Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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Die Forschung wurde durch die DZHK-Zuschüsse 81Z0600207 (JH, PS und DM) und 81X2600253 (AD und TS) gefördert.
Die Autoren danken Claudia Fahney, Mei-Ping Wu und Matthias Semisch für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Aufbauten sowie für die regelmäßige Aufrechterhaltung der Gewebekultivierung.

Die Gewebeentnahme für die hier beschriebenen Experimente wurde von den Institutional Review Boards der Universität München und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Patienten gaben vor der Gewebeentnahme ihre schriftliche Einwilligung.
1. Gewebeentnahme
<ol><li>Erhalten Sie menschliches Gewebe von Patienten, die sich einer Herztransplantation oder Herzoperation unterziehen.</li>
...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

In der Vergangenheit hat die kardiovaskuläre Forschung große Fortschritte bei der Kultivierung von Kardiomyozyten gemacht. Die 3D-Kultivierung von Kardiomyozyten mit intakter Geometrie ist jedoch noch nicht gut etabliert. Im Vergleich zu früheren Protokollen, die für die Ex-vivo-Kultivierung von Myokardgewebe angewendet wurden, ähnelt das hier beschriebene Protokoll der In-vivo-Umgebung des Gewebes genauer. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von Pre- und Afterload eine biomimetischere Umgebu...

In den letzten zehn Jahren hat die In-vitro-Kultivierung von Myokardzellen große Fortschritte gemacht, die von 2D- und dreidimensionalen (3D) Techniken bis hin zur Verwendung von Organoiden und induzierten pluripotenten Stammzellen reichen, die in kardiale Myozytendifferenziert sind 1,2,3. Ex-vivo- und primäre Zellkultivierungen haben sich als sehr wertvoll erwiesen, insbesondere für genetische Studien und die Arzneimittelentwicklung 4,5,6. Die Verwendung von menschlichem Gewebe verbessert den translationalen Wert der Ergebnisse. Die langfristige 3D-Kultivierung von Myokardgewebe mit intakter Geometrie ist jedoch nicht gut etabliert. Die intakte Geometrie ist ein Schlüsselmerkmal für die Nachahmung von In-vivo-Bedingungen, da die richtige Herzfunktion, die Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen sowie Zell-Matrix-Interaktionen Voraussetzungen sind. Die Kultivierung des Myokardgewebes durchlief verschiedene Entwicklungsphasen. Die Erfolgsrate und Stabilität der Ex-vivo-Myokardgewebekultivierung waren anfangs recht gering, aber jüngste Ansätze haben vielversprechende Ergebnisse erbracht 7,8,9,10,11.
Unter diesen waren Fischer et al. die ersten, die zeigten, dass die Lebensfähigkeit und kontraktile Leistungsfähigkeit des menschlichen Myokardgewebes in der Ex-vivo-Zellproduktion für viele Wochen aufrechterhalten werden kann7. Ihre Technik basierte auf dünnen Gewebeschnitten, die aus explantiertem menschlichem Myokard geschnitten wurden, die in neu entwickelten Kultivierungskammern montiert wurden, die definierte biomechanische Bedingungen und kontinuierliche elektrische Stimulation lieferten. Diese Kultivierungsmethode ähnelt stark der In-vivo-Funktion von Myokardgewebe und wurde von mehreren unabhängigen Forschungsgruppen 2,12,13,14,15 reproduziert. Wichtig ist, dass die von Fischer et al. verwendeten Kammern auch eine kontinuierliche Registrierung der entwickelten Kräfte für bis zu 4 Monate ermöglichten und somit beispiellose Möglichkeiten für die physiologische und pharmakologische Forschung an intaktem menschlichem Myokarderöffneten 7.
Ähnliche Techniken wurden unabhängig voneinander von anderen Gruppen entwickelt und auf Human-, Ratten-, Schweine- und Kaninchenmyokardangewendet 7,10,11. Pitoulis et al. entwickelten anschließend eine physiologischere Methode, die die normale Kraft-Längen-Beziehung während eines Kontraktionszyklus reproduziert, aber für die Hochdurchsatzanalyse weniger geeignet ist16. Daher kann der allgemeine Ansatz des biomimetischen Anbaus als ein weiterer Schritt zur Reduktion, Verfeinerung und Ersetzung (3R) von Tierversuchen angesehen werden.
Die Ausschöpfung dieses Potenzials erfordert jedoch standardisierte Verfahren, High-Content-Analysen und einen hohen Durchsatz. Wir stellen eine Technik vor, die das automatisierte Schneiden von lebendem menschlichem Myokard mit der In-vitro-Wartung in einem biomimetischen Kultivierungssystem kombiniert, das kommerziell verfügbar geworden ist (siehe Materialtabelle). Mit dem vorgeschlagenen Ansatz ist die Anzahl der einzelnen Scheiben, die aus einer einzigen transmuralen Myokardprobe erzeugt werden können, nur durch die Verarbeitungszeit begrenzt. Eine Probe von ausreichender Größe und Qualität (3 cm x 3 cm) liefert oft 20-40 Gewebescheiben, die bequem mit einem automatisierten Vibratom geschnitten werden. Diese Scheiben können in zum System gehörende Kultivierungskammern gelegt werden. Die Kammern ermöglichen eine elektrische Stimulation, deren Parameter moduliert werden können (z. B. Pulsdauer, Polarität, Rate und Strom), sowie die Einstellung von Vor- und Nachlast unter Verwendung von Federdrähten in den Kammern. Die Kontraktion jeder Scheibe wird durch die Bewegung eines kleinen Magneten, der an einem Federdraht befestigt ist, registriert und als interpretierbarer Graph angezeigt. Daten können jederzeit erfasst und mit frei verfügbarer Software analysiert werden. Abgesehen vom konstanten Baseline-Pacing können geplante Protokolle durchgeführt werden, um ihre Feuerfestperiode, die Stimulationsschwelle, die Post-Pause-Potenzierung und die Kraft-Frequenz-Beziehung funktionell zu bewerten.
Diese langfristige biomimetische Kultivierung mehrerer Myokardscheiben aus einem individuellen Herzen ebnet den Weg für zukünftige Ex-vivo-Forschung in menschlichem und tierischem Gewebe und erleichtert das Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin. Es wurde bereits auf verschiedene experimentelle Ansätze 2,12,13,15 angewendet. Hier geben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Aufbereitung von menschlichem Gewebe und liefern Lösungen für häufig auftretende Kultivierungsprobleme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Die Kultivierung von Kardiomyozyten hat eine Vielzahl von Entwicklungen erlebt, die von der zweidimensionalen (2D) Zellkultivierung bis hin zu iPSC-abgeleiteten Organoiden reichen. Im Jahr 2019 wurde eine Ex-vivo-Methode zur Kultivierung von Myokardscheiben aus menschlichen Herzproben demonstriert, während man sich dem In-vivo-Zustand der Myokardkontraktion näherte. Diese Proben stammen hauptsächlich aus Herztransplantationen oder der Platzierung von linksventrikulären Unterstützungsgeräten. Mit einem Vibratom und einem speziell entwickelten Kultivierungssystem werden 300 μm dicke Scheiben zwischen einen festen und einen Federdraht gelegt, was eine stabile und reproduzierbare Kultivierung über mehrere Wochen ermöglicht. Während des Anbaus werden die Scheiben entsprechend den individuellen Einstellungen kontinuierlich stimuliert. Kontraktionen können in Echtzeit angezeigt und aufgezeichnet werden, und pharmakologische Mittel können leicht angewendet werden. Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle können geplant und durchgeführt werden, um wichtige Kontraktionsparameter wie Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht das System eine variable Vor- und Nachlasteinstellung für eine physiologischere Kultivierung.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie eine erfolgreiche Langzeitkultivierung von humanen linksventrikulären Myokardschnitten unter Verwendung einer kommerziellen biomimetischen Kultivierungslösung erzeugt werden kann.

Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde nach dem Einsetzen der Kultivierungskammer in den entsprechenden Anschluss auf dem Computerbildschirm angezeigt (Abbildung 3). Die Kontraktion der menschlichen Myokardscheiben begann sofort nach der Stimulation. Die Scheiben wurden für 5-10 min hyperkontrahiert. Dies war sichtbar als eine Zunahme der diastolischen Kräfte, verursacht durch eine tonische Kontraktur von beschädigten Gewebefraktionen. Dieser Prozess wurde innerhalb von 1-1,5 h in unte...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Wir präsentieren ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultivierung von menschlichem ventrikulärem Myokardgewebe. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kontraktionskraft und Kinetik sowie die Anwendung von Vor- und Nachlast, um die in vivo physiologische Umgebung genauer nachzuahmen.

Aufbereitung von menschlichem Myokardgewebe für die Langzeitkultivierung

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Mit diesem Protokoll können humane linksventrikuläre Gewebeschnitte ex vivo in einer biomimetischen Kammer kultiviert werden. Die Anwendung von Pre- und Afterloads verbessert die Ähnlichkeit der physiologischen Umgebung. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche Registrierung der Gewebekontraktion.Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle ermöglichen die Beurteilung von Vitalkontraktionsparametern wie Potenzierung nach der Pause, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode. Die langfristige Kultivierung von Myokardscheiben unter Verwendung dieses Aufbaus wird den Weg für die zukünftige Ex-vivo-Forschung ebnen und dieses Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin erleichtern. Um zu beginnen, tauchen Sie die Kultivierungskammern und Graphitelektroden in einen Liter einer 10% Isopropanollösung und rühren Sie über Nacht.Am nächsten Tag die Kammern für 3 Minuten in eine 100% Isopropanol-Lösung überführen und dann die Kammern und Graphitelektroden unter einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen lassen. Befestigen Sie eine Leiterplatte an jeder Kammer entsprechend den verfügbaren Positionen auf der Wippe. Legen Sie zwei Graphitelektroden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Leiterplatte und legen Sie dann einen 35-Millimeter-Petrischalendeckel auf die Kammer, um eine Infektion zu verhindern.Als nächstes füllen Sie das Schneidefach bis zu 90 bis 95% mit Schneidepuffer. Die Gewebeprobe in eine 100-Millimeter-Petrischale geben, die mit Kaltschneidepuffer gefüllt ist, und die Schale bei 4 Grad Celsius auf eine Kühlplatte legen. Entfernen Sie endokardiale Trabekula, indem Sie das Endokard mit einer Pinzette halten, und schneiden Sie dann mit einer Schere etwa 3 Millimeter Endokardgewebe ab.Fixieren Sie die geschnittene Gewebeprobe, endokardial seitlich bis zu einem 2 x 2 Zentimeter großen Gummipflaster mit vier 0,9 x 70 Millimeter großen 20-Gauge-Nadeln, die in einer quadratischen Position fixiert sind. Stellen Sie sicher, dass der diagonale Rand jeder Nadelspitze nach innen zeigt, die Fixierung verbessert und Schäden am Myokard verhindert. Schneiden Sie mit einem Skalpell das gesamte überschüssige Gewebe außerhalb der vier Nadelquadrate weg.Legen Sie die getrimmte Probe mit einer Pinzette für 10 Sekunden auf ein steriles Stück Gewebe, um überschüssigen Schneidepuffer zu entfernen. Als nächstes entfernen Sie die Agarosespritze aus dem Wasserbad und tauchen Sie die Probe in Agarose. Lassen Sie die Agarose fünf Minuten lang auf einer Kühlplatte erstarren.Die endokardiale Seite der Probe muss in der Agarose sichtbar sein. Legen Sie mit einer Pinzette die epikardiale Seite der in Agarose enthaltenen Probe auf die verklebte Fläche und drücken Sie dann die agarosehaltige Probe vorsichtig mit einem stumpfen Werkzeug von oben, ohne die Agarose zu schneiden oder zu beschädigen. Lassen Sie den Kleber für 1 Minute erstarren.Stellen Sie die Schwingungsamplitude auf 1 Millimeter, die anfängliche Schnittgeschwindigkeit auf 0,07 Millimeter pro Sekunde und die Dicke der Scheibe auf 300 μm ein. Nachdem Sie das Anbausystem an einen Computer angeschlossen haben, starten Sie das entsprechende Softwareprogramm. Stellen Sie die Wippgeschwindigkeit auf 60 U / min ein und stellen Sie die Stimulationsparameter vor.Stellen Sie für menschliche Herzschnitte die Standardstimulation auf biphasische Impulse mit 50 Milliampere oder Strom ein, die aus 3 Millisekunden positivem Strom, 1 Millisekunde Pause und einem 3-Millisekunden-Impuls mit invertiertem Strom bei einer Schrittfrequenz von 30 Schlägen pro Minute oder bpm bestehen, überprüfen Sie dann die Elektrodenanzeigen der Software und überprüfen Sie, ob die Elektroden der Kultivierungskammern korrekt funktionieren. Trennen Sie mit einer Pinzette die Agarose vom Gewebe. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu berühren und behandeln Sie es vorsichtig, da jede Schädigung des Gewebes die Erfolgsrate der Kultivierung verringert.Um zwei Kunststoffdreiecke an einer Probe zu befestigen, geben Sie 1 Mikroliter Kleber auf einen sterilen Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine hakenförmige Pinzette, um ein autoklaviertes Kunststoffdreieck aufzunehmen. Tauchen Sie schnell die Vorderkante des Dreiecks in den Kleber und kleben Sie das Dreieck senkrecht zur Kardiomyozytenausrichtung auf die Probe.Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Dreieck. Schneiden Sie mit einem Skalpell das Gewebe ab, das die Dreiecksbreite überschreitet, und legen Sie die Scheibe mit den beiden montierten Dreiecken zurück in die Schneideschale mit dem Schneidepuffer. Entfernen Sie die mediengefüllte Kultivierungskammer aus dem Inkubator.Wählen Sie eine vorbereitete Scheibe aus und führen Sie sie in die Kammer ein, indem Sie ein Dreieck mit jedem Stift verbinden. Passen Sie den Abstand zwischen den Montagestiften an die Stichprobengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Probe in das Medium eingetaucht ist.Nachdem Sie die Schüssel auf die Wippe gelegt haben, verringern Sie die Vorspannung, indem Sie die Einstellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Grundlinie des entsprechenden Diagramms auf dem Computerbildschirm nicht mehr ändert, und erhöhen Sie dann vorsichtig die Vorspannung oder Spannung, indem Sie die Einstellschraube im Uhrzeigersinn drehen. Fahren Sie bei Kammern mit hoher Steifigkeit fort, bis die entsprechende Baseline im Diagramm um 1.000 bis 1.200 Einheiten gestiegen ist, was einer Millinewton-Vorspannung entspricht. Nach der Zubereitung des frischen Kulturmediums das Medium in einem Wasserbad oder Heißluftinkubator bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten vorwärmen.Entfernen Sie das Medium aus der Kammer, wobei Sie etwa 0,8 Milliliter in der Kammer verbleiben, und fügen Sie dann 1,6 Milliliter frisches Medium in dieselbe Kammer hinzu, wodurch ein Gesamtvolumen von Medium bis 2,4 Milliliter pro Kammer entsteht. Legen Sie schließlich die Abdeckung der Kammer zurück und stellen Sie die Kultivierungskammer in ihre jeweilige Position. Das Auslesen der Kontraktion von fünf Myokardschnitten während einer typischen Stimulation bestand aus vier verschiedenen Abschnitten der Potenzierung nach der Pause, der Stimulationsschwelle, der Kraft-Frequenz-Beziehung und der Refraktärperiode.Im Vergleich zur Kontrolle war die Kontraktionskraft der mit Calciumantagonisten, Nifedipin und Calciseptin behandelten Scheiben, innerhalb von 10 Minuten verringert. Im Gegensatz dazu erhöhte der spannungsgesteuerte Kalziumkanal-Agonist Bay-K8644 die Kontraktionskraft. Die post-pausierende Potenzierung der Kontroll- und behandelten Schnitte wurde für die intrazelluläre Calciumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum untersucht.Das Steuerelement-Slice zeigte keine Änderungen an. In Gegenwart von Calciseptin und Nifedipin führte die Hemmung der L-Typ-Calciumkanäle nach einer Pause von 50 Sekunden zu einer Potenzierung der ersten Kontraktion, was einen höheren relativen Beitrag der intrazellulären Calciumfreisetzung zur totalen Kontraktilität widerspiegelt. Der gegenteilige Effekt wurde bei Bay-K8644 beobachtet, das den Eintritt von extrazellulärem Kalzium über die L-Typ-Calciumkanäle stimuliert.Bei der Kraft-Frequenz-Beziehungsanalyse wurde keine Änderung in der Kontrollschicht beobachtet. Die Calciseptin-Behandlung änderte nichts an der Fähigkeit des Slices, den Reizen bei einer Erhöhung der Stimulationsfrequenz zu folgen, wenn die Daten vor und nach der Behandlung verglichen wurden. Im Vergleich zu Calciseptin verhinderte Nifedipin eine Erhöhung der Kontraktilität bei höheren Schrittmacherraten und reduzierte die maximale Abscheidungsrate bei 80 bpm.Bei Bay-K8644 wurde eine erhöhte Kontraktionskraft bei sehr niedrigen Stimulationsfrequenzen beobachtet. Bei Frequenzen von mehr als 50 bpm war die Kontraktionskraft jedoch geringer als während des Vorbehandlungszustands. Ausgeschnittenes Gewebe sollte schnell auf 4 Grad Kardioplegie übertragen werden.Nach dem Schneiden müssen Kunststoffdreiecke senkrecht zur Faserrichtung angebracht werden. Die Vorspannung sollte 1500 Millinewton nicht überschreiten. Die biomimetische Schnittkultur kann Forschern helfen, genetische Manipulationen sowie zellbasierte Therapien zur Untersuchung der Regeneration und Reparatur bei erwachsenen menschlichen Myokarden einzusetzen.

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Corneal Spendergewebe Vorbereitung für Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Forschung

Medizin

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

Long-Term Katheterisierung der Darmlymphe Trunk und Sammlung von Lymphe in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

Chirurgische Platzierung von Kathetern für die langfristige Herz-Kreislauf und Sportmedizin in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. Indeed, research focusing on the discovery of new potential therapeutic targets using genetically altered mice requires a reliable, long-term assessment of the systemic arterial pressure variation. Currently, the gold standard for obtaining long-term measurements of blood pressure in ambulatory mice uses implantable radio-transmitters, which require&#160;artery cannulation. This technique eliminates the need for tethering, restraining, or anesthetizing the animals which introduce stress and artifacts during data sampling. However, arterial blood pressure monitoring in mice via catheterization can be rather challenging due to the small size of the arteries. Here we present a step-by-step guide to illustrate the crucial key passages for a successful subcutaneous implantation of radio-transmitters and carotid artery cannulation in mice. We also include examples of long-term blood pressure activity taken from freely moving mice after a period of post-surgery recovery. Following this procedure will allow reliable direct blood pressure recordings from multiple animals simultaneously.

The goal of this protocol is to assess systemic blood pressure in conscious freely moving mice using implantable radio-telemetry devices.

Langzeit-Blutdruckmessung in sich frei bewegenden Mäuse Telemetrie

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

Verbesserung der einen geschlossenen Kasten porcinen Myokardinfarkt Modell durch Standardisierung der Gewebe und Blut Stichprobenverfahren

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analyse von Langzeit-Elektrokardiographie-Aufnahmen zum Nachweis von Arrhythmien bei Mäusen

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).