Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H02204 et 18K19288). Ruchika a été soutenu financièrement par le gouvernement japonais (bourse MEXT). Nous remercions Mme Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) et le Dr Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) pour leur aide dans les expériences liées à l’électrophorèse.

1. Optimisation du fragment cible
NOTE: Quatre gènes modifiés ont été utilisés dans le développement de ce protocole, y compris deux gènes nucléaires (AT2G16586 et AT5G02670) d’A. thaliana, et les gènes codant pour la protéine fluorescente bleue (BFP) et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) exprimée dans les cellules HEK293.
<ol><li>Pour identifier les fragments de gènes avec différents profils de fusion, représentant des régions modif...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites.">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li><li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+RNA+editing:+a+molecular+analysis+of+GluR2,+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation.">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li><li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

L’édition de l’ARN joue un rôle important en biologie; cependant, les méthodes actuelles de détection de l’édition de l’ARN, telles que la chromatographie et le séquençage, présentent plusieurs défis en raison de leur coût élevé, de leurs exigences de temps excessives et de leur complexité. Le protocole décrit ici est une méthode simple, rapide et rentable de détection de l’édition de l’ARN qui utilise un système portable, microdimensionnel et basé sur TGGE. Ce système peut être utilisé ...

Les variantes mononucléotidiques (SNV) dans l’ARN génomique, y compris les variantes A-to-I, C-to-U et U-to-C, peuvent indiquer des événements d’édition de l’ARN. Cependant, la détection des SNV dans l’ARN reste une tâche techniquement difficile. Classiquement, le rapport entre l’ARN modifié et l’ARN non modifié est déterminé par séquençage direct, réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel spécifique à l’allèle ou par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dénaturante 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ne sont pas particulièrement rapides ou rentables, et leur faible précision, causée par des niveaux élevés de bruit, pose des goulots d’étranglement technologiques pour la détection du SNV à base d’ARN 7,8. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’électrophorèse sur gel à gradient de température (TGGE) pour identifier les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) comme une méthode alternative qui élimine le besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN pour les analyses d’édition de l’ARN.
L’électrophorèse est une méthode privilégiée pour la séparation et l’analyse des biomolécules dans les laboratoires de sciences de la vie. TGGE permet la séparation de fragments d’ADN double brin de la même taille mais ayant des séquences différentes. La technique repose sur des différences liées à la séquence dans les températures de fusion des fragments d’ADN et les changements ultérieurs dans leurs mobilités dans les gels poreux avec un gradient de température linéairede 9,10. La fusion de fragments d’ADN génère des profils de fusion spécifiques. Une fois que le domaine avec la température de fusion la plus basse atteint la température correspondante à une position particulière dans le gel, la transition d’une structure hélicoïdale à une structure partiellement fondue se produit et la migration de la molécule s’arrêtera pratiquement. Par conséquent, TGGE utilise à la fois la mobilité (informations sur la taille) et les transitions structurelles induites par la température des fragments d’ADN (informations dépendantes de la séquence), ce qui en fait une approche puissante pour la caractérisation des fragments d’ADN. Les points caractéristiques d’un motif de fusion TGGE, qui correspondent à trois transitions structurelles de la molécule d’ADN, sont le point de dissociation initiale du brin, le point de dissociation intermédiaire du brin et le point de dissociation finale du brin (Figure 1). Les variations de séquence au sein des domaines, même les différences de base unique, affectent la température de fusion, par conséquent, les molécules avec des séquences différentes montreront des modèles de fusion discrets (dénaturation) dans les analyses TGGE. Par conséquent, TGGE peut être utilisé pour analyser les SNV dans l’ARN génomique et peut être une méthode inestimable à haut débit pour détecter l’édition de l’ARN. Ce gain à haut débit est perdu lorsque le TGGE traditionnel à base d’électrophorèse sur gel est utilisé. Cependant, une version miniaturisée de TGGE, nommée microTGGE (μTGGE), peut être utilisée pour raccourcir le temps électrophorétique du gel et accélérer l’analyse avec une augmentation de 100 fois de la productivité11. La simplicité et la compacité de la méthode μTGGE ont été améliorées par l’introduction de PalmPAGE12, un système d’électrophorèse sur gel applicable sur le terrain, portable et abordable.
Ici, un nouveau protocole basé sur TGGE est utilisé pour examiner trois types de sites d’édition d’ARN (A-to-I, C-to-U et U-to-C) dans quatre gènes, dont deux provenant de tissus d’Arabidopsis thaliana et deux exprimés dans des cellules HEK293 de mammifères (Figure 1A). Le protocole intègre l’utilisation de PalmPAGE (matériel), un système portable pour la détection rapide de l’édition d’ARN, et uMelt (logiciel)13. Avec une durée d’exécution moyenne de 15 à 30 minutes, ce protocole permet une identification rapide, fiable et facile de l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

L’édition de l’ARN est un processus qui conduit à des altérations de séquence posttranscriptionnelles dans les ARN. La détection et la quantification de l’édition de l’ARN reposent principalement sur les techniques de séquençage et de séquençage de l’ARN de Sanger. Cependant, ces méthodes peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps. Dans ce protocole, un système portable d’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) est utilisé comme approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN. Le processus est basé sur le principe de l’électrophorèse, qui utilise des températures élevées pour dénaturer les échantillons d’acides nucléiques lorsqu’ils se déplacent sur un gel de polyacrylamide. Sur une plage de températures, un fragment d’ADN forme un gradient d’ADN entièrement double brin vers des brins partiellement séparés, puis vers un ADN simple brin entièrement séparé. Les sites d’ARN avec des bases nucléotidiques distinctes produisent différents profils de fusion dans les analyses μTGGE. Nous avons utilisé l’approche basée sur μTGGE pour caractériser les différences entre les profils de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités (de type sauvage) correspondants. Les scores de similitude des modèles (PaSS) ont été calculés en comparant les modèles de bande produits par les ARN édités et non édités et ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, la plate-forme décrite ici permet de détecter même des mutations de base unique dans les ARN de manière directe, simple et rentable. On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire.

Utilisation de μTGGE pour identifier les changements de base nucléotidique unique dans les événements d’édition de l’ARN Quatre gènes modifiés ont été utilisés pour ce protocole (tableau 1), y compris le gène BFP produit dans les cellules HEK293 (avec l’édition de l’ARN C à U par les enzymes désaminases du complexe enzymatique d’édition de l’ARNm apolipoprotéine B; APOBEC115), le gène EGFP contenant le codon stop ocre (TAA) produit ...

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A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

La détection rapide et la quantification fiable des événements d’édition de l’ARN à l’échelle génomique restent difficiles et reposent actuellement sur des méthodes de séquençage direct de l’ARN. Le protocole décrit ici utilise l’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) comme méthode simple, rapide et portable de détection de l’édition de l’ARN.

Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

L’édition de l’ARN joue un rôle essentiel dans les maladies humaines. Les scientifiques trouvent une application infinie dans les médicaments. Ce protocole démontre l’application de la technologie d’électrophorèse à température portable en tant qu’approche non séquentielle pour l’identification rapide et fiable de la modification de l’ARN dans l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’un séquençage direct de l’ARN.L’approche basée sur l’électrophorèse micro tTG a été utilisée pour caractériser les différences entre le profil de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités correspondants. Les scores de similitude des modèles ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Cette plate-forme permet la détection de substitutions même à base unique dans les ARN, de manière directe, simple et rentable.On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire Commencez par identifier des fragments de gènes avec différents profils de fusion et générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web Umelt HETS. Concevoir trois paires de 300 à 324 fragments de gènes de paires de bases pour chaque gène cible. Sélectionnez la paire non modifiée ou modifiée qui affiche la différence maximale entre les régions de fusion sur l’axe d’hélicité pour une analyse plus approfondie.Pour l’analyse micro-TGGE, synthétiser le fragment de gène sélectionné par amplification PCR. Concevez les amorces avant et arrière à l’aide du logiciel DNA dynamo et vérifiez la séquence d’amorce à l’aide de l’outil NCBI Primer-BLAST. Extraire l’ARN total de la source des gènes modifiés et non modifiés à l’aide de méthodes standard.Synthétisez l’ADNc correspondant, préparez 20 microlitres du mélange réactionnel DE PCR et configurez la PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Ensuite, mélangez six microlitres du produit PCR avec trois microlitres de colorant à chargement de gel 6x dans un tube de 250 microlitres et composez le volume total à 12 microlitres avec de l’eau stérile. Conservez le produit PCR à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.Pour assembler les cassettes de gel, prenez en sandwich la plaque de gel supérieure entre les deux autres plaques du support de cassette de gel pour la polymérisation du gel. Pour préparer le gel de polyacrylamide, ajoutez 7,2 grammes d’urée dans un tube de 50 millilitres et dissolvez-les dans 10 millilitres d’eau stérile. Chauffer l’échantillon au micro-ondes pendant 20 à 30 secondes.Et laissez-le refroidir à la température ambiante. Ajouter trois millilitres de 5x tampon TBE, 2,25 millilitres d’acrylamide bis, 75 microlitres de 10x persulfate d’ammonium et 15 microlitres de TEMED à la solution. Versez la solution de gel dans le support de cassette de gel lentement à un angle incliné pour éviter les bulles d’air.Après environ 30 minutes, démontez les cassettes de gel et nettoyez-les. Utilisez l’appareil micro-TGGE avec un gradient de température défini perpendiculairement à la direction de la migration de l’ADN. Trempez les tampons tampons d’électrophorèse supérieurs et inférieurs dans deux millilitres de tampon TBE 1x.Placez la cassette de gel dans l’unité de chambre d’électrophorèse horizontale et positionnez les tampons tampons supérieurs et inférieurs. Chargez ensuite 10 microlitres du produit PCR dans le puits central et un microlitre du produit PCR dans chaque puits latéral. Attendez une minute, connectez l’unité d’alimentation et alimentez 100 volts pendant 12 minutes à un gradient de température linéaire de 15 à 65 degrés Celsius.Une fois l’exécution terminée. sortez la cassette et retirez le couvercle supérieur en verre. Versez 300 microlitres de 10x tache SYBR Gold sur le gel.Visualisez les profils de fusion à l’aide de la lampe de poche LED bleue installée dans le dispositif électrophorétique de la taille d’une paume. Répétez chaque expérience électrophorétique trois fois pour confirmer la reproductibilité des données. Téléchargez et ouvrez le logiciel d’analyse micro-TGGE.Ouvrez le fichier JPEG contenant l’image gel. Cliquez sur le bouton « cadre » et sélectionnez le cadre approprié de l’image gel. Cliquez sur le bouton de correction de coordonnées et ajoutez deux points de référence.Cliquez sur le bouton « ajout de points de fonctionnalité » et ajoutez des points d’échantillonnage. Ensuite, enregistrez les données d’image de gel traitées au format micro-TGGE. Cliquez sur le bouton d’exemple et sélectionnez l’option de recherche de points simples pour comparer deux images ou plus.Pour le type d’édition d’ARN C à U, l’échantillon non édité avec la cBase d’origine a montré un motif de fusion plus long au point de fusion final du brin que l’échantillon modifié avec la base U modifiée. Pour le type d’édition d’ARN de A à I, l’échantillon modifié avec la base G modifiée affichait un motif de fusion plus long au point de fusion de l’extrémité du brin que l’échantillon non modifié avec la base A d’origine. Pour le type d’édition d’ARN U-to-C inversé, l’échantillon modifié dans le premier gène avec la base C modifiée a montré un motif de fusion plus long entre les points de fusion initial et final du brin que l’échantillon non édité avec la base U d’origine.Cependant, une tendance similaire n’a pas été observée pour l’autre gène. Les scores de similitude des modèles des types d’édition d’ARN C-to-you et A-to-I étaient inférieurs à ceux des deux types d’édition d’ARN U-to-C. Cette différence était probablement liée aux emplacements respectifs des sites d’édition.L’analyse HETS uMelt a montré que la modification C-to-U déplacerait la courbe de fusion vers la gauche le long de l’axe de température. Les scores de similitude de modèle calculés à partir des analyses micro-TGGE des fragments non édités et des trois fragments édités étaient cohérents avec les résultats prédits à l’aide d’uMelt. L’optimisation du fragment de gène cible est essentielle pour une différenciation claire entre la raison modifiée et non éditée.Et ce processus a été simplifié dans le protocole actuel.

Research

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