Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

تم تمويل البحث من خلال منح DZHK 81Z0600207 (JH و PS و DM) و 81X2600253 (AD و TS).
يود المؤلفون أن يشكروا كلوديا فاهني ومي بينغ وو وماتياس سيميش على دعمهم في إعداد الإعدادات، وكذلك على الصيانة المنتظمة لزراعة الأنسجة.

تمت الموافقة على جمع الأنسجة للتجارب الموصوفة هنا من قبل مجالس المراجعة المؤسسية بجامعة ميونيخ وجامعة الرور بوخوم. أجريت الدراسات وفقا لإعلان هلسنكي التوجيهي. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة قبل جمع الأنسجة.
1. اكتساب الأنسجة
<ol><li>الحصول على الأنسجة البشري...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

في الماضي ، حققت أبحاث القلب والأوعية الدموية تقدما كبيرا في زراعة الخلايا العضلية القلبية. ومع ذلك ، فإن زراعة 3D من الخلايا العضلية القلبية مع الهندسة السليمة ليست راسخة بعد. بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة المطبقة على زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي ، فإن البروتوكول الذي ?...

في العقد الماضي ، حققت زراعة خلايا عضلة القلب في المختبر تقدما كبيرا ، بدءا من تقنيات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (3D) إلى استخدام المواد العضوية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المتمايزة في الخلايا العضلية القلبية1،2،3. وقد أظهرت زراعة الخلايا خارج الجسم الحي والخلايا الأولية أنها ذات قيمة كبيرة ، خاصة بالنسبة للدراسات الجينية وتطوير الأدوية4،5،6. استخدام الأنسجة البشرية يحسن القيمة الانتقالية للنتائج. زراعة 3D على المدى الطويل من أنسجة عضلة القلب مع الهندسة سليمة، ومع ذلك، ليست راسخة بشكل جيد. الهندسة السليمة هي ميزة رئيسية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي ، حيث أن وظيفة القلب المناسبة ، والتواصل بين الخلايا المختلفة ، وكذلك تفاعلات مصفوفة الخلايا هي شروط أساسية. مرت زراعة أنسجة عضلة القلب بمراحل مختلفة من التطور. كان معدل نجاح واستقرار زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي منخفضا جدا في البداية ، لكن الأساليب الحديثة أسفرت عن نتائج واعدة7،8،9،10،11.
من بين هؤلاء ، كان فيشر وآخرون أول من أثبت أن الجدوى والأداء الانقباضي لأنسجة عضلة القلب البشرية يمكن الحفاظ عليها في زراعة الخلايا خارج الجسم الحي لعدة أسابيع7. استندت تقنيتهم إلى شرائح الأنسجة الرقيقة المقطوعة من عضلة القلب البشرية المزروعة ، والتي تم تركيبها في غرف زراعة مطورة حديثا توفر ظروفا ميكانيكية حيوية محددة وتحفيزا كهربائيا مستمرا. تشبه طريقة الزراعة هذه إلى حد كبير وظيفة أنسجة عضلة القلب في الجسم الحي ، وقد تم استنساخها من قبل العديد من مجموعات البحث المستقلة2،12،13،14،15. والأهم من ذلك، أن الغرف التي استخدمها فيشر وآخرون مكنت أيضا من التسجيل المستمر للقوى المتقدمة لمدة تصل إلى 4 أشهر، وبالتالي فتحت فرصا غير مسبوقة للبحوث الفسيولوجية والدوائية على عضلة القلب البشرية 7 السليمة.
تم تطوير تقنيات مماثلة بشكل مستقل من قبل مجموعات أخرى وتطبيقها على عضلة القلب البشرية والفئران والخنازير والأرانب7،10،11. طور بيتوليس وآخرون لاحقا طريقة أكثر فسيولوجية ، والتي تعيد إنتاج العلاقة الطبيعية بين القوة والطول خلال دورة الانكماش ، ولكنها أقل ملاءمة للتحليل عالي الإنتاجية16. على هذا النحو ، يمكن اعتبار النهج العام للزراعة المحاكاة الحيوية خطوة أخرى في الحد من التجارب على الحيوانات وصقلها واستبدالها (3R).
ومع ذلك، فإن استغلال هذه الإمكانات يتطلب إجراءات موحدة، وتحليلات عالية المحتوى، ومستوى إنتاجية مرتفعا. نحن نقدم تقنية تجمع بين التقطيع الآلي لعضلة القلب البشرية الحية مع الصيانة في المختبر في نظام زراعة المحاكاة الحيوية الذي أصبح متاحا تجاريا (انظر جدول المواد). مع النهج المقترح ، فإن عدد الشرائح الفردية التي يمكن إنشاؤها من عينة عضلة القلب عبر الجدارية واحد محدود فقط بوقت المعالجة. غالبا ما تنتج عينة ذات حجم وجودة كافيين (3 سم × 3 سم) 20-40 شريحة أنسجة يتم قطعها بسهولة باستخدام اهتزاز آلي. يمكن وضع هذه الشرائح في غرف الزراعة التابعة للنظام. تسمح الغرف بالتحفيز الكهربائي ، الذي يمكن تعديل معلماته (أي مدة النبض ، والقطبية ، والمعدل ، والتيار) ، بالإضافة إلى ضبط الحمل المسبق واللاحق ، باستخدام أسلاك زنبركية داخل الغرف. يتم تسجيل تقلص كل شريحة من حركة مغناطيس صغير متصل بسلك زنبركي ويتم عرضه كرسم بياني قابل للتفسير. يمكن تسجيل البيانات في جميع الأوقات وتحليلها باستخدام البرامج المتاحة مجانا. بصرف النظر عن وتيرة خط الأساس الثابتة ، يمكن تنفيذ البروتوكولات المجدولة لتقييم فترة المقاومة للحرارة وظيفيا ، وعتبة التحفيز ، وتقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعلاقة تردد القوة.
هذه الزراعة المحاكاة الحيوية طويلة الأجل لشرائح عضلة القلب المتعددة من قلب فردي تمهد الطريق للبحوث المستقبلية خارج الجسم الحي في كل من الأنسجة البشرية والحيوانية ، وتسهل فحص الآثار الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. وقد تم تطبيقه بالفعل على مختلف الأساليب التجريبية2،12،13،15. هنا ، نقدم وصفا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد الأنسجة البشرية ونقدم حلولا لمشاكل الزراعة التي تواجهها بشكل متكرر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

شهدت زراعة الخلايا العضلية القلبية عددا كبيرا من التطورات ، بدءا من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) إلى المواد العضوية المشتقة من iPSC. في عام 2019 ، تم عرض طريقة خارج الجسم الحي لزراعة شرائح عضلة القلب التي تم الحصول عليها من عينات القلب البشري ، بينما تقترب في حالة الجسم الحي من تقلص عضلة القلب. تنشأ هذه العينات في الغالب من عمليات زرع القلب أو مواضع أجهزة مساعدة البطين الأيسر. باستخدام اهتزاز ونظام زراعة مطور خصيصا ، يتم وضع شرائح بسماكة 300 ميكرومتر بين سلك ثابت وسلك زنبركي ، مما يسمح بزراعة مستقرة وقابلة للتكرار لعدة أسابيع. أثناء الزراعة ، يتم تحفيز الشرائح باستمرار وفقا للإعدادات الفردية. يمكن عرض الانقباضات وتسجيلها في الوقت الفعلي ، ويمكن تطبيق العوامل الدوائية بسهولة. يمكن جدولة بروتوكولات التحفيز المحددة من قبل المستخدم وتنفيذها لتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. علاوة على ذلك ، يتيح النظام إعدادا متغيرا قبل وبعد الحمل لزراعة أكثر فسيولوجية.
هنا ، نقدم دليلا خطوة بخطوة حول كيفية توليد زراعة ناجحة على المدى الطويل لشرائح عضلة القلب البطينية اليسرى البشرية ، باستخدام حل زراعة محاكاة حيوية تجاري.

تم عرض تقلص شرائح عضلة القلب على شاشة الكمبيوتر بعد إدخال غرفة الزراعة في الموصل المقابل لها (الشكل 3). بدأ تقلص شرائح عضلة القلب البشرية فور التحفيز. تقلصت الشرائح لمدة 5-10 دقائق. كان هذا مرئيا كزيادة في القوى الانبساطية ، الناجمة عن تقلص منشط لكسور الأنسجة التالفة. تم إرجاع ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

نقدم بروتوكولا لزراعة أنسجة عضلة القلب البطينية البشرية خارج الجسم الحي. يسمح بإجراء تحليل مفصل لقوة الانكماش والحركيات ، بالإضافة إلى تطبيق الحمل المسبق واللاحق لمحاكاة البيئة الفسيولوجية في الجسم الحي عن كثب.

إعداد أنسجة عضلة القلب البشرية للزراعة على المدى الطويل

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن زراعة شرائح أنسجة البطين الأيسر البشري خارج الجسم الحي في غرفة محاكاة حيوية. تطبيق الأحمال المسبقة واللاحقة يحسن تشابه البيئة الفسيولوجية. تسمح هذه التقنية بالتسجيل المستمر لتقلص الأنسجة.تسمح بروتوكولات التحفيز المعرفة من قبل المستخدم بتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. إن زراعة شرائح عضلة القلب على المدى الطويل ، باستخدام هذا الإعداد ، ستمهد الطريق للأبحاث المستقبلية خارج الجسم الحي ، مما يسهل هذا الفحص للتأثيرات الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. للبدء ، قم بغمر غرف الزراعة وأقطاب الجرافيت في لتر واحد من محلول الأيزوبروبانول بنسبة 10٪ وقم بتحريكها بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، انقل الغرف إلى محلول أيزوبروبانول 100٪ لمدة 3 دقائق ، ثم اسمح للغرف وأقطاب الجرافيت بالجفاف في الهواء تحت غطاء تدفق صفائحي. قم بإرفاق لوحة دوائر كهربائية بكل غرفة وفقا للمواضع المتاحة على الروك . ضع قطبين كهربائيين من الجرافيت على لوحة الدوائر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم ضع غطاء طبق بتري بقطر 35 ملم على الغرفة لمنع العدوى.بعد ذلك ، املأ درج القطع بنسبة تصل إلى 90 إلى 95٪ باستخدام مخزن مؤقت للتقطيع. انقل عينة الأنسجة إلى طبق بتري بقطر 100 ملم مملوء بمخزن مؤقت للتقطيع البارد ، وضع الطبق على طبق تبريد عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة ترابيكول الشغاف عن طريق الإمساك بالشغاف باستخدام ملاقط ، ثم استخدم المقص لقطع ما يقرب من 3 ملليمترات من أنسجة الشغاف.قم بتثبيت عينة الأنسجة المقطوعة ، جانب الشغاف حتى رقعة مطاطية 2 × 2 سم باستخدام أربع إبر قياس 20 × 70 مم بقياس 20 × 70 مم مثبتة في وضع مربع. تأكد من أن الحافة القطرية لكل طرف إبرة تشير إلى الداخل ، مما يعزز التثبيت ويمنع تلف عضلة القلب. باستخدام مشرط ، اقطع جميع الأنسجة الزائدة خارج مربعات الإبرة الأربعة.باستخدام الملقط ، ضع العينة المشذبة على قطعة معقمة من الأنسجة لمدة 10 ثوان لإزالة المخزن المؤقت الزائد للتقطيع. بعد ذلك ، قم بإزالة حقنة الأغاروز من الحمام المائي وغمر العينة في الأغاروز. دع الأغاروز يتصلب لمدة خمس دقائق على طبق تبريد.يجب أن يكون الجانب الشغافي من العينة مرئيا في الأغارو. باستخدام الملقط ، ضع الجانب الفوقي من العينة الموجودة في الأغاروز فوق المنطقة الملصقة ، ثم اضغط برفق على العينة المحتوية على الأغاروز من الأعلى باستخدام أداة حادة دون قطع أو إتلاف الأغاروز. دع الغراء يتصلب لمدة 1 دقيقة.اضبط سعة الاهتزاز على 1 ملليمتر، وسرعة القطع الأولية على 0.07 ملليمتر في الثانية، وسمك الشريحة على 300 ميكرون. بعد توصيل نظام الزراعة بجهاز كمبيوتر ، ابدأ تشغيل البرنامج المقابل. اضبط سرعة الروك على 60 دورة في الدقيقة واضبط معلمات التحفيز مسبقا.بالنسبة لشرائح القلب البشرية ، اضبط التحفيز القياسي على نبضات ثنائية الطور ذات 50 مللي أمبير أو تيار يتكون من تيار إيجابي 3 مللي ثانية ، وتوقف مؤقت لمدة 1 مللي ثانية ، ونبضة 3 مللي ثانية من التيار المقلوب بمعدل سرعة 30 نبضة في الدقيقة أو نبضة في الدقيقة ، ثم تحقق من مؤشرات القطب الكهربائي للبرنامج وتحقق من أن أقطاب غرف الزراعة تعمل بشكل صحيح. باستخدام ملاقط ، افصل الأغاروز عن الأنسجة. تجنب لمس الأنسجة والتعامل معها بعناية لأن أي ضرر يلحق بالأنسجة سيقلل من معدل نجاح الزراعة.لإرفاق مثلثين بلاستيكيين بعينة ، ضع 1 ميكرولتر من الغراء على غطاء طبق بتري معقم. استخدم ملاقط مدمن مخدرات لالتقاط مثلث بلاستيكي معقم واحد. اغمس الحافة الأمامية للمثلث بسرعة في الغراء والصق المثلث على العينة عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية.كرر ذلك للمثلث الآخر. باستخدام مشرط، قم بقص الأنسجة التي تتجاوز عرض المثلث وضع الشريحة مع المثلثين المثبتين مرة أخرى في درج القطع الذي يحتوي على مخزن مؤقت للتقطيع. قم بإزالة غرفة الزراعة متوسطة الملء من الحاضنة.حدد شريحة واحدة معدة وأدخلها في الحجرة عن طريق توصيل مثلث واحد بكل دبوس. اضبط المسافة بين دبابيس التركيب حسب حجم العينة. تأكد من غمر العينة في الوسط.بعد وضع الطبق على الروك ، قلل التحميل المسبق عن طريق تدوير برغي الضبط عكس اتجاه عقارب الساعة حتى لا يتغير خط الأساس للرسم البياني المقابل على شاشة الكمبيوتر بعد الآن ، ثم قم بزيادة التحميل المسبق أو التوتر بعناية عن طريق تدوير برغي الضبط في اتجاه عقارب الساعة. بالنسبة للغرف ذات الصلابة العالية ، استمر حتى زاد خط الأساس المقابل في الرسم البياني بمقدار 1000 إلى 1200 وحدة تتوافق مع حمولة مسبقة واحدة بالمللي نيوتن. بعد تحضير وسط الزراعة الطازج ، قم بتسخين الوسط مسبقا في حمام مائي أو حاضنة هواء ساخن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة.قم بإزالة الوسط من الغرفة ، مع ترك ما يقرب من 0.8 ملليلتر في الغرفة ، ثم أضف 1.6 ملليلتر من الوسط الطازج إلى نفس الغرفة ، مما يجعل الحجم الإجمالي متوسطا إلى 2.4 ملليلتر لكل غرفة. أخيرا ، ضع غطاء الغرفة مرة أخرى وضع غرفة الزراعة في موضعها الخاص. تألفت قراءة تقلص خمس شرائح عضلة القلب أثناء التحفيز النموذجي من أربعة أقسام متميزة من تقوية ما بعد التوقف ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحرارية.بالمقارنة مع السيطرة ، انخفضت قوة انكماش الشرائح المعالجة بمضادات الكالسيوم ، نيفيديبين وكالسيسيبتين ، في غضون 10 دقائق. في المقابل ، زاد ناهض قناة الكالسيوم ذو بوابات الجهد ، Bay-K8644 ، من قوة الانكماش. تم تقييم تقوية ما بعد التوقف المؤقت للشرائح الضابطة والمعالجة لإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا من الشبكة الساركوبلازمية.لم تظهر شريحة التحكم أية تغييرات. في وجود الكالسيزيبتين والنيفيديبين ، أدى تثبيط قنوات الكالسيوم من النوع L إلى تقوية الانقباض الأول بعد توقف لمدة 50 ثانية ، مما يعكس مساهمة نسبية أعلى لإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا في الانقباض الكلي. لوحظ التأثير المعاكس مع Bay-K8644 ، الذي يحفز دخول الكالسيوم خارج الخلية عبر قنوات الكالسيوم من النوع L.في تحليل العلاقة بين القوة والتردد ، لم يلاحظ أي تغيير في شريحة التحكم. لم يغير علاج الكالسيزيبتين من قدرة الشريحة على اتباع المحفزات عند زيادة وتيرة التحفيز عند مقارنة بيانات ما قبل المعالجة وبعدها. بالمقارنة مع الكالسيسيبتين ، منع النيفيديبين زيادة في الانقباض بمعدلات سرعة أعلى وخفض الحد الأقصى لمعدل الالتقاط عند 80 نبضة في الدقيقة.مع Bay-K8644 ، لوحظت زيادة في قوة الانكماش عند ترددات تحفيز منخفضة للغاية. ومع ذلك ، عند الترددات الأعلى من 50 نبضة في الدقيقة ، كانت قوة الانكماش أقل مما كانت عليه أثناء حالة ما قبل المعالجة. يجب نقل الأنسجة المستأصلة بسرعة إلى 4 درجات من شلل القلب.بعد التقطيع ، يجب إرفاق المثلثات البلاستيكية عموديا على اتجاه الألياف. يجب ألا يتجاوز التحميل المسبق 1500 مللي نيوتن. يمكن أن تساعد زراعة شرائح المحاكاة الحيوية الباحثين على استخدام التلاعب الجيني بالإضافة إلى العلاجات القائمة على الخلايا لدراسة التجديد والإصلاح في عضلة القلب البشرية البالغة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

القرنية تحضير الأنسجة من الجهات المانحة لغشائي keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

التغليف حرارة Preadipocytes للزراعة إلى الدهنية مستودعات الأنسجة

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

العمل مع الأنسجة البشرية لبالحركة أبحاث السرطان

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

طويلة الأجل قسطرة للالمعوية الليمفاوية الجذع وجمع الليمفاوية في الأطفال حديثي الولادة الخنازير

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

الموضع الجراحي القسطرة على المدى الطويل القلب والأوعية الدموية ممارسة اختبار في الخنازير

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

على المدى الطويل قياس ضغط الدم في الانتقال بحرية الفئران عن طريق القياس

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

3D الجامع القلب تحليل الأنسجة عضلة القلب

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

تحسين نموذج احتشاء عضلة القلب الخنزير الصدر مغلقة بتوحيد إجراءات أخذ عينات الدم والأنسجة

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

تحليل تسجيلات تخطيط كهربية القلب على المدى الطويل للكشف عن عدم انتظام ضربات القلب في الفئران

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

تقنية الحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية وتوصيف الكسر الوعائي اللحمية في الحفظ بالتبريد على المدى الطويل

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...