Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
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Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research da Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 e 18K19288). Ruchika foi apoiado financeiramente pelo governo japonês (bolsa MEXT). Agradecemos à Sra. Radhika Biyani (Laboratório Takagi, JAIST) e Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por ajuda com experimentos relacionados à eletroforose.

1. Otimização do fragmento de destino
NOTA: Quatro genes editados foram usados no desenvolvimento deste protocolo, incluindo dois genes nucleares (AT2G16586 e AT5G02670) de A. thaliana, e os genes codificando proteína fluorescente azul (BFP) e proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) expressa em células HEK293.
<ol><li>Para identificar fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão, representando regiões editadas versus não diutadas, gerar curvas d...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. 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A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

A edição de RNA desempenha um papel importante na biologia; no entanto, os métodos atuais de detecção da edição de RNA, como cromatografia e sequenciamento, apresentam vários desafios devido ao seu alto custo, exigências de tempo excessivo e complexidade. O protocolo descrito aqui é um método simples, rápido e econômico de detectar a edição de RNA que usa um sistema portátil, microdimensionado, baseado em TGGE. Este sistema pode ser usado para diferenciar entre genes editados e não dilatados antes do seq...

Variantes de nucleotídeos únicos (SNVs) em RNA genômica, incluindo variantes A-to-I, C-to-U e U-to-C, podem indicar eventos de edição de RNA. No entanto, a detecção de SNVs no RNA continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora. Convencionalmente, a razão de RNA editado para RNA não diquedado é determinada por sequenciamento direto, reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR) específica de alelo ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se aproximade 1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens não são particularmente tempo ou custo-benefício, e suas baixas precisãos, causadas por altos níveis de ruído, representam gargalos tecnológicos para a detecção de SNV baseada em RNA 7,8. Aqui, descrevemos um protocolo baseado na eletroforese de gel gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) como um método alternativo que elimina a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA para análises de edição de RNA.
A eletroforese é um método preferido para a separação e análise de biomoléculas em laboratórios de ciências da vida. O TGGE permite a separação de fragmentos de DNA de duplas vertentes que têm o mesmo tamanho, mas têm sequências diferentes. A técnica conta com diferenças relacionadas à sequência nas temperaturas de fusão dos fragmentos de DNA e mudanças subsequentes em suas mobilidades em géis porosos com um gradiente linear de temperatura 9,10. O derretimento de fragmentos de DNA gera perfis específicos de fusão. Uma vez que o domínio com a menor temperatura de fusão atinge a temperatura correspondente em uma posição particular no gel, a transição de uma estrutura helicoidal para uma estrutura parcialmente derretida ocorre, e a migração da molécula praticamente parará. Portanto, o TGGE utiliza tanto a mobilidade (informação de tamanho) quanto transições estruturais induzidas pela temperatura de fragmentos de DNA (informações dependentes de sequências), tornando-se uma abordagem poderosa para a caracterização de fragmentos de DNA. Os pontos de característica em um padrão de fusão TGGE, que correspondem a três transições estruturais da molécula de DNA, são o ponto de dissociação inicial da cadeia, o ponto de dissociação do fio médio e o ponto de dissociação final do fio (Figura 1). Variações sequenciais dentro dos domínios, mesmo diferenças de base única, afetam a temperatura de fusão, portanto, moléculas com diferentes sequências mostrarão padrões discretos de fusão (desnaturação) nas análises TGGE. Portanto, o TGGE pode ser usado para analisar SNVs no RNA genômico e pode ser um método inestimável de alto rendimento de detectar edição de RNA. Este ganho de alta produtividade é perdido quando o TGGE tradicional baseado em eletroforese em gel é usado. No entanto, uma versão miniaturizada de TGGE, chamada microTGGE (μTGGE), pode ser usada para encurtar o tempo eletroforético do gel e acelerar a análise com um aumento de 100 vezes na produtividade11. A simplicidade e compactação do método μTGGE foram melhoradas com a introdução do PalmPAGE12, um sistema de eletroforese gel aplicável em campo, portátil e acessível.
Aqui, um novo protocolo baseado em TGGE é usado para examinar três tipos de sites de edição de RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) em quatro genes, incluindo dois de tecidos arabidopsis thaliana e dois expressos em células de mamíferos HEK293 (Figura 1A). O protocolo integra o uso do PalmPAGE (hardware), um sistema portátil para detecção rápida de edição de RNA e uMelt (software)13. Com um tempo médio de execução de 15-30 minutos, este protocolo permite uma identificação rápida, confiável e fácil da edição de RNA sem a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

A edição de RNA é um processo que leva a alterações de sequência pós-transcricional em RNAs. A detecção e quantificação da edição de RNA dependem principalmente de técnicas de sequenciamento de Sanger e sequenciamento de RNA. No entanto, esses métodos podem ser caros e demorados. Neste protocolo, um sistema portátil de eletroforese de gel de microtemperature (μTGGE) é usado como uma abordagem de não-sequenciamento para a rápida detecção da edição de RNA. O processo é baseado no princípio da eletroforese, que usa altas temperaturas para desnaturar amostras de ácido nucleico enquanto se movem através de um gel de poliacrilamida. Através de uma série de temperaturas, um fragmento de DNA forma um gradiente de DNA totalmente duplo para fios parcialmente separados e, em seguida, para DNA totalmente separado de uma única cadeia. Sites editados por RNA com bases nucleotídeas distintas produzem diferentes perfis de fusão em análises μTGGE. Utilizamos a abordagem baseada em μTGGE para caracterizar as diferenças entre os perfis de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não ditados correspondentes (tipo selvagem). Os Escores de Similaridade do Padrão (PaSSs) foram calculados comparando-se os padrões de banda produzidos pelas RNAs editadas e não diutadas e foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. No geral, a plataforma descrita aqui permite a detecção de mutações de base única em RNAs de forma simples, simples e econômica. Espera-se que esta ferramenta de análise ajude novas descobertas de biologia molecular.

Uso de μTGGE para identificar mudanças de base de nucleotídeos únicos em eventos de edição de RNA Quatro genes editados foram usados para este protocolo (Tabela 1), incluindo o gene BFP produzido em células HEK293 (com edição de RNA C-to-U pelas enzimas desaminase do complexo de enzimas de edição de mRNA apolipoproteína B; APOBEC115), o gene EGFP contendo o codon ocre stop (TAA) produzido em células HEK293 (com edição de RNA A-to-I por adenosina ...

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A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

A edição de RNA tem um papel crítico na doença humana. Cientistas estão encontrando aplicação sem fim nos medicamentos. Este protocolo demonstra a aplicação da tecnologia de eletroforese de temperatura portátil como uma abordagem não sequenciamento para a identificação rápida e confiável da modificação do RNA na edição de RNA sem a necessidade de sequenciamento direto do RNA.A abordagem baseada em micro tTG foi utilizada para caracterizar as diferenças entre o perfil de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não editados correspondentes. Os escores de similaridade padrão foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. Esta plataforma permite a detecção de uma substituição única em RNAs, de forma simples, simples e econômica.Espera-se que esta ferramenta analítica ajude a nova descoberta na biologia molecular Comece identificando fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão e gere curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web Umelt HETS. Projete três pares de 300 a 324 fragmentos genéticos de par de base para cada gene alvo. Selecione o par não editado ou editado que mostre a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo de helicidade para análise posterior.Para análise micro-TGGE, sintetize o fragmento genético selecionado por amplificação PCR. Projete os primers dianteiros e invertidos usando o software de dínamo de DNA e verifique a sequência de primer usando a ferramenta NCBI Primer-BLAST. Extrair RNA total da fonte de genes editados e não editados usando métodos padrão.Sintetizar o cDNA correspondente, preparar 20 microliters da mistura de reação PCR e configurar o PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, misture seis microliters do produto PCR com três microliters de corante de carregamento de gel 6x em um tubo de 250 microliteres, e compõe o volume total para 12 microliters com água estéril. Armazene o produto PCR a 25 graus Celsius até usar mais.Para montar as fitas de gel, sanduiche a placa de gel superior entre as outras duas placas no porta-fitas de gel para polimerização de gel. Para preparar o gel de acrilamida poli, adicione 7,2 gramas de ureia a um tubo de 50 mililitros e dissolva em 10 mililitros de água estéril. Aqueça a amostra em um micro-ondas por 20 a 30 segundos.E deixe esfriar até a temperatura ambiente. Adicione três mililitros de tampão 5x TBE, 2,25 mililitros de acrilamida bis, 75 microliters de persulfito de amônio de 10x e 15 microliters de TEMED à solução. Despeje a solução de gel no suporte de de gel lentamente em um ângulo inclinado para evitar bolhas de ar.Após cerca de 30 minutos, desmonte as fitas de gel e limpe-as. Use o aparelho micro-TGGE com um conjunto de gradiente de temperatura perpendicular à direção da migração do DNA. Mergulhe as almofadas tampão de eletroforese superior e inferior em dois mililitros de tampão 1x TBE.Coloque o de gel na unidade horizontal de câmara de eletroforese e posicione as almofadas tampão superior e inferior. Em seguida, carregue 10 microliters do produto PCR no meio bem, e um microliter do produto PCR em cada lado bem. Aguarde por um minuto, conecte a unidade de alimentação e forneça 100 volts por 12 minutos a um gradiente linear de temperatura de 15 a 65 graus Celsius.Depois que a corrida tiver sido concluída. tirar o e remover a tampa superior do vidro. Despeje 300 microliters de 10x mancha de ouro SYBR no gel.Visualize os perfis de fusão usando a lanterna LED azul instalada no dispositivo eletroforético do tamanho da palma da mão. Repita todos os experimentos eletroforéticos três vezes para confirmar a reprodutibilidade dos dados. Baixe e abra o software do analisador micro-TGGE.Abra o arquivo JPEG contendo a imagem em gel. Clique no botão "frame" e selecione o quadro apropriado da imagem em gel. Clique no botão de correção da coordenada e adicione dois pontos de referência.Clique na adição do botão "pontos de recurso" e adicione pontos de amostra. Em seguida, salve os dados de imagem de gel processados no formato micro-TGGE. Clique no botão de amostra e selecione a opção busca por pontos simples para comparar duas ou mais imagens.Para o tipo de edição de RNA C-to-U, a amostra não editada com o cBase original, mostrou um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão da extremidade do fio do que a amostra editada com a base U modificada. Para o tipo de edição de RNA A-to-I, a amostra editada com a base G modificada, exibiu um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão da extremidade do fio do que a amostra não editada com a base A original. Para o tipo inverso de edição de RNA U-to-C, a amostra editada no primeiro gene com a base C modificada mostrou um padrão de fusão mais longo entre os pontos de fusão inicial e final da cadeia do que a amostra não editada com a base U original.No entanto, um padrão semelhante não foi observado para o outro gene. As pontuações de similaridade padrão dos tipos de edição de RNA C-to-You e A-to-I foram inferiores às dos dois tipos de edição de RNA U-to-C. Essa diferença provavelmente estava relacionada aos respectivos locais dos sites de edição.A análise do uMelt HETS mostrou que a modificação C-to-U mudaria a curva de fusão para a esquerda ao longo do eixo de temperatura. Os escores de similaridade de padrão calculados a partir de análises micro-TGGE dos não editados e dos três fragmentos editados foram consistentes com os resultados previstos usando o uMelt. A otimização do fragmento genético alvo é fundamental para uma clara diferenciação entre a razão editada e não editada.E esse processo foi simplificado no protocolo atual.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

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receive the results. ...

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