Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research fra Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 og 18K19288). Ruchika ble økonomisk støttet av den japanske regjeringen (MEXT-stipend). Vi takker Ms. Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) og Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) for hjelp med elektroforeserelaterte eksperimenter.

1. Optimalisering av målfragmentet
MERK: Fire redigerte gener ble brukt i utviklingen av denne protokollen, inkludert to kjernegener (AT2G16586 og AT5G02670) fra A. thaliana, og genene som koder blått fluorescerende protein (BFP) og forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) uttrykt i HEK293-celler.
<ol><li>For å identifisere genfragmenter med forskjellige smelteprofiler, som representerer redigerte kontra ikke-editerte regioner, generere predikerte smeltekur...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites.">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li><li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+RNA+editing:+a+molecular+analysis+of+GluR2,+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation.">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li><li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

RNA-redigering spiller en viktig rolle i biologi; Imidlertid presenterer nåværende metoder for å oppdage RNA-redigering, for eksempel kromatografi og sekvensering, flere utfordringer på grunn av deres høye kostnader, overdrevne tidskrav og kompleksitet. Protokollen som er beskrevet her, er en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for å oppdage RNA-redigering som bruker et bærbart, mikrosized, TGGE-basert system. Dette systemet kan brukes til å skille mellom redigerte og ikke-redigerte gener før Sanger-sekvenser...

Enkle nukleotidvarianter (SNVer) i genomiske RNA-varianter, inkludert A-til-I-, C-til-U- og U-til-C-varianter, kan indikere RNA-redigeringshendelser. Imidlertid er påvisning av SNVer i RNA fortsatt en teknisk utfordrende oppgave. Konvensjonelt bestemmes forholdet mellom redigert til ikke-editert RNA ved direkte sekvensering, allelspesifikk sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR), eller denaturering av høyytelses væskekromatografi (HPLC) nærmer seg 1,2,3,4,5,6. Disse tilnærmingene er imidlertid ikke spesielt tids- eller kostnadseffektive, og deres lave nøyaktigheter, forårsaket av høye støynivåer, utgjør teknologiske flaskehalser for RNA-basert SNV-deteksjon 7,8. Her beskriver vi en protokoll basert på temperaturgraderingsgelelektroforese (TGGE) for å identifisere enkeltkjernepolymorfier (SNPer) som en alternativ metode som eliminerer behovet for direkte RNA-sekvenseringsmetoder til RNA-redigeringsanalyser.
Elektroforese er en foretrukket metode for separasjon og analyse av biomolekyler i biovitenskapelige laboratorier. TGGE muliggjør separasjon av dobbeltstrengede DNA-fragmenter som er av samme størrelse, men som har forskjellige sekvenser. Teknikken er avhengig av sekvensrelaterte forskjeller i smeltetemperaturene til DNA-fragmenter og påfølgende endringer i deres mobiliteter i porøse geler med en lineær temperaturgradient 9,10. Smelting av DNA-fragmenter genererer spesifikke smelteprofiler. Når domenet med lavest smeltetemperatur når den tilsvarende temperaturen i en bestemt posisjon i gelen, oppstår overgangen fra en spiralstruktur til en delvis smeltet struktur, og migrasjon av molekylet vil praktisk talt stoppe. Derfor benytter TGGE både mobilitet (størrelsesinformasjon) og temperaturinduserte strukturelle overganger av DNA-fragmenter (sekvensavhengig informasjon), noe som gjør det til en kraftig tilnærming til karakterisering av DNA-fragmenter. Funksjonen peker i et TGGE-smeltemønster, som tilsvarer tre strukturelle overganger av DNA-molekylet, er trådens innledende dissosiasjonspunkt, trådens midtdissosiasjonspunkt og trådens ende-dissosiasjonspunkt (figur 1). Sekvensvariasjoner innen domener, selv enkeltbaseforskjeller, påvirker smeltetemperaturen, og derfor vil molekyler med forskjellige sekvenser vise diskrete smeltemønstre (denaturering) i TGGE-analyser. Derfor kan TGGE brukes til å analysere SNVer i genomisk RNA og kan være en uvurderlig høygjennomstrømningsmetode for å oppdage RNA-redigering. Denne høygjennomstrømningsgevinsten går tapt når tradisjonell gelelektroforesebasert TGGE brukes. Imidlertid kan en miniatyrisert versjon av TGGE, kalt microTGGE (μTGGE), brukes til å forkorte gelelektroforetisk tid og akselerere analysen med en 100 ganger økning i produktiviteten11. Enkelheten og kompaktheten til μTGGE-metoden har blitt forbedret ved innføring av PalmPAGE12, et felt-aktuelt, håndholdt og rimelig geleelektroforesesystem.
Her brukes en ny TGGE-basert protokoll til å undersøke tre typer RNA-redigeringssider (A-til-I, C-til-U og U-til-C) i fire gener, inkludert to fra Arabidopsis thaliana vev og to uttrykt i pattedyr HEK293 celler (figur 1A). Protokollen integrerer bruken av PalmPAGE (maskinvare), et bærbart system for rask deteksjon av RNA-redigering og uMelt (programvare)13. Med en gjennomsnittlig kjøretid på 15-30 min muliggjør denne protokollen rask, pålitelig og enkel identifisering av RNA-redigering uten behov for direkte RNA-sekvenseringsmetoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

RNA-redigering er en prosess som fører til posttranscriptionale sekvensendringer i RNAer. Deteksjon og kvantifisering av RNA-redigering er hovedsakelig avhengig av Sanger-sekvensering og RNA-sekvenseringsteknikker. Imidlertid kan disse metodene være kostbare og tidkrevende. I denne protokollen brukes et bærbart mikrotemperatur gradient gel elektroforese (μTGGE) system som en ikke-sekvenserende tilnærming for rask påvisning av RNA-redigering. Prosessen er basert på prinsippet om elektroforese, som bruker høye temperaturer for å denaturere nukleinsyreprøver når de beveger seg over en polyakrylamidgel. På tvers av en rekke temperaturer danner et DNA-fragment en gradient av fullstendig dobbeltstrenget DNA til delvis separerte tråder og deretter helt separert enkeltstrenget DNA. RNA-redigerte steder med distinkte nukleotidbaser produserer forskjellige smelteprofiler i μTGGE-analyser. Vi brukte den μTGGE-baserte tilnærmingen til å karakterisere forskjellene mellom smelteprofilene til fire redigerte RNA-fragmenter og deres tilsvarende ikke-editerte (wild-type) fragmenter. Pattern Similarity Scores (PaSSs) ble beregnet ved å sammenligne båndmønstrene produsert av de redigerte og ikke-editerte RNAene og ble brukt til å vurdere metodens reproduserbarhet. Totalt sett muliggjør plattformen som er beskrevet her, deteksjon av selv enkeltbasemutasjoner i RNAer på en enkel, enkel og kostnadseffektiv måte. Det forventes at dette analyseverktøyet vil bidra til nye molekylærbiologiske funn.

Bruk av μTGGE for å identifisere enkeltkjernebaseendringer i RNA-redigeringshendelser Fire redigerte gener ble brukt til denne protokollen (tabell 1), inkludert BFP-genet produsert i HEK293-celler (med C-til-U RNA-redigering av deaminase enzymer av apolipoprotein B mRNA redigeringsenzymkompleks; APOBEC115), EGFP-genet som inneholder okerstoppkodon (TAA) produsert i HEK293-celler (med A-til-I RNA-redigering ved adenosindeaminase som virker på RNA 1; ADAR1<sup...

Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

Rask deteksjon og pålitelig kvantifisering av RNA-redigeringshendelser i genomisk skala er fortsatt utfordrende og er for tiden avhengig av direkte RNA-sekvenseringsmetoder. Protokollen beskrevet her bruker mikrotemperatur gradient gel elektroforese (μTGGE) som en enkel, rask og bærbar metode for å oppdage RNA-redigering.

En ikke-sekvenserende tilnærming for rask deteksjon av RNA-redigering

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

RNA-redigering spiller en kritisk rolle i menneskelig sykdom. Forsker finner uendelig anvendelse i medisinene. Denne protokollen demonstrerer anvendelsen av bærbar temperaturelektroforeseteknologi som en ikke-sekvenseringstilnærming for rask og pålitelig identifisering av RNA-modifikasjon i RNA-redigering uten behov for direkte RNA-sekvensering.Den mikro tTG elektroforesebaserte tilnærmingen ble brukt til å karakterisere forskjellene mellom smelteprofilen til fire redigerte RNA-fragmenter og deres tilsvarende ikke-redigerte fragmenter. Mønsterlikhetspoengene ble brukt til å vurdere metodens reproduserbarhet. Denne plattformen muliggjør deteksjon av selv enkeltbasert erstatning i RNAer, på en enkel, enkel og kostnadseffektiv måte.Det forventes at dette analytiske verktøyet vil hjelpe nye funn i molekylærbiologi Begynn med å identifisere genfragmenter med forskjellige smelteprofiler og generere predikerte smeltekurver ved hjelp av umelt HETS nettbasert verktøy. Design tre par 300 til 324 basepar genfragmenter for hvert målgen. Velg det ikke-redigerte eller redigerte paret som viser den maksimale forskjellen mellom smelteområdene på helicity-aksen for videre analyse.For mikro-TGGE-analyse, syntetiser det valgte genfragmentet ved PCR-forsterkning. Design de fremre og omvendte primerne ved hjelp av DNA dynamo-programvaren, og bekreft primersekvensen ved hjelp av NCBI Primer-BLAST-verktøyet. Trekk ut total RNA fra kilden til redigerte og ikke-redigerte gener ved hjelp av standardmetoder.Syntetiser den tilsvarende cDNA, forbered 20 mikroliter av PCR-reaksjonsblandingen, og sett opp PCR som beskrevet i tekstmanuskriptet. Bland deretter seks mikroliter av PCR-produktet med tre mikroliter 6x gellastefargestoff i et 250 mikroliterrør, og utgjør det totale volumet til 12 mikroliter med sterilt vann. Oppbevar PCR-produktet ved 25 grader Celsius til videre bruk.For å montere gelkassettene, smør den øverste gelplaten mellom de to andre platene i gelkassetten for gelpolymerisering. For å forberede polyakrylamidgelen, tilsett 7,2 gram urea til et 50 milliliter rør og oppløses i 10 milliliter sterilt vann. Varm prøven i en mikrobølgeovn i 20 til 30 sekunder.Og la det avkjøles til romtemperatur. Tilsett tre milliliter 5x TBE-buffer, 2,25 milliliter akrylamidbis, 75 mikroliter 10x ammoniumpersulfat og 15 mikroliter TEMED til løsningen. Hell geloppløsningen langsomt inn i gelkassettens holder i en vippevinkel for å unngå luftbobler.Etter ca. 30 minutter demonterer du gelkassettene og rengjør dem. Bruk mikro-TGGE-apparatet med en temperaturgradient satt vinkelrett på retningen av DNA-migrasjon. Bløtlegg de øvre og nedre elektroforesebufferputene i to milliliter 1x TBE-buffer.Plasser gelkassetten i den horisontale elektroforesekammerenheten, og plasser de øvre og nedre bufferputene. Last deretter 10 mikroliter av PCR-produktet inn i midtbrønnen, og en mikroliter av PCR-produktet inn i hver sidebrønn. Vent et øyeblikk, koble til kraftenheten og tilførsel 100 volt i 12 minutter ved en lineær temperaturgradient på 15 til 65 grader Celsius.Når kjøringen er fullført. ta ut kassetten og fjern det øvre glassdekselet. Hell 300 mikroliter 10x SYBR Gold flekk på gelen.Visualiser smelteprofilene ved hjelp av den blå LED-lommelykten som er installert i den elektroforetiske enheten i palmestørrelse. Gjenta hvert elektroforetisk eksperiment tre ganger for å bekrefte reproduserbarheten av dataene. Last ned og åpne micro-TGGE-analysatorprogramvaren.Åpne JPEG-filen som inneholder gelbildet. Klikk på rammen"-knappen og velg riktig ramme på gelbildet. Klikk på koordinatkorrigeringen"-knappen og legg til to referansepunkter.Klikk på tillegg av funksjonspunkter"-knappen og legg til eksempelpunkter. Lagre deretter de behandlede gelbildedataene i micro-TGGE-format. Klikk på eksempelknappen og velg alternativet søk etter enkle punkter"for å sammenligne to eller flere bilder.For redigeringstypen C-to-U viste det ikke-redigerte eksemplet med den opprinnelige cBase et lengre smeltemønster ved smeltepunktet for strandendepunktet enn det redigerte eksemplet med den modifiserte U-basen. For redigeringstypen A-til-I RNA viste det redigerte eksemplet med den endrede G-basen et lengre smeltemønster ved strand-end-smeltepunktet enn det ikke-redigerte eksemplet med den opprinnelige A-basen. For den omvendte U-til-C RNA-redigeringstypen viste den redigerte prøven i det første genet med den modifiserte C-basen et lengre smeltemønster mellom trådens innledende og avsluttende smeltepunkter enn den ikke-redigerte prøven med den opprinnelige U-basen.Et lignende mønster ble imidlertid ikke observert for det andre genet. Mønsterlikhetsresultatene for redigeringstypene C-to-you og A-to-I RNA var lavere enn for de to U-til-C RNA-redigeringstypene. Denne forskjellen var sannsynligvis relatert til de respektive plasseringene til redigeringsnettstedene.uMelt HETS-analysen viste at C-to-U-modifikasjonen ville flytte smeltekurven til venstre langs temperaturaksen. Mønsterlikhetsresultatene beregnet fra mikro-TGGE-analyser av de ikke-redigerte og de tre redigerte fragmentene var i samsvar med resultatene som ble spådd ved hjelp av uMelt. Optimalisering av målgenfragmentet er avgjørende for klar differensiering mellom den redigerte og ikke-redigerte årsaken.Og denne prosessen er forenklet i den nåværende protokollen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

En Cre-LOX P Rekombinasjon Approach for påvisning av Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis rotvekst med Rapid manipulering av Root miljøet ved hjelp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Skin tatovering som en ny tilnærming for DNA vaksine levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av Complex Systems Bruke Design of Experiments Approach: Forbigående Protein Expression i tobakk som et Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation av Enkelt RNA-molekyler ved optisk pinsett

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescens Biomembrane Force Probe: Samtidig Kvantifisering av Receptor-ligand Kinetics og Binding-indusert intracellulære signal på en enkelt celle

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Rapid Mix Utarbeidelse av Bioinspired nanoskala hydroksyapatitt for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...