA's op een eenvoudige, eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Verwacht wordt dat deze analysetool nieuwe bevindingen van de moleculaire biologie zal helpen.

Gebruik van μTGGE om veranderingen in enkelvoudige nucleotidebases in RNA-bewerkingsgebeurtenissen te identificeren Voor dit protocol werden vier bewerkte genen gebruikt (tabel 1), waaronder het BFP-gen geproduceerd in HEK293-cellen (met C-naar-U RNA-bewerking door de deaminase-enzymen van apolipoproteïne B mRNA-bewerkingsenzymcomplex; APOBEC115), het EGFP-gen dat het okerstopcodon (TAA) bevat dat wordt geproduceerd in HEK293-cellen (met A-naar-I RNA-bewerkin...

Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.

Een nonsequencing-benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

RNA-bewerking speelt een cruciale rol bij menselijke ziekten. Wetenschappers vinden eindeloze toepassing in de medicijnen. Dit protocol demonstreert de toepassing van draagbare temperatuurelektroforesetechnologie als een niet-sequencingbenadering voor de snelle en betrouwbare identificatie van RNA-modificatie in RNA-bewerking zonder de noodzaak van directe RNA-sequencing.De micro tTG-elektroforese-gebaseerde benadering werd gebruikt om de verschillen tussen het smeltprofiel van vier bewerkte RNA-fragmenten en hun overeenkomstige niet-bewerkte fragmenten te karakteriseren. De patroonovereenkomstscores werden gebruikt om de reproduceerbaarheid van de methode te beoordelen. Dit platform maakt de detectie van zelfs single-based substitutie in RNA's mogelijk, op een eenvoudige, eenvoudige en kosteneffectieve manier.Verwacht wordt dat deze analytische tool zal helpen bij het vinden van nieuwe bevindingen in de moleculaire biologie Begin met het identificeren van genfragmenten met verschillende smeltprofielen en het genereren van voorspelde smeltcurven met behulp van de Umelt HETS webgebaseerde tool. Ontwerp drie paren van 300 tot 324 basenpaar genfragmenten voor elk doelgen. Selecteer het niet-bewerkte of bewerkte paar dat het maximale verschil tussen de smeltgebieden op de helicity-as weergeeft voor verdere analyse.Voor micro-TGGE-analyse synthetiseert u het geselecteerde genfragment door PCR-amplificatie. Ontwerp de voorwaartse en achterwaartse primers met behulp van de DNA-dynamosoftware en verifieer de primersequentie met behulp van de NCBI Primer-BLAST-tool. Extraheer totaal RNA uit de bron van bewerkte en niet-bewerkte genen met behulp van standaardmethoden.Synthetiseer het overeenkomstige cDNA, bereid 20 microliter van het PCR-reactiemengsel en stel de PCR in zoals beschreven in het teksthandschrift. Meng vervolgens zes microliter van het PCR-product met drie microliter 6x gelladingskleurstof in een buis van 250 microliter en maak het totale volume tot 12 microliter met steriel water. Bewaar het PCR-product bij 25 graden Celsius tot verder gebruik.Om de gelcassettes te monteren, sandwicht u de bovenste gelplaat tussen de andere twee platen in de gelcassettehouder voor gelpolymerisatie. Om de polyacrylamidegel te bereiden, voegt u 7,2 gram ureum toe aan een buis van 50 milliliter en lost u op in 10 milliliter steriel water. Verwarm het monster in een magnetron gedurende 20 tot 30 seconden.En laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg drie milliliter 5x TBE-buffer, 2,25 milliliter acrylamide bis, 75 microliter 10x ammoniumperssulfaat en 15 microliter TEMED toe aan de oplossing. Giet de geloplossing langzaam in de gelcassettehouder onder een schuine hoek om luchtbellen te voorkomen.Na ongeveer 30 minuten demonteer je de gelcassettes en maak je ze schoon. Gebruik het micro-TGGE-apparaat met een temperatuurgradiënt die loodrecht op de richting van de DNA-migratie is ingesteld. Week de bovenste en onderste elektroforesebufferpads in twee milliliter 1x TBE-buffer.Plaats de gelcassette in de horizontale elektroforesekamer en plaats de bovenste en onderste bufferpads. Laad vervolgens 10 microliter van het PCR-product in de middelste put en één microliter van het PCR-product in elke zijput. Wacht een minuut, sluit de voedingseenheid aan en voed 12 minuten lang 100 volt bij een lineaire temperatuurgradiënt van 15 tot 65 graden Celsius.Nadat de run is voltooid. haal de cassette eruit en verwijder de bovenste glazen afdekking. Giet 300 microliter 10x SYBR Gold vlek op de gel.Visualiseer de smeltprofielen met behulp van de blauwe LED-zaklamp die in het elektroforetische apparaat ter grootte van een handpalm is geïnstalleerd. Herhaal elk elektroforetisch experiment driemaal om de reproduceerbaarheid van de gegevens te bevestigen. Download en open de micro-TGGE analyzer software.Open het JPEG-bestand met de gelafbeelding. Klik op de frame"-knop en selecteer het juiste frame van de gelafbeelding. Klik op de knop "coördinatencorrectie" en voeg twee referentiepunten toe.Klik op de knop "toevoegen van functiepunten" en voeg voorbeeldpunten toe. Sla vervolgens de verwerkte gelafbeeldingsgegevens op in micro-TGGE-indeling. Klik op de voorbeeldknop en selecteer de optie Zoeken naar eenvoudige punten om twee of meer afbeeldingen te vergelijken.Voor het C-naar-U RNA-bewerkingstype vertoonde het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke cBase een langer smeltpatroon aan het eindsmeltpunt van de streng dan het bewerkte monster met de gemodificeerde U-base. Voor het A-tot-I RNA-bewerkingstype vertoonde het bewerkte monster met de gemodificeerde G-base een langer smeltpatroon op het smeltpunt van het strengeinde dan het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke A-base. Voor het omgekeerde U-naar-C RNA-bewerkingstype vertoonde het bewerkte monster in het eerste gen met de gemodificeerde C-base een langer smeltpatroon tussen de begin- en eindsmeltpunten van de streng dan het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke U-base.Een vergelijkbaar patroon werd echter niet waargenomen voor het andere gen. De patroonovereenkomstscores van de C-to-you- en A-to-I RNA-bewerkingstypen waren lager dan die van de twee U-naar-C RNA-bewerkingstypen. Dit verschil had waarschijnlijk te maken met de respectieve locaties van de bewerkingssites.De uMelt HETS-analyse toonde aan dat de C-naar-U-modificatie de smeltcurve langs de temperatuuras naar links zou verschuiven. De patroonovereenkomstscores berekend op basis van micro-TGGE-analyses van de niet-bewerkte en de drie bewerkte fragmenten waren consistent met de resultaten die werden voorspeld met uMelt. Optimalisatie van het doelgenfragment is van cruciaal belang voor een duidelijk onderscheid tussen de bewerkte en niet-bewerkte reden.En dit proces is vereenvoudigd in het huidige protocol.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Rapid Mix Bereiding van Bioinspired Nanoscale hydroxyapatiet voor biomedische toepassingen

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...