Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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Die Forschung wurde durch die DZHK-Zuschüsse 81Z0600207 (JH, PS und DM) und 81X2600253 (AD und TS) gefördert.
Die Autoren danken Claudia Fahney, Mei-Ping Wu und Matthias Semisch für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Aufbauten sowie für die regelmäßige Aufrechterhaltung der Gewebekultivierung.

Die Gewebeentnahme für die hier beschriebenen Experimente wurde von den Institutional Review Boards der Universität München und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die Patienten gaben vor der Gewebeentnahme ihre schriftliche Einwilligung.
1. Gewebeentnahme
<ol><li>Erhalten Sie menschliches Gewebe von Patienten, die sich einer Herztransplantation oder Herzoperation unterziehen.</li>
...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

In der Vergangenheit hat die kardiovaskuläre Forschung große Fortschritte bei der Kultivierung von Kardiomyozyten gemacht. Die 3D-Kultivierung von Kardiomyozyten mit intakter Geometrie ist jedoch noch nicht gut etabliert. Im Vergleich zu früheren Protokollen, die für die Ex-vivo-Kultivierung von Myokardgewebe angewendet wurden, ähnelt das hier beschriebene Protokoll der In-vivo-Umgebung des Gewebes genauer. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von Pre- und Afterload eine biomimetischere Umgebu...

In den letzten zehn Jahren hat die In-vitro-Kultivierung von Myokardzellen große Fortschritte gemacht, die von 2D- und dreidimensionalen (3D) Techniken bis hin zur Verwendung von Organoiden und induzierten pluripotenten Stammzellen reichen, die in kardiale Myozytendifferenziert sind 1,2,3. Ex-vivo- und primäre Zellkultivierungen haben sich als sehr wertvoll erwiesen, insbesondere für genetische Studien und die Arzneimittelentwicklung 4,5,6. Die Verwendung von menschlichem Gewebe verbessert den translationalen Wert der Ergebnisse. Die langfristige 3D-Kultivierung von Myokardgewebe mit intakter Geometrie ist jedoch nicht gut etabliert. Die intakte Geometrie ist ein Schlüsselmerkmal für die Nachahmung von In-vivo-Bedingungen, da die richtige Herzfunktion, die Kommunikation zwischen verschiedenen Zellen sowie Zell-Matrix-Interaktionen Voraussetzungen sind. Die Kultivierung des Myokardgewebes durchlief verschiedene Entwicklungsphasen. Die Erfolgsrate und Stabilität der Ex-vivo-Myokardgewebekultivierung waren anfangs recht gering, aber jüngste Ansätze haben vielversprechende Ergebnisse erbracht 7,8,9,10,11.
Unter diesen waren Fischer et al. die ersten, die zeigten, dass die Lebensfähigkeit und kontraktile Leistungsfähigkeit des menschlichen Myokardgewebes in der Ex-vivo-Zellproduktion für viele Wochen aufrechterhalten werden kann7. Ihre Technik basierte auf dünnen Gewebeschnitten, die aus explantiertem menschlichem Myokard geschnitten wurden, die in neu entwickelten Kultivierungskammern montiert wurden, die definierte biomechanische Bedingungen und kontinuierliche elektrische Stimulation lieferten. Diese Kultivierungsmethode ähnelt stark der In-vivo-Funktion von Myokardgewebe und wurde von mehreren unabhängigen Forschungsgruppen 2,12,13,14,15 reproduziert. Wichtig ist, dass die von Fischer et al. verwendeten Kammern auch eine kontinuierliche Registrierung der entwickelten Kräfte für bis zu 4 Monate ermöglichten und somit beispiellose Möglichkeiten für die physiologische und pharmakologische Forschung an intaktem menschlichem Myokarderöffneten 7.
Ähnliche Techniken wurden unabhängig voneinander von anderen Gruppen entwickelt und auf Human-, Ratten-, Schweine- und Kaninchenmyokardangewendet 7,10,11. Pitoulis et al. entwickelten anschließend eine physiologischere Methode, die die normale Kraft-Längen-Beziehung während eines Kontraktionszyklus reproduziert, aber für die Hochdurchsatzanalyse weniger geeignet ist16. Daher kann der allgemeine Ansatz des biomimetischen Anbaus als ein weiterer Schritt zur Reduktion, Verfeinerung und Ersetzung (3R) von Tierversuchen angesehen werden.
Die Ausschöpfung dieses Potenzials erfordert jedoch standardisierte Verfahren, High-Content-Analysen und einen hohen Durchsatz. Wir stellen eine Technik vor, die das automatisierte Schneiden von lebendem menschlichem Myokard mit der In-vitro-Wartung in einem biomimetischen Kultivierungssystem kombiniert, das kommerziell verfügbar geworden ist (siehe Materialtabelle). Mit dem vorgeschlagenen Ansatz ist die Anzahl der einzelnen Scheiben, die aus einer einzigen transmuralen Myokardprobe erzeugt werden können, nur durch die Verarbeitungszeit begrenzt. Eine Probe von ausreichender Größe und Qualität (3 cm x 3 cm) liefert oft 20-40 Gewebescheiben, die bequem mit einem automatisierten Vibratom geschnitten werden. Diese Scheiben können in zum System gehörende Kultivierungskammern gelegt werden. Die Kammern ermöglichen eine elektrische Stimulation, deren Parameter moduliert werden können (z. B. Pulsdauer, Polarität, Rate und Strom), sowie die Einstellung von Vor- und Nachlast unter Verwendung von Federdrähten in den Kammern. Die Kontraktion jeder Scheibe wird durch die Bewegung eines kleinen Magneten, der an einem Federdraht befestigt ist, registriert und als interpretierbarer Graph angezeigt. Daten können jederzeit erfasst und mit frei verfügbarer Software analysiert werden. Abgesehen vom konstanten Baseline-Pacing können geplante Protokolle durchgeführt werden, um ihre Feuerfestperiode, die Stimulationsschwelle, die Post-Pause-Potenzierung und die Kraft-Frequenz-Beziehung funktionell zu bewerten.
Diese langfristige biomimetische Kultivierung mehrerer Myokardscheiben aus einem individuellen Herzen ebnet den Weg für zukünftige Ex-vivo-Forschung in menschlichem und tierischem Gewebe und erleichtert das Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin. Es wurde bereits auf verschiedene experimentelle Ansätze 2,12,13,15 angewendet. Hier geben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Aufbereitung von menschlichem Gewebe und liefern Lösungen für häufig auftretende Kultivierungsprobleme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Die Kultivierung von Kardiomyozyten hat eine Vielzahl von Entwicklungen erlebt, die von der zweidimensionalen (2D) Zellkultivierung bis hin zu iPSC-abgeleiteten Organoiden reichen. Im Jahr 2019 wurde eine Ex-vivo-Methode zur Kultivierung von Myokardscheiben aus menschlichen Herzproben demonstriert, während man sich dem In-vivo-Zustand der Myokardkontraktion näherte. Diese Proben stammen hauptsächlich aus Herztransplantationen oder der Platzierung von linksventrikulären Unterstützungsgeräten. Mit einem Vibratom und einem speziell entwickelten Kultivierungssystem werden 300 μm dicke Scheiben zwischen einen festen und einen Federdraht gelegt, was eine stabile und reproduzierbare Kultivierung über mehrere Wochen ermöglicht. Während des Anbaus werden die Scheiben entsprechend den individuellen Einstellungen kontinuierlich stimuliert. Kontraktionen können in Echtzeit angezeigt und aufgezeichnet werden, und pharmakologische Mittel können leicht angewendet werden. Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle können geplant und durchgeführt werden, um wichtige Kontraktionsparameter wie Post-Pause-Potenzierung, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht das System eine variable Vor- und Nachlasteinstellung für eine physiologischere Kultivierung.
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie eine erfolgreiche Langzeitkultivierung von humanen linksventrikulären Myokardschnitten unter Verwendung einer kommerziellen biomimetischen Kultivierungslösung erzeugt werden kann.

Die Kontraktion der Myokardscheiben wurde nach dem Einsetzen der Kultivierungskammer in den entsprechenden Anschluss auf dem Computerbildschirm angezeigt (Abbildung 3). Die Kontraktion der menschlichen Myokardscheiben begann sofort nach der Stimulation. Die Scheiben wurden für 5-10 min hyperkontrahiert. Dies war sichtbar als eine Zunahme der diastolischen Kräfte, verursacht durch eine tonische Kontraktur von beschädigten Gewebefraktionen. Dieser Prozess wurde innerhalb von 1-1,5 h in unte...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Wir präsentieren ein Protokoll für die Ex-vivo-Kultivierung von menschlichem ventrikulärem Myokardgewebe. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kontraktionskraft und Kinetik sowie die Anwendung von Vor- und Nachlast, um die in vivo physiologische Umgebung genauer nachzuahmen.

Aufbereitung von menschlichem Myokardgewebe für die Langzeitkultivierung

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Mit diesem Protokoll können humane linksventrikuläre Gewebeschnitte ex vivo in einer biomimetischen Kammer kultiviert werden. Die Anwendung von Pre- und Afterloads verbessert die Ähnlichkeit der physiologischen Umgebung. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche Registrierung der Gewebekontraktion.Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle ermöglichen die Beurteilung von Vitalkontraktionsparametern wie Potenzierung nach der Pause, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode. Die langfristige Kultivierung von Myokardscheiben unter Verwendung dieses Aufbaus wird den Weg für die zukünftige Ex-vivo-Forschung ebnen und dieses Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin erleichtern. Um zu beginnen, tauchen Sie die Kultivierungskammern und Graphitelektroden in einen Liter einer 10% Isopropanollösung und rühren Sie über Nacht.Am nächsten Tag die Kammern für 3 Minuten in eine 100% Isopropanol-Lösung überführen und dann die Kammern und Graphitelektroden unter einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen lassen. Befestigen Sie eine Leiterplatte an jeder Kammer entsprechend den verfügbaren Positionen auf der Wippe. Legen Sie zwei Graphitelektroden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Leiterplatte und legen Sie dann einen 35-Millimeter-Petrischalendeckel auf die Kammer, um eine Infektion zu verhindern.Als nächstes füllen Sie das Schneidefach bis zu 90 bis 95% mit Schneidepuffer. Die Gewebeprobe in eine 100-Millimeter-Petrischale geben, die mit Kaltschneidepuffer gefüllt ist, und die Schale bei 4 Grad Celsius auf eine Kühlplatte legen. Entfernen Sie endokardiale Trabekula, indem Sie das Endokard mit einer Pinzette halten, und schneiden Sie dann mit einer Schere etwa 3 Millimeter Endokardgewebe ab.Fixieren Sie die geschnittene Gewebeprobe, endokardial seitlich bis zu einem 2 x 2 Zentimeter großen Gummipflaster mit vier 0,9 x 70 Millimeter großen 20-Gauge-Nadeln, die in einer quadratischen Position fixiert sind. Stellen Sie sicher, dass der diagonale Rand jeder Nadelspitze nach innen zeigt, die Fixierung verbessert und Schäden am Myokard verhindert. Schneiden Sie mit einem Skalpell das gesamte überschüssige Gewebe außerhalb der vier Nadelquadrate weg.Legen Sie die getrimmte Probe mit einer Pinzette für 10 Sekunden auf ein steriles Stück Gewebe, um überschüssigen Schneidepuffer zu entfernen. Als nächstes entfernen Sie die Agarosespritze aus dem Wasserbad und tauchen Sie die Probe in Agarose. Lassen Sie die Agarose fünf Minuten lang auf einer Kühlplatte erstarren.Die endokardiale Seite der Probe muss in der Agarose sichtbar sein. Legen Sie mit einer Pinzette die epikardiale Seite der in Agarose enthaltenen Probe auf die verklebte Fläche und drücken Sie dann die agarosehaltige Probe vorsichtig mit einem stumpfen Werkzeug von oben, ohne die Agarose zu schneiden oder zu beschädigen. Lassen Sie den Kleber für 1 Minute erstarren.Stellen Sie die Schwingungsamplitude auf 1 Millimeter, die anfängliche Schnittgeschwindigkeit auf 0,07 Millimeter pro Sekunde und die Dicke der Scheibe auf 300 μm ein. Nachdem Sie das Anbausystem an einen Computer angeschlossen haben, starten Sie das entsprechende Softwareprogramm. Stellen Sie die Wippgeschwindigkeit auf 60 U / min ein und stellen Sie die Stimulationsparameter vor.Stellen Sie für menschliche Herzschnitte die Standardstimulation auf biphasische Impulse mit 50 Milliampere oder Strom ein, die aus 3 Millisekunden positivem Strom, 1 Millisekunde Pause und einem 3-Millisekunden-Impuls mit invertiertem Strom bei einer Schrittfrequenz von 30 Schlägen pro Minute oder bpm bestehen, überprüfen Sie dann die Elektrodenanzeigen der Software und überprüfen Sie, ob die Elektroden der Kultivierungskammern korrekt funktionieren. Trennen Sie mit einer Pinzette die Agarose vom Gewebe. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu berühren und behandeln Sie es vorsichtig, da jede Schädigung des Gewebes die Erfolgsrate der Kultivierung verringert.Um zwei Kunststoffdreiecke an einer Probe zu befestigen, geben Sie 1 Mikroliter Kleber auf einen sterilen Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine hakenförmige Pinzette, um ein autoklaviertes Kunststoffdreieck aufzunehmen. Tauchen Sie schnell die Vorderkante des Dreiecks in den Kleber und kleben Sie das Dreieck senkrecht zur Kardiomyozytenausrichtung auf die Probe.Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Dreieck. Schneiden Sie mit einem Skalpell das Gewebe ab, das die Dreiecksbreite überschreitet, und legen Sie die Scheibe mit den beiden montierten Dreiecken zurück in die Schneideschale mit dem Schneidepuffer. Entfernen Sie die mediengefüllte Kultivierungskammer aus dem Inkubator.Wählen Sie eine vorbereitete Scheibe aus und führen Sie sie in die Kammer ein, indem Sie ein Dreieck mit jedem Stift verbinden. Passen Sie den Abstand zwischen den Montagestiften an die Stichprobengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Probe in das Medium eingetaucht ist.Nachdem Sie die Schüssel auf die Wippe gelegt haben, verringern Sie die Vorspannung, indem Sie die Einstellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Grundlinie des entsprechenden Diagramms auf dem Computerbildschirm nicht mehr ändert, und erhöhen Sie dann vorsichtig die Vorspannung oder Spannung, indem Sie die Einstellschraube im Uhrzeigersinn drehen. Fahren Sie bei Kammern mit hoher Steifigkeit fort, bis die entsprechende Baseline im Diagramm um 1.000 bis 1.200 Einheiten gestiegen ist, was einer Millinewton-Vorspannung entspricht. Nach der Zubereitung des frischen Kulturmediums das Medium in einem Wasserbad oder Heißluftinkubator bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten vorwärmen.Entfernen Sie das Medium aus der Kammer, wobei Sie etwa 0,8 Milliliter in der Kammer verbleiben, und fügen Sie dann 1,6 Milliliter frisches Medium in dieselbe Kammer hinzu, wodurch ein Gesamtvolumen von Medium bis 2,4 Milliliter pro Kammer entsteht. Legen Sie schließlich die Abdeckung der Kammer zurück und stellen Sie die Kultivierungskammer in ihre jeweilige Position. Das Auslesen der Kontraktion von fünf Myokardschnitten während einer typischen Stimulation bestand aus vier verschiedenen Abschnitten der Potenzierung nach der Pause, der Stimulationsschwelle, der Kraft-Frequenz-Beziehung und der Refraktärperiode.Im Vergleich zur Kontrolle war die Kontraktionskraft der mit Calciumantagonisten, Nifedipin und Calciseptin behandelten Scheiben, innerhalb von 10 Minuten verringert. Im Gegensatz dazu erhöhte der spannungsgesteuerte Kalziumkanal-Agonist Bay-K8644 die Kontraktionskraft. Die post-pausierende Potenzierung der Kontroll- und behandelten Schnitte wurde für die intrazelluläre Calciumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum untersucht.Das Steuerelement-Slice zeigte keine Änderungen an. In Gegenwart von Calciseptin und Nifedipin führte die Hemmung der L-Typ-Calciumkanäle nach einer Pause von 50 Sekunden zu einer Potenzierung der ersten Kontraktion, was einen höheren relativen Beitrag der intrazellulären Calciumfreisetzung zur totalen Kontraktilität widerspiegelt. Der gegenteilige Effekt wurde bei Bay-K8644 beobachtet, das den Eintritt von extrazellulärem Kalzium über die L-Typ-Calciumkanäle stimuliert.Bei der Kraft-Frequenz-Beziehungsanalyse wurde keine Änderung in der Kontrollschicht beobachtet. Die Calciseptin-Behandlung änderte nichts an der Fähigkeit des Slices, den Reizen bei einer Erhöhung der Stimulationsfrequenz zu folgen, wenn die Daten vor und nach der Behandlung verglichen wurden. Im Vergleich zu Calciseptin verhinderte Nifedipin eine Erhöhung der Kontraktilität bei höheren Schrittmacherraten und reduzierte die maximale Abscheidungsrate bei 80 bpm.Bei Bay-K8644 wurde eine erhöhte Kontraktionskraft bei sehr niedrigen Stimulationsfrequenzen beobachtet. Bei Frequenzen von mehr als 50 bpm war die Kontraktionskraft jedoch geringer als während des Vorbehandlungszustands. Ausgeschnittenes Gewebe sollte schnell auf 4 Grad Kardioplegie übertragen werden.Nach dem Schneiden müssen Kunststoffdreiecke senkrecht zur Faserrichtung angebracht werden. Die Vorspannung sollte 1500 Millinewton nicht überschreiten. Die biomimetische Schnittkultur kann Forschern helfen, genetische Manipulationen sowie zellbasierte Therapien zur Untersuchung der Regeneration und Reparatur bei erwachsenen menschlichen Myokarden einzusetzen.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Forschung

Medizin

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