Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H02204 y 18K19288). Ruchika fue apoyada financieramente por el gobierno japonés (beca MEXT). Agradecemos a la Sra. Radhika Biyani (Laboratorio Takagi, JAIST) y al Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por su ayuda con los experimentos relacionados con la electroforesis.

1. Optimización del fragmento objetivo
NOTA: Se utilizaron cuatro genes editados en el desarrollo de este protocolo, incluidos dos genes nucleares (AT2G16586 y AT5G02670) de A. thaliana, y los genes que codifican la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) expresadas en células HEK293.
<ol><li>Para identificar fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión, que representan regiones editadas versus no editadas, gen...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites.">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li><li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+RNA+editing:+a+molecular+analysis+of+GluR2,+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation.">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li><li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no e...

Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN 7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.
La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal 9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad11. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE12, un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.
Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)13. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.

Uso de μTGGE para identificar cambios en la base de un solo nucleótido en eventos de edición de ARN Para este protocolo se utilizaron cuatro genes editados (Tabla 1), incluyendo el gen BFP producido en células HEK293 (con edición de ARN C-to-U por las enzimas desaminasas del complejo enzimático de edición de ARNm de apolipoproteína B; APOBEC115), el gen EGFP que contiene el codón de parada ocre (TAA) producido en células HEK293 (con edición de ARN A-...

Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.

Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

La edición de ARN juega un papel crítico en las enfermedades humanas. Los científicos están encontrando una aplicación infinita en los medicamentos. Este protocolo demuestra la aplicación de la tecnología de electroforesis de temperatura portátil como un enfoque de no secuenciación para la identificación rápida y confiable de la modificación de ARN en la edición de ARN sin la necesidad de secuenciación directa de ARN.Se utilizó el enfoque basado en la electroforesis micro tTG para caracterizar las diferencias entre el perfil de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados. Se utilizaron las puntuaciones de similitud del patrón para evaluar la reproducibilidad del método. Esta plataforma permite la detección incluso de sustitución de base única en ARN, de manera directa, simple y rentable.Se anticipa que esta herramienta analítica ayudará a nuevos hallazgos en biología molecular Comenzar identificando fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión y generar curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web Umelt HETS. Diseñe tres pares de 300 a 324 fragmentos de genes de pares de bases para cada gen objetivo. Seleccione el par no editado o editado que muestra la diferencia máxima entre las regiones de fusión en el eje de helicidad para un análisis más detallado.Para el análisis micro-TGGE, sintetice el fragmento de gen seleccionado mediante amplificación por PCR. Diseñe los cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizando el software de dinamo de ADN, y verifique la secuencia de imprimación utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST. Extraer el ARN total de la fuente de genes editados y no editados utilizando métodos estándar.Sintetizar el ADNc correspondiente, preparar 20 microlitros de la mezcla de reacción de PCR y configurar la PCR como se describe en el manuscrito de texto. Luego, mezcle seis microlitros del producto PCR con tres microlitros de tinte de carga de gel 6x en un tubo de 250 microlitros, y componga el volumen total a 12 microlitros con agua estéril. Guarde el producto de PCR a 25 grados centígrados hasta su uso posterior.Para ensamblar los casetes de gel, coloque la placa de gel superior entre las otras dos placas en el soporte de casete de gel para la polimerización del gel. Para preparar el gel de poliacrilamida, agregue 7,2 gramos de urea a un tubo de 50 mililitros y disuelva en 10 mililitros de agua estéril. Calentar la muestra en un microondas durante 20 a 30 segundos.Y deja que se enfríe a temperatura ambiente. Agregue tres mililitros de tampón TBE 5x, 2.25 mililitros de acrilamida bis, 75 microlitros de persulfato de amonio 10x y 15 microlitros de TEMED a la solución. Vierta la solución de gel en el soporte del cassette de gel lentamente en un ángulo inclinado para evitar burbujas de aire.Después de unos 30 minutos, desmonte los casetes de gel y límpielos. Utilice el aparato micro-TGGE con un gradiente de temperatura establecido perpendicularmente a la dirección de la migración del ADN. Remoje las almohadillas tampón de electroforesis superior e inferior en dos mililitros de tampón TBE 1x.Coloque el cassette de gel en la unidad de cámara de electroforesis horizontal y coloque las almohadillas tampón superior e inferior. Luego cargue 10 microlitros del producto de PCR en el pozo medio y un microlitro del producto de PCR en cada pozo lateral. Espere un minuto, conecte la unidad de alimentación y suministre 100 voltios durante 12 minutos a un gradiente de temperatura lineal de 15 a 65 grados centígrados.Una vez finalizada la ejecución. saque el cassette y retire la tapa superior de vidrio. Vierta 300 microlitros de 10x tinción SYBR Gold sobre el gel.Visualice los perfiles de fusión utilizando la linterna LED azul instalada en el dispositivo electroforético del tamaño de la palma de la mano. Repita cada experimento electroforético tres veces para confirmar la reproducibilidad de los datos. Descargue y abra el software del analizador micro-TGGE.Abra el archivo JPEG que contiene la imagen del gel. Haga clic en el botón "marco" y seleccione el marco apropiado de la imagen del gel. Haga clic en el botón "corrección de coordenadas" y agregue dos puntos de referencia.Haga clic en el botón "Adición de puntos de característica" y agregue puntos de muestra. Luego, guarde los datos de imagen de gel procesados en formato micro-TGGE. Haga clic en el botón de muestra y seleccione la opción de búsqueda de puntos simples para comparar dos o más imágenes.Para el tipo de edición de ARN de C a U, la muestra no editada con la cBase original mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión final de la hebra que la muestra editada con la base U modificada. Para el tipo de edición de ARN de A a I, la muestra editada con la base G modificada mostró un patrón de fusión más largo en el punto de fusión del extremo de la hebra que la muestra no editada con la base A original. Para el tipo de edición inversa de ARN de U a C, la muestra editada en el primer gen con la base C modificada mostró un patrón de fusión más largo entre los puntos de fusión inicial y final de la hebra que la muestra no editada con la base U original.Sin embargo, no se observó un patrón similar para el otro gen. Las puntuaciones de similitud de patrones de los tipos de edición de ARN de C a U y de A a I fueron más bajas que las de los dos tipos de edición de ARN de U a C. Esta diferencia probablemente estaba relacionada con las ubicaciones respectivas de los sitios de edición.El análisis hets de uMelt mostró que la modificación de C a U desplazaría la curva de fusión hacia la izquierda a lo largo del eje de temperatura. Las puntuaciones de similitud de patrones calculadas a partir de análisis micro-TGGE de los fragmentos no editados y los tres editados fueron consistentes con los resultados predichos utilizando uMelt. La optimización del fragmento de gen objetivo es fundamental para una clara diferenciación entre la razón editada y no editada.Y este proceso se ha simplificado en el protocolo actual.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Investigación

Bioingeniería

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Enfoque de recombinación para la detección de la fusión celular En Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Piel tatuaje como un nuevo enfoque para la entrega de vacunas de ADN

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Mezcla rápida Preparación de Bioinspirada nanoescala hidroxiapatita para aplicaciones biomédicas

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...