Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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La recherche a été financée par les subventions DZHK 81Z0600207 (JH, PS et DM) et 81X2600253 (AD et TS).
Les auteurs tiennent à remercier Claudia Fahney, Mei-Ping Wu et Matthias Semisch pour leur soutien dans la préparation des installations, ainsi que pour le maintien régulier de la culture tissulaire.

La collecte de tissus pour les expériences décrites ici a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de Munich et de l’Université de la Ruhr à Bochum. Les études ont été menées conformément aux directives de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit avant le prélèvement de tissus.
1. Acquisition tissulaire
<ol><li>Obtenir des tissus humains de patients subissant une transplantati...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

Dans le passé, la recherche cardiovasculaire a fait de grands progrès dans la culture des cardiomyocytes. Cependant, la culture 3D de cardiomyocytes à géométrie intacte n’est pas encore bien établie. Comparé aux protocoles précédents appliqués pour la culture ex vivo de tissu myocardique, le protocole que nous avons décrit ici ressemble plus étroitement à l’environnement in vivo du tissu. De plus, l’application de la pré- et post-charge permet un environnement plus biomimétique. Nou...

Au cours de la dernière décennie, la culture in vitro de cellules myocardiques a fait de grands progrès, allant des techniques 2D et tridimensionnelles (3D) à l’utilisation d’organoïdes et de cellules souches pluripotentes induites différenciées en myocytes cardiaques 1,2,3. Les cultures cellulaires ex vivo et primaires se sont révélées d’une grande valeur, en particulier pour les études génétiques et le développement de médicaments 4,5,6. L’utilisation de tissus humains améliore la valeur translationnelle des résultats. La culture 3D à long terme de tissus myocardiques à géométrie intacte n’est cependant pas bien établie. La géométrie intacte est une caractéristique clé pour imiter les conditions in vivo, car une fonction cardiaque appropriée, la communication entre différentes cellules, ainsi que les interactions cellule-matrice sont des conditions préalables. La culture du tissu myocardique est passée par différentes phases de développement. Le taux de réussite et la stabilité de la culture ex vivo du tissu myocardique étaient initialement assez faibles, mais des approches récentes ont donné des résultats prometteurs 7,8,9,10,11.
Parmi ceux-ci, Fischer et al. ont été les premiers à démontrer que la viabilité et la performance contractile du tissu myocardique humain peuvent être maintenues dans la culture cellulaire ex vivo pendant de nombreuses semaines7. Leur technique était basée sur de fines tranches de tissus coupées dans du myocarde humain explanté, qui étaient montées dans des chambres de culture nouvellement développées qui fournissaient des conditions biomécaniques définies et une stimulation électrique continue. Cette méthode de culture ressemble beaucoup à la fonction in vivo du tissu myocardique et a été reproduite par plusieurs groupes de recherche indépendants 2,12,13,14,15. Il est important de noter que les chambres utilisées par Fischer et al. ont également permis l’enregistrement continu des forces développées jusqu’à 4 mois, et ont ainsi ouvert des opportunités sans précédent pour la recherche physiologique et pharmacologique sur le myocarde humain intact7.
Des techniques similaires ont été développées indépendamment par d’autres groupes et appliquées au myocarde humain, de rat, porcin et de lapin 7,10,11. Pitoulis et al. ont par la suite développé une méthode plus physiologique, qui reproduit la relation force-longueur normale au cours d’un cycle de contraction, mais qui est moins adaptée à l’analyse à haut débit16. En tant que telle, l’approche générale de la culture biomimétique peut être considérée comme une étape supplémentaire dans la réduction, le raffinement et le remplacement (3R) de l’expérimentation animale.
Cependant, l’exploitation de ce potentiel nécessite des procédures standardisées, des analyses à contenu élevé et un niveau de débit élevé. Nous présentons une technique qui combine le tranchage automatisé du myocarde humain vivant avec l’entretien in vitro dans un système de culture biomimétique qui est devenu disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux). Avec l’approche proposée, le nombre de tranches individuelles pouvant être générées à partir d’un seul échantillon myocardique transmural n’est limité que par le temps de traitement. Un spécimen de taille et de qualité suffisantes (3 cm x 3 cm) donne souvent 20 à 40 tranches de tissu coupées de manière pratique avec un vibratome automatisé. Ces tranches peuvent être placées dans des chambres de culture appartenant au système. Les chambres permettent une stimulation électrique, dont les paramètres peuvent être modulés (c’est-à-dire la durée de l’impulsion, la polarité, la vitesse et le courant), ainsi que le réglage de la précharge et de la post-charge, à l’aide de fils à ressort à l’intérieur des chambres. La contraction de chaque tranche est enregistrée à partir du mouvement d’un petit aimant attaché à un fil à ressort et affichée sous forme de graphique interprétable. Les données peuvent être enregistrées à tout moment et analysées à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement. Outre le rythme de base constant, des protocoles planifiés peuvent être effectués pour évaluer fonctionnellement leur période réfractaire, leur seuil de stimulation, leur post-pause-potentialisation et leur relation force-fréquence.
Cette culture biomimétique à long terme de plusieurs tranches myocardiques à partir d’un cœur individuel ouvre la voie à de futures recherches ex vivo dans les tissus humains et animaux et facilite le dépistage des effets thérapeutiques et cardiotoxiques des médicaments en médecine cardiovasculaire. Il a déjà été appliqué à diverses approches expérimentales 2,12,13,15. Ici, nous donnons une description détaillée étape par étape de la préparation des tissus humains et fournissons des solutions aux problèmes de culture fréquemment rencontrés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

La culture de cardiomyocytes a connu un grand nombre de développements, allant de la culture de cellules bidimensionnelles (2D) aux organoïdes dérivés de l’iPSC. En 2019, une façon ex vivo de cultiver des tranches de myocarde obtenues à partir d’échantillons de cœur humain a été démontrée, tout en approchant in vivo de l’état de contraction myocardique. Ces échantillons proviennent principalement de transplantations cardiaques ou de placements de dispositifs d’assistance ventriculaire gauche. À l’aide d’un vibratome et d’un système de culture spécialement développé, des tranches de 300 μm d’épaisseur sont placées entre un fil fixe et un fil à ressort, permettant une culture stable et reproductible pendant plusieurs semaines. Pendant la culture, les tranches sont continuellement stimulées selon des paramètres individuels. Les contractions peuvent être affichées et enregistrées en temps réel, et les agents pharmacologiques peuvent être facilement appliqués. Des protocoles de stimulation définis par l’utilisateur peuvent être programmés et exécutés pour évaluer les paramètres de contraction vitaux tels que la potentialisation post-pause, le seuil de stimulation, la relation force-fréquence et la période réfractaire. De plus, le système permet un réglage variable de la précharge et de la post-charge pour une culture plus physiologique.
Ici, nous présentons un guide étape par étape sur la façon de générer une culture réussie à long terme de tranches myocardiques ventriculaires gauches humaines, en utilisant une solution de culture biomimétique commerciale.

La contraction des tranches myocardiques a été affichée sur l’écran de l’ordinateur après insertion de la chambre de culture dans son connecteur correspondant (Figure 3). La contraction des tranches myocardiques humaines a commencé immédiatement après la stimulation. Les tranches sont hypercontractées pendant 5-10 min. Cela était visible comme une augmentation des forces diastoliques, causée par une contracture tonique de fractions tissulaires endommagées. Ce processus a ét?...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Nous présentons un protocole pour la culture ex vivo de tissu myocardique ventriculaire humain. Il permet une analyse détaillée de la force de contraction et de la cinétique, ainsi que l’application de la pré- et post-charge pour imiter de plus près l’environnement physiologique in vivo .

Préparation de tissu myocardique humain pour la culture à long terme

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

En utilisant ce protocole, les tranches de tissu ventriculaire gauche humain peuvent être cultivées ex vivo dans une chambre biomimétique. L’application de pré et post-charges améliore la ressemblance de l’environnement physiologique. Cette technique permet l’enregistrement continu de la contraction tissulaire.Les protocoles de stimulation définis par l’utilisateur permettent d’évaluer les paramètres de contraction vitaux tels que la potentialisation post-pause, le seuil de stimulation, la relation force-fréquence et la période réfractaire. La culture à long terme de tranches myocardiques, en utilisant cette configuration, ouvrira la voie à de futures recherches ex vivo, facilitant ce dépistage des effets thérapeutiques et cardiotoxiques des médicaments en médecine cardiovasculaire. Pour commencer, immergez les chambres de culture et les électrodes de graphite dans un litre d’une solution d’isopropanol à 10% et agitez pendant la nuit.Le lendemain, transférer les chambres dans une solution à 100% d’isopropanol pendant 3 minutes, puis laisser sécher à l’air les chambres et les électrodes en graphite sous une hotte à écoulement laminaire. Fixez un circuit imprimé à chaque chambre en fonction des positions disponibles sur la bascule. Placez deux électrodes en graphite sur la carte de circuit imprimé conformément aux instructions du fabricant, puis placez un couvercle de boîte de Petri de 35 millimètres sur la chambre pour éviter toute infection.Ensuite, remplissez le plateau de coupe jusqu’à 90 à 95% avec un tampon de tranchage. Transférer l’échantillon de tissu dans une boîte de Petri de 100 millimètres remplie de tampon de tranchage à froid et placer la boîte sur une plaque de refroidissement à 4 degrés Celsius. Enlevez les trabécules endocardiques en tenant l’endocarde avec une pince à épiler, puis utilisez des ciseaux pour couper environ 3 millimètres de tissu endocardique.Fixez l’échantillon de tissu coupé, côté endocardique jusqu’à un patch en caoutchouc de 2 centimètres sur 2 à l’aide de quatre aiguilles de calibre 20 de 0,9 x 70 millimètres fixées en position carrée. Assurez-vous que le bord diagonal de chaque pointe d’aiguille pointe vers l’intérieur, ce qui améliore la fixation et prévient les dommages au myocarde. À l’aide d’un scalpel, coupez tout l’excès de tissu à l’extérieur des quatre carrés d’aiguilles.À l’aide d’une pince à épiler, placez l’échantillon coupé sur un morceau de tissu stérile pendant 10 secondes pour éliminer l’excès de tampon de tranchage. Ensuite, retirez la seringue d’agarose du bain-marie et immergez l’échantillon dans de l’agarose. Laissez l’agarose se solidifier pendant cinq minutes sur une plaque de refroidissement.La face endocardique de l’échantillon doit être visible dans l’agarose. À l’aide d’une pince à épiler, placez le côté épicardique de l’échantillon contenu dans l’agarose sur la zone collée, puis appuyez doucement sur l’échantillon contenant de l’agarose par le haut avec un outil émoussé sans couper ou endommager l’agarose. Laissez la colle se solidifier pendant 1 minute.Réglez l’amplitude de vibration sur 1 millimètre, la vitesse de coupe initiale sur 0,07 millimètre par seconde et l’épaisseur de la tranche sur 300 microns. Après avoir connecté le système de culture à un ordinateur, démarrez le logiciel correspondant. Réglez la vitesse de la bascule à 60 tr/min et préréglez les paramètres de stimulation.Pour les tranches cardiaques humaines, réglez la stimulation standard sur des impulsions biphasiques avec 50 milliampères ou un courant composé de 3 millisecondes de courant positif, de 1 milliseconde de pause et d’une impulsion de 3 millisecondes de courant inversé à une vitesse de stimulation de 30 battements par minute ou bpm, puis vérifiez les indicateurs d’électrode du logiciel et vérifiez que les électrodes des chambres de culture fonctionnent correctement. À l’aide d’une pince à épiler, séparez l’agarose du tissu. Évitez de toucher le tissu et manipulez-le avec précaution car tout dommage au tissu réduira le taux de réussite de la culture.Pour fixer deux triangles en plastique à un échantillon, placez 1 microlitre de colle sur un couvercle stérile de boîte de Pétri. Utilisez une pince à épiler pour ramasser un triangle en plastique autoclavé. Trempez rapidement le bord avant du triangle dans la colle et collez le triangle sur l’échantillon perpendiculairement à l’alignement des cardiomyocytes.Répétez l’opération pour l’autre triangle. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu dépassant la largeur du triangle et replacez la tranche avec les deux triangles montés dans le plateau de coupe contenant le tampon de tranchage. Retirez la chambre de culture moyennement remplie de l’incubateur.Sélectionnez une tranche préparée et insérez-la dans la chambre en connectant un triangle à chaque broche. Ajustez la distance entre les broches de montage à la taille de l’échantillon. Assurez-vous que l’échantillon est immergé dans le milieu.Après avoir placé la parabole sur la bascule, diminuez la précharge en tournant la vis de réglage dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la ligne de base du graphique correspondant sur l’écran de l’ordinateur ne change plus, puis augmentez soigneusement la précharge ou la tension en tournant la vis de réglage dans le sens des aiguilles d’une montre. Pour les chambres à rigidité élevée, continuer jusqu’à ce que la ligne de base correspondante dans le graphique ait augmenté de 1 000 à 1 200 unités correspondant à une précharge d’un millinewton. Après avoir préparé le milieu de culture frais, préchauffez le milieu dans un bain-marie ou un incubateur à air chaud à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes.Retirez le milieu de la chambre, en laissant environ 0,8 millilitre dans la chambre, puis ajoutez 1,6 millilitre de milieu frais à la même chambre, ce qui donne un volume total de milieu à 2,4 millilitres par chambre. Enfin, replacez le couvercle de la chambre et placez la chambre de culture dans sa position respective. La lecture de la contraction de cinq tranches du myocarde au cours d’une stimulation typique consistait en quatre sections distinctes de potentialisation post-pause, de seuil de stimulation, de relation force-fréquence et de période réfractaire.Par rapport au contrôle, la force de contraction des tranches traitées avec des antagonistes du calcium, la nifédipine et la calciseptine, a diminué en 10 minutes. En revanche, l’agoniste des canaux calciques voltage-dépendants, Bay-K8644, a augmenté la force de contraction. La potentialisation post-pause des tranches témoins et traitées a été évaluée pour la libération intracellulaire de calcium du réticulum sarcoplasmique.La tranche de contrôle n’a montré aucune modification. En présence de calciseptine et de nifédipine, l’inhibition des canaux calciques de type L a conduit à la potentialisation de la première contraction après une pause de 50 secondes, reflétant une contribution relative plus élevée de la libération intracellulaire de calcium à la contractilité totale. L’effet inverse a été observé avec Bay-K8644, qui stimule l’entrée du calcium extracellulaire via les canaux calciques de type L.Dans l’analyse des relations force-fréquence, aucun changement n’a été observé dans la tranche témoin. Le traitement à la calciseptine n’a pas modifié la capacité de la tranche à suivre les stimuli lors d’une augmentation de la fréquence de stimulation lors de la comparaison des données avant et après le traitement. Par rapport à la calciseptine, la nifédipine a empêché une augmentation de la contractilité à des taux de stimulation plus élevés et a réduit le taux de capture maximal à 80 bpm.Avec Bay-K8644, une augmentation de la force de contraction à des fréquences de stimulation très basses a été observée. Cependant, à des fréquences supérieures à 50 bpm, la force de contraction était inférieure à celle de la condition de prétraitement. Les tissus excisés doivent être rapidement transférés à une cardioplégie de 4 degrés.Après le tranchage, les triangles en plastique doivent être fixés perpendiculairement à la direction de la fibre. La précharge ne doit pas dépasser 1500 millinewton. La culture de tranches biomimétiques peut aider les chercheurs à utiliser des manipulations génétiques ainsi que des thérapies cellulaires pour étudier la régénération et la réparation du myocarde humain adulte.

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