Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Onderzoek werd gefinancierd door DZHK-subsidies 81Z0600207 (JH, PS en DM) en 81X2600253 (AD en TS).
De auteurs willen Claudia Fahney, Mei-Ping Wu en Matthias Semisch bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van de opstellingen, evenals voor het regelmatige onderhoud van de weefselkweek.

Weefselverzameling voor de hier beschreven experimenten werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Universiteit van München en de Ruhr-Universiteit Bochum. Studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan weefselverzameling.
1. Weefselverwerving
<ol><li>Verkrijg menselijk weefsel van patiënten die een harttransplantatie of hartoperatie ondergaan.</...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

In het verleden heeft cardiovasculair onderzoek grote vooruitgang geboekt bij de teelt van cardiomyocyten. De 3D-teelt van cardiomyocyten met intacte geometrie is echter nog niet goed ingeburgerd. Vergeleken met eerdere protocollen die werden toegepast voor ex vivo kweek van myocardiaal weefsel, lijkt het protocol dat we hier beschreven meer op de in vivo omgeving van het weefsel. Bovendien zorgt de toepassing van pre- en afterload voor een meer biomimetische omgeving. We zijn in staat om de continue re...

In het afgelopen decennium heeft de in vitro kweek van myocardiale cellen grote vooruitgang geboekt, variërend van 2D- en driedimensionale (3D) technieken tot het gebruik van organoïden en geïnduceerde pluripotente stamcellen gedifferentieerd tot cardiale myocyten 1,2,3. Ex vivo en primaire celkweek is van grote waarde gebleken, vooral voor genetisch onderzoek en medicijnontwikkeling 4,5,6. Het gebruik van menselijke weefsels verbetert de translationele waarde van de resultaten. Langdurige 3D-teelt van myocardiale weefsels met intacte geometrie is echter niet goed ingeburgerd. De intacte geometrie is een belangrijk kenmerk om in vivo omstandigheden na te bootsen, omdat een goede hartfunctie, communicatie tussen verschillende cellen en cel-matrixinteracties vereisten zijn. Myocardiale weefselkweek ging door verschillende ontwikkelingsfasen. Het succespercentage en de stabiliteit van ex vivo myocardiale weefselkweek waren aanvankelijk vrij laag, maar recente benaderingen hebben veelbelovende resultaten opgeleverd 7,8,9,10,11.
Fischer et al. waren de eersten die aantoonden dat de levensvatbaarheid en contractiele prestaties van menselijk myocardiaal weefsel gedurende vele weken kunnen worden gehandhaafd in ex vivo celkweek7. Hun techniek was gebaseerd op dunne weefselschijfjes gesneden uit geëxplanteerd menselijk myocardium, die werden gemonteerd in nieuw ontwikkelde kweekkamers die gedefinieerde biomechanische omstandigheden en continue elektrische stimulatie boden. Deze kweekmethode lijkt sterk op de in vivo functie van myocardiaal weefsel en is gereproduceerd door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen 2,12,13,14,15. Belangrijk is dat de door Fischer et al. gebruikte kamers ook een continue registratie van ontwikkelde krachten gedurende maximaal 4 maanden mogelijk maakten en zo ongekende mogelijkheden openden voor fysiologisch en farmacologisch onderzoek naar intact humaan myocardium7.
Vergelijkbare technieken werden onafhankelijk ontwikkeld door andere groepen en toegepast op menselijk, ratten-, varkens- en konijnenmyocardium 7,10,11. Pitoulis et al. ontwikkelden vervolgens een meer fysiologische methode, die de normale kracht-lengterelatie tijdens een contractiecyclus reproduceert, maar minder geschikt is voor high-throughput analyse16. Als zodanig kan de algemene benadering van biomimetische teelt worden beschouwd als een verdere stap in de reductie, verfijning en vervanging (3R) van dierproeven.
Het benutten van dit potentieel vereist echter gestandaardiseerde procedures, analyses met een hoog gehalte en een hoog doorvoerniveau. We presenteren een techniek die geautomatiseerd snijden van levend menselijk myocardium combineert met in vitro onderhoud in een biomimetisch teeltsysteem dat commercieel beschikbaar is geworden (zie Materiaaltabel). Met de voorgestelde aanpak wordt het aantal afzonderlijke plakjes dat kan worden gegenereerd uit een enkel transmuraal myocardiaal specimen alleen beperkt door de verwerkingstijd. Een exemplaar van voldoende grootte en kwaliteit (3 cm x 3 cm) levert vaak 20-40 plakjes weefsel op die gemakkelijk worden gesneden met een geautomatiseerd vibratoom. Deze plakjes kunnen in teeltkamers van het systeem worden geplaatst. De kamers maken elektrische stimulatie mogelijk, waarvan de parameters kunnen worden gemoduleerd (d.w.z. pulsduur, polariteit, snelheid en stroom), evenals de aanpassing van voor- en nabelasting, met behulp van veerdraden in de kamers. De samentrekking van elke plak wordt geregistreerd door de beweging van een kleine magneet die aan een veerdraad is bevestigd en weergegeven als een interpreteerbare grafiek. Gegevens kunnen te allen tijde worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van vrij beschikbare software. Afgezien van de constante baseline pacing, kunnen geplande protocollen worden uitgevoerd om hun refractaire periode, stimulatiedrempel, post-pauze-potentiatie en kracht-frequentierelatie functioneel te beoordelen.
Deze biomimetische teelt op lange termijn van meerdere myocardiale plakjes uit een individueel hart maakt de weg vrij voor toekomstig ex vivo onderzoek in zowel menselijk als dierlijk weefsel en vergemakkelijkt de screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde. Het is al toegepast op verschillende experimentele benaderingen 2,12,13,15. Hier geven we een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de voorbereiding van menselijk weefsel en bieden we oplossingen voor vaak voorkomende teeltproblemen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Cardiomyocytenteelt heeft een groot aantal ontwikkelingen doorgemaakt, variërend van tweedimensionale (2D) celkweek tot van iPSC afgeleide organoïden. In 2019 werd een ex vivo manier aangetoond om myocardiale plakjes verkregen uit menselijke hartmonsters te cultiveren, terwijl de in vivo toestand van myocardiale contractie werd benaderd. Deze monsters zijn meestal afkomstig van harttransplantaties of plaatsingen van linkerventrikelhulpmiddelen. Met behulp van een vibratoom en een speciaal ontwikkeld teeltsysteem worden 300 μm dikke plakken tussen een vaste en een veerdraad geplaatst, waardoor een stabiele en reproduceerbare teelt gedurende enkele weken mogelijk is. Tijdens de teelt worden de plakjes continu gestimuleerd volgens individuele settings. Contracties kunnen in realtime worden weergegeven en geregistreerd en farmacologische middelen kunnen gemakkelijk worden toegepast. Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen kunnen worden gepland en uitgevoerd om vitale contractieparameters zoals post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode te beoordelen. Bovendien maakt het systeem een variabele voor- en nabelastingsinstelling mogelijk voor een meer fysiologische teelt.
Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding over het genereren van een succesvolle langetermijnkweek van menselijke linkerventrikel myocardiale plakjes, met behulp van een commerciële biomimetische teeltoplossing.

De samentrekking van de myocardiale plakjes werd weergegeven op het computerscherm na het inbrengen van de teeltkamer in de overeenkomstige connector (figuur 3). De samentrekking van de menselijke myocardiale plakjes begon onmiddellijk na stimulatie. De plakjes hypercontracteerden gedurende 5-10 min. Dit was zichtbaar als een toename van diastolische krachten, veroorzaakt door een tonische contractuur van beschadigde weefselfracties. Dit proces werd binnen 1-1,5 uur in verschillende mate ter...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

We presenteren een protocol voor ex vivo kweek van humaan ventriculaire myocardiale weefsel. Het maakt een gedetailleerde analyse van contractiekracht en kinetiek mogelijk, evenals de toepassing van pre- en afterload om de in vivo fysiologische omgeving beter na te bootsen.

Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Met behulp van dit protocol kunnen menselijke linkerventrikelweefselschijfjes ex vivo worden gekweekt in een biomimetische kamer. De toepassing van pre- en afterloads verbetert de gelijkenis van de fysiologische omgeving. Deze techniek maakt continue registratie van weefselcontractie mogelijk.Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen maken de beoordeling mogelijk van vitale contractieparameters zoals potentiatie na pauze, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode. De langdurige teelt van myocardiale plakjes, met behulp van deze opstelling, zal de weg vrijmaken voor toekomstig ex vivo onderzoek, waardoor deze screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde wordt vergemakkelijkt. Om te beginnen dompelt u de teeltkamers en grafietelektroden onder in één liter van een 10% isopropanoloplossing en roert u deze nacht.Breng de volgende dag de kamers gedurende 3 minuten over naar een 100% isopropanoloplossing en laat vervolgens de kamers en grafietelektroden aan de lucht drogen onder een laminaire stromingskap. Bevestig een printplaat aan elke kamer volgens de beschikbare posities op de rocker. Plaats twee grafietelektroden op de printplaat volgens de instructies van de fabrikant en plaats vervolgens een petrischaaldeksel van 35 millimeter op de kamer om infectie te voorkomen.Vul vervolgens de snijbak tot 90 tot 95% met snijbuffer. Breng het weefselmonster over in een petrischaaltje van 100 millimeter gevuld met koude snijbuffer en plaats de schaal op een koelplaat bij 4 graden Celsius. Verwijder endocardiale trabeculae door het endocardium met een pincet vast te houden en gebruik vervolgens een schaar om ongeveer 3 millimeter endocardiaal weefsel weg te snijden.Fixeer het gesneden weefselmonster, endocardiale kant tot een rubberen lapje van 2 bij 2 centimeter met behulp van vier naalden van 0,9 bij 70 millimeter 20 meter die in een vierkante positie zijn bevestigd. Zorg ervoor dat de diagonale rand van elke naaldpunt naar binnen wijst, waardoor de fixatie wordt verbeterd en schade aan het myocardium wordt voorkomen. Snijd met behulp van een scalpel al het overtollige weefsel buiten de vier naaldvierkanten weg.Plaats met een pincet het bijgesneden monster gedurende 10 seconden op een steriel stuk weefsel om overtollige snijbuffer te verwijderen. Verwijder vervolgens de agarosespuit uit het waterbad en dompel het monster onder in agarose. Laat de agarose vijf minuten stollen op een koelplaat.De endocardiale zijde van het monster moet zichtbaar zijn in de agarose. Plaats met een pincet de epicardiale kant van het monster in agarose op het gelijmde gebied en druk vervolgens het agarose-bevattende monster voorzichtig vanaf de bovenkant aan met een stomp gereedschap zonder de agarose te snijden of te beschadigen. Laat de lijm 1 minuut stollen.Stel de trillingsamplitude in op 1 millimeter, de initiële snijsnelheid op 0,07 millimeter per seconde en de dikte van de plak op 300 micron. Nadat u het teeltsysteem op een computer hebt aangesloten, start u het bijbehorende softwareprogramma. Stel de rockersnelheid in op 60 rpm en stel de stimulatieparameters in.Stel voor menselijke hartsegmenten de standaardstimulatie in op bifasische impulsen met 50 milliampère of stroom bestaande uit 3 milliseconden positieve stroom, 1 milliseconde pauze en een puls van 3 milliseconde omgekeerde stroom met een pacingsnelheid van 30 slagen per minuut of bpm, controleer vervolgens de elektrode-indicatoren van de software en controleer of de elektroden van de teeltkamers correct werken. Met behulp van een pincet scheidt u de agarose van het weefsel. Vermijd het aanraken van het weefsel en behandel het zorgvuldig, omdat eventuele schade aan het weefsel het succespercentage van de teelt zal verminderen.Om twee plastic driehoeken aan een monster te bevestigen, plaatst u 1 microliter lijm op een steriel petrischaaldeksel. Gebruik een gehaakt pincet om een geautoclaveerde plastic driehoek op te pakken. Dompel snel de voorrand van de driehoek in de lijm en plak de driehoek op het monster loodrecht op de cardiomyocytenuitlijning.Herhaal dit voor de andere driehoek. Snijd met behulp van een scalpel weefsel af dat de driehoeksbreedte overschrijdt en plaats de plak met de twee gemonteerde driehoeken terug in de snijbak met snijbuffer. Verwijder de medium gevulde teeltkamer uit de incubator.Selecteer één voorbereid segment en plaats dit in de kamer door één driehoek aan elke pin aan te sluiten. Pas de afstand tussen de bevestigingspennen aan de monstergrootte aan. Zorg ervoor dat het monster in het medium wordt ondergedompeld.Nadat u de schotel op de wip hebt geplaatst, verlaagt u de voorspanning door de stelschroef tegen de klok in te draaien totdat de basislijn van de overeenkomstige grafiek op het computerscherm niet meer verandert en verhoogt u vervolgens voorzichtig de voorspanning of spanning door de stelschroef met de klok mee te draaien. Voor kamers met een hoge stijfheid, ga door totdat de overeenkomstige basislijn in de grafiek is toegenomen met 1.000 tot 1.200 eenheden die overeenkomen met één millinewton voorspanning. Na het bereiden van het verse teeltmedium, verwarmt u het medium voor in een waterbad of heteluchtincubator op 37 graden Celsius gedurende 30 tot 45 minuten.Verwijder het medium uit de kamer en laat ongeveer 0,8 milliliter in de kamer achter en voeg vervolgens 1,6 milliliter vers medium toe aan dezelfde kamer, waardoor een totaal volume van gemiddeld tot 2,4 milliliter per kamer ontstaat. Plaats ten slotte de afdekking van de kamer terug en plaats de teeltkamer in zijn respectieve positie. De uitlezing van de contractie van vijf myocardiale plakjes tijdens een typische stimulatie bestond uit vier verschillende secties van post-pauze potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode.Vergeleken met controle was de contractiekracht van de plakjes behandeld met calciumantagonisten, nifedipine en calciseptine binnen 10 minuten afgenomen. Daarentegen verhoogde de spanningsafhankelijke calciumkanaalagonist, Bay-K8644, de contractiekracht. De potentiëring na de pauze van de controle en de behandelde plakjes werd beoordeeld op de intracellulaire calciumafgifte uit het sarcoplasmatisch reticulum.Het besturingssegment vertoonde geen wijzigingen. In aanwezigheid van calciseptine en nifedipine leidde de remming van de L-type calciumkanalen tot potentiëring van de eerste contractie na een pauze van 50 seconden, wat een hogere relatieve bijdrage van intracellulaire calciumafgifte aan de totale contractiliteit weerspiegelt. Het tegenovergestelde effect werd waargenomen met Bay-K8644, dat de binnenkomst van extracellulair calcium via de L-type calciumkanalen stimuleert.Bij kracht-frequentierelatieanalyse werd geen verandering waargenomen in het controlesegment. De behandeling met calciseptine veranderde niets aan het vermogen van de plak om de stimuli te volgen bij een toename van de stimulatiefrequentie bij het vergelijken van de gegevens voor en na de behandeling. In vergelijking met calciseptine voorkwam nifedipine een toename van de contractiliteit bij hogere pacingsnelheden en verlaagde de maximale opnamesnelheid bij 80 bpm.Met Bay-K8644 werd een verhoogde contractiekracht bij zeer lage stimulatiefrequenties waargenomen. Bij frequenties hoger dan 50 bpm was de contractiekracht echter lager dan tijdens de voorbehandeling. Weggesneden weefsel moet snel worden overgebracht naar 4 graden cardioplegie.Na het snijden moeten plastic driehoeken loodrecht op de vezelrichting worden bevestigd. De voorspanning mag niet meer dan 1500 millinewton bedragen. Biomimetische plakcultuur kan onderzoekers helpen om genetische manipulaties en celgebaseerde therapieën te gebruiken voor het bestuderen van regeneratie en reparatie in volwassen menselijk myocardium.

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Cornea donorweefsel Voorbereiding voor endothelial keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

Long-Term catheterisatie van de intestinale Lymfe Stam en verzamelen van lymfe in Neonatale Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

Chirurgische plaatsing van katheters naar Lange termijn Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. Indeed, research focusing on the discovery of new potential therapeutic targets using genetically altered mice requires a reliable, long-term assessment of the systemic arterial pressure variation. Currently, the gold standard for obtaining long-term measurements of blood pressure in ambulatory mice uses implantable radio-transmitters, which require&#160;artery cannulation. This technique eliminates the need for tethering, restraining, or anesthetizing the animals which introduce stress and artifacts during data sampling. However, arterial blood pressure monitoring in mice via catheterization can be rather challenging due to the small size of the arteries. Here we present a step-by-step guide to illustrate the crucial key passages for a successful subcutaneous implantation of radio-transmitters and carotid artery cannulation in mice. We also include examples of long-term blood pressure activity taken from freely moving mice after a period of post-surgery recovery. Following this procedure will allow reliable direct blood pressure recordings from multiple animals simultaneously.

The goal of this protocol is to assess systemic blood pressure in conscious freely moving mice using implantable radio-telemetry devices.

Langdurige Bloeddruk meten in vrij bewegende muizen met behulp van telemetrie

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-hart myocard Tissue Analyse

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analyse van langdurige elektrocardiografie-opnames om aritmieën bij muizen te detecteren

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).