Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

המחקר מומן על ידי מענקי DZHK 81Z0600207 (JH, PS ו- DM) ו- 81X2600253 (AD ו- TS).
המחברים רוצים להודות לקלאודיה פאני, מיי-פינג וו ומתיאס סמיש על תמיכתם בהכנת הסט-אפים, כמו גם על התחזוקה השוטפת של גידול הרקמות.

איסוף הרקמות לניסויים המתוארים כאן אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת מינכן ובוכום של אוניברסיטת הרוהר. המחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב לפני איסוף הרקמות.
1. רכישת רקמות
<ol><li>להשיג רקמה אנושית מחולים שעברו ...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

בעבר, מחקר הלב וכלי הדם עשה התקדמות רבה בטיפוח של קרדיומיוציטים. עם זאת, הטיפוח התלת-ממדי של קרדיומיוציטים עם גיאומטריה שלמה עדיין אינו מבוסס היטב. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים שיושמו עבור גידול ex vivo של רקמת שריר הלב, הפרוטוקול שתיארנו כאן דומה יותר לסביבת in vivo של הרקמה. יתר על כן, ה?...

בעשור האחרון, גידול במבחנה של תאי שריר הלב עשה התקדמות רבה, החל מטכניקות דו-ממדיות ותלת-ממדיות (תלת-ממדיות) וכלה בשימוש באורגנואידים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שהתמיינו למיוציטים לבביים 1,2,3. גידולי Ex vivo ותאים ראשוניים הראו שהם בעלי ערך רב, במיוחד עבור מחקרים גנטיים ופיתוח תרופות 4,5,6. שימוש ברקמות אנושיות משפר את הערך התרגומי של התוצאות. עם זאת, טיפוח תלת-ממדי ארוך טווח של רקמות שריר הלב עם גיאומטריה שלמה אינו מבוסס היטב. הגיאומטריה השלמה היא תכונה מרכזית לחיקוי תנאי in vivo, שכן תפקוד לב תקין, תקשורת בין תאים שונים, כמו גם אינטראקציות בין מטריצת תאים הם תנאים מוקדמים. טיפוח רקמות שריר הלב עבר שלבים שונים של התפתחות. אחוזי ההצלחה והיציבות של גידול רקמות שריר הלב ex vivo היו בתחילה נמוכים למדי, אך הגישות האחרונות הניבו תוצאות מבטיחות 7,8,9,10,111.
מבין אלה, Fischer et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לשמור על כדאיות וביצועים מתכווצים של רקמת שריר הלב האנושית בטיפוח תאי ex vivo במשך שבועות רבים7. הטכניקה שלהם התבססה על פרוסות רקמה דקות שנחתכו מתוך שריר הלב האנושי, שהורכבו בתאי גידול שפותחו לאחרונה וסיפקו תנאים ביומכניים מוגדרים וגירוי חשמלי מתמשך. שיטת טיפוח זו דומה מאוד לתפקוד in vivo של רקמת שריר הלב, ושוכפלה על ידי מספר קבוצות מחקר עצמאיות 2,12,13,14,15. חשוב לציין כי התאים ששימשו את Fischer et al. אפשרו גם רישום רציף של כוחות מפותחים במשך עד 4 חודשים, ובכך פתחו הזדמנויות חסרות תקדים למחקר פיזיולוגי ופרמקולוגי על שריר הלב האנושי השלם7.
טכניקות דומות פותחו באופן עצמאי על ידי קבוצות אחרות ויושמו על בני אדם, חולדות, חזירים וארנבים שריר הלב 7,10,11. Pitoulis et al. פיתחו לאחר מכן שיטה פיזיולוגית יותר, המשחזרת את יחס הכוח-אורך הרגיל במהלך מחזור התכווצות, אך פחות מתאימה לניתוח בתפוקה גבוהה16. ככזו, ניתן לראות את הגישה הכללית של גידול ביומימטי כצעד נוסף לצמצום, עידון והחלפה (3R) של ניסויים בבעלי חיים.
עם זאת, ניצול של פוטנציאל זה דורש נהלים סטנדרטיים, ניתוחי תוכן גבוהים ורמת תפוקה גבוהה. אנו מציגים טכניקה המשלבת חיתוך אוטומטי של שריר הלב האנושי החי עם תחזוקה במבחנה במערכת גידול ביומימטית שהפכה לזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). עם הגישה המוצעת, מספר הפרוסות הבודדות שניתן ליצור מדגימה אחת של שריר הלב הטרנסמורלי מוגבל רק על ידי זמן העיבוד. דגימה בגודל ובאיכות מספיקים (3 ס"מ על 3 ס"מ) מניבה לעתים קרובות 20-40 פרוסות רקמה שנחתכות בנוחות עם ויברטום אוטומטי. פרוסות אלה ניתן לשים בתאי טיפוח השייכים למערכת. התאים מאפשרים גירוי חשמלי, שאת הפרמטרים שלו ניתן לווסת (כלומר, משך הדופק, הקוטביות, הקצב והזרם), כמו גם את התאמת העומס לפני ואחרי, באמצעות חוטי קפיץ בתוך התאים. הכיווץ של כל פרוסה נרשם מתנועה של מגנט קטן המחובר לחוט קפיץ ומוצג כגרף הניתן לפרשנות. ניתן להקליט נתונים בכל עת ולנתח אותם באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. מלבד הקצב הבסיסי הקבוע, ניתן לבצע פרוטוקולים מתוזמנים כדי להעריך באופן פונקציונלי את תקופת העקשנות שלהם, את סף הגירוי, את העוצמה שלאחר ההשהיה ואת הקשר בין הכוח לתדר.
טיפוח ביומימטי ארוך טווח זה של פרוסות שריר הלב מרובות מלב בודד סולל את הדרך למחקר ex vivo עתידי הן ברקמות אנושיות והן ברקמות של בעלי חיים, ומאפשר את הסינון להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. זה כבר יושם על גישות ניסיוניות שונות 2,12,13,15. כאן, אנו נותנים תיאור מפורט שלב אחר שלב של הכנת רקמות אנושיות ומספקים פתרונות לבעיות טיפוח שנתקלים בהן לעתים קרובות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

גידול קרדיומיוציטים ראה מספר עצום של התפתחויות, החל מגידול תאים דו-ממדי (דו-ממדי) וכלה באורגנואידים שמקורם ב-iPSC. בשנת 2019 הודגמה דרך ex vivo לטפח פרוסות שריר הלב המתקבלות מדגימות לב אנושיות, תוך התקרבות למצב in vivo של התכווצות שריר הלב. דגימות אלה מקורן בעיקר בהשתלות לב או בהצבת מכשירי סיוע לחדר שמאלי. באמצעות ויברטום ומערכת טיפוח שפותחה במיוחד, פרוסות בעובי 300 מיקרומטר ממוקמות בין חוט קבוע לחוט קפיץ, ומאפשרות טיפוח יציב וניתן לשחזור במשך מספר שבועות. במהלך הטיפוח, הפרוסות מגורות באופן רציף על פי הגדרות בודדות. ניתן להציג ולתעד התכווצויות בזמן אמת, וניתן ליישם בקלות חומרים פרמקולוגיים. ניתן לתזמן ולבצע פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש כדי להעריך פרמטרים חיוניים של כיווץ כמו פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחסי כוח-תדר ותקופת עקשן. יתר על כן, המערכת מאפשרת הגדרה משתנה לפני ואחרי העומס לטיפוח פיזיולוגי יותר.
כאן, אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב כיצד ליצור טיפוח מוצלח לטווח ארוך של פרוסות שריר הלב של החדר השמאלי האנושי, באמצעות פתרון גידול ביומימטי מסחרי.

הכיווץ של פרוסות שריר הלב הוצג על מסך המחשב לאחר החדרת תא הטיפוח למחבר המתאים לו (איור 3). התכווצות פרוסות שריר הלב האנושיות החלה מיד עם הגירוי. הפרוסות התרכזו יתר על המידה במשך 5-10 דקות. זה נראה לעין כעלייה של כוחות דיאסטולים, שנגרמו על ידי התכווצות טוניקה של שברי רקמה פגומים....

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח ex vivo של רקמת שריר הלב החדרית האנושית. זה מאפשר ניתוח מפורט של כוח התכווצות וקינטיקה, כמו גם את היישום של pre- ו- afterload כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית in vivo מקרוב יותר.

הכנת רקמת שריר הלב האנושית לטיפוח ארוך טווח

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטפח פרוסות רקמה של החדר השמאלי האנושי ex vivo בתא ביומימטי. היישום של עומסים לפני ואחרי משפר את הדמיון של הסביבה הפיזיולוגית. טכניקה זו מאפשרת רישום רציף של התכווצות רקמות.פרוטוקולי גירוי המוגדרים על-ידי המשתמש מאפשרים הערכה של פרמטרי כיווץ חיוניים כמו פוטנציה לאחר הפסקה, סף גירוי, יחס כוח-תדר ותקופה עקשן. הטיפוח ארוך הטווח של פרוסות שריר הלב, באמצעות מערך זה, יסלול את הדרך למחקר ex vivo עתידי, ויקל על הקרנה זו להשפעות תרופתיות טיפוליות וקרדיוטוקסיות ברפואת הלב וכלי הדם. כדי להתחיל, להטביע את תאי הטיפוח ואלקטרודות הגרפיט לליטר אחד של תמיסת איזופרופנול של 10% ולהתסיס בן לילה.למחרת, מעבירים את התאים לתמיסת איזופרופנול של 100% למשך 3 דקות, ואז מאפשרים לתאים ולאלקטרודות הגרפיט להתייבש באוויר מתחת למכסה זרימה למינרי. חבר לוח מעגלים לכל תא בהתאם למיקומים הזמינים על הנדנדה. מניחים שתי אלקטרודות גרפיט על לוח המעגלים בהתאם להוראות היצרן, ואז מניחים מכסה צלחת פטרי באורך 35 מילימטרים על התא כדי למנוע זיהום.לאחר מכן, מלאו את מגש החיתוך עד 90 עד 95% עם מאגר חיתוך. מעבירים את דגימת הרקמה לצלחת פטרי באורך 100 מילימטרים במילוי חיץ קר, ומניחים את המנה על צלחת קירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הטרבקולה אנדוקרדיאלית על ידי החזקת אנדוקרדיום בפינצטה, ולאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך כ -3 מילימטרים של רקמת אנדוקרדיאל.קבעו את דגימת הרקמה החתוכה, הצד האנדוקרדיאלי עד לתיקון גומי בגודל 2 על 2 ס"מ באמצעות ארבע מחטים בגודל 0.9 על 70 מילימטר 20 מילימטרים המקובעות במצב מרובע. ודאו שהקצה האלכסוני של כל קצה מחט מצביע פנימה, משפר את הקיבוע ומונע נזק לשריר הלב. באמצעות אזמל, חותכים את כל הרקמה העודפת מחוץ לארבעת ריבועי המחט.באמצעות פינצטה, מניחים את הדגימה הגזומה על פיסת רקמה סטרילית למשך 10 שניות כדי להסיר עודפי חיתוך. לאחר מכן, הסר את מזרק האגרוז מאמבט המים והטביע את הדגימה באגרוס. תנו לאגרוזה להתמצק במשך חמש דקות על צלחת קירור.הצד האנדוקרדיאלי של המדגם חייב להיות גלוי באגרוז. באמצעות פינצטה, מניחים את הצד האפיקרדיאלי של הדגימה הכלולה באגרוז על גבי האזור המודבק, ואז לוחצים בעדינות על הדגימה המכילה אגרוז מלמעלה עם כלי קהה מבלי לחתוך או לפגוע באגרוז. תנו לדבק להתמצק למשך דקה אחת.הגדר את משרעת הרטט ל-1 מילימטר, את מהירות החיתוך הראשונית ל-0.07 מילימטר לשנייה ואת עובי הפרוסה ל-300 מיקרון. לאחר חיבור מערכת הטיפוח למחשב, הפעל את התוכנה המתאימה. הגדר את מהירות הנדנדה ל-60 סל"ד והגדר מראש את פרמטרי הגירוי.עבור פרוסות לב אנושיות, הגדר את הגירוי הסטנדרטי לדחפים דו-פאזיים עם 50 מילימפ או זרם המורכב מזרם חיובי של 3 אלפיות השנייה, הפסקה של אלפית השנייה ופולס של 3 אלפיות השנייה של זרם הפוך בקצב קצב של 30 פעימות לדקה או bpm, ולאחר מכן בדוק את מחווני האלקטרודה של התוכנה וודא שהאלקטרודות של תאי הטיפוח פועלות כראוי. באמצעות פינצטה, להפריד את האגרוז מן הרקמה. הימנעו מלגעת ברקמה וטפלו בה בזהירות, שכן כל פגיעה ברקמה תפחית את אחוזי ההצלחה של הטיפוח.כדי לחבר שני משולשי פלסטיק לדגימה, הניחו מיקרוליטר אחד של דבק על מכסה צלחת פטרי סטרילי. השתמשו בפינצטה מחוברת כדי להרים משולש פלסטיק אוטומטי אחד. טבלו במהירות את הקצה הקדמי של המשולש בדבק והדביקו את המשולש על הדגימה בניצב ליישור הקרדיומיוציטים.חזור על הפעולה עבור המשולש השני. בעזרת אזמל, חותכים את הרקמה העולה על רוחב המשולש ומניחים את הפרוסה עם שני המשולשים המותקנים בחזרה למגש החיתוך המכיל מאגר חיתוך. הסר את תא הטיפוח המלא הבינוני מהחממה.בחר פרוסה אחת מוכנה והכנס אותה לתא על-ידי חיבור משולש אחד לכל סיכה. התאם את המרחק בין פיני ההרכבה לגודל המדגם. ודא שהמדגם שקוע בתווך.לאחר הנחת המנה על הנדנדה, הקטן את הטעינה מראש על ידי סיבוב בורג הכוונון נגד כיוון השעון עד שבסיס הגרף המתאים על מסך המחשב אינו משתנה עוד, ולאחר מכן הגדל בזהירות את הטעינה מראש או המתח על ידי סיבוב בורג הכוונון בכיוון השעון. עבור תאים עם קשיחות גבוהה, המשך עד שקו הבסיס המתאים בגרף גדל ב- 1, 000 ל- 1, 200 יחידות המתאימות לטעינה מראש של מילינווטון אחד. לאחר הכנת מדיום הטיפוח הטרי, מחממים מראש את המדיום באמבט מים או באינקובטור אוויר חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות.מוציאים את המדיום מהתא, ומשאירים כ-0.8 מיליליטרים בתא, ואז מוסיפים 1.6 מיליליטרים של מדיום טרי לאותו תא, מה שהופך את הנפח הכולל של בינוני ל-2.4 מיליליטרים לכל תא. לבסוף, הניחו את הכיסוי של החדר בחזרה והניחו את תא הטיפוח במקומו המתאים. הקריאה של כיווץ חמש פרוסות שריר הלב במהלך גירוי טיפוסי כללה ארבעה חלקים נפרדים של פוטנציה לאחר ההשהיה, סף הגירוי, יחס כוח-תדר ותקופת עקשן.בהשוואה לשליטה, כוח הכיווץ של הפרוסות שטופלו באנטגוניסטים של סידן, ניפדיפין וקלציצפטין, פחת תוך 10 דקות. לעומת זאת, אגוניסט תעלת הסידן המגודר במתח, Bay-K8644, הגדיל את כוח ההתכווצות. הפוטנציה לאחר ההפסקה של פרוסות הבקרה והפרוסות המטופלות הוערכה עבור שחרור הסידן התוך-תאי מהרשתית הסרקופלסמית.פרוסת הבקרה לא הראתה שינויים כלשהם. בנוכחות קלציצפטין וניפדיפין, עיכוב תעלות הסידן מסוג L הוביל לפוטנציה של ההתכווצות הראשונה לאחר הפסקה של 50 שניות, המשקפת תרומה יחסית גבוהה יותר של שחרור סידן תוך תאי להתכווצות מוחלטת. ההשפעה ההפוכה נצפתה עם Bay-K8644, אשר מגרה את כניסתו של סידן חוץ-תאי דרך תעלות הסידן מסוג L.בניתוח יחסי כוח-תדר, לא נצפה שינוי בפרוסת הבקרה. הטיפול בקלציצפטין לא שינה את יכולתה של הפרוסה לעקוב אחר הגירויים עם עליית תדירות הגירוי בעת השוואת הנתונים לפני ואחרי הטיפול. בהשוואה לקלציצפטין, ניפדיפין מנע עלייה בהתכווצות בשיעורי קצב גבוהים יותר והפחית את קצב הלכידה המרבי ב-80 פעימות לדקה.עם Bay-K8644 נצפה כוח כיווץ מוגבר בתדרי גירוי נמוכים מאוד. עם זאת, בתדרים הגבוהים מ-50 פעימות לדקה, כוח ההתכווצות היה נמוך יותר מאשר במצב שלפני הטיפול. יש להעביר במהירות רקמה שנכרתה ל-4 מעלות קרדיופלגיה.לאחר החיתוך, משולשי פלסטיק חייבים להיות מחוברים בניצב לכיוון הסיבים. הטעינה מראש לא תעלה על 1500 מילינווטון. תרבית פרוסות ביומימטית יכולה לסייע לחוקרים להשתמש במניפולציות גנטיות, כמו גם בטיפולים מבוססי תאים לחקר התחדשות ותיקון בשריר הלב האנושי הבוגר.

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

קרנית התורם רקמות הכנה Keratoplasty האנדותל

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

צנתור לטווח ארוך של טרונק לימפה במעי וגביית הלימפה חזירים ילודים

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

מיקום כירורגי של קטטרים לטווח ארוך בדיקת תרגיל לב וכלי דם ב חזירים

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. Indeed, research focusing on the discovery of new potential therapeutic targets using genetically altered mice requires a reliable, long-term assessment of the systemic arterial pressure variation. Currently, the gold standard for obtaining long-term measurements of blood pressure in ambulatory mice uses implantable radio-transmitters, which require&#160;artery cannulation. This technique eliminates the need for tethering, restraining, or anesthetizing the animals which introduce stress and artifacts during data sampling. However, arterial blood pressure monitoring in mice via catheterization can be rather challenging due to the small size of the arteries. Here we present a step-by-step guide to illustrate the crucial key passages for a successful subcutaneous implantation of radio-transmitters and carotid artery cannulation in mice. We also include examples of long-term blood pressure activity taken from freely moving mice after a period of post-surgery recovery. Following this procedure will allow reliable direct blood pressure recordings from multiple animals simultaneously.

The goal of this protocol is to assess systemic blood pressure in conscious freely moving mice using implantable radio-telemetry devices.

מדידת לחץ דם לטווח ארוך בעכברים לנוע בחופשיות באמצעות טלמטריה

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

כל 3D-לב בדיקת רקמות שריר הלב

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

שיפור של מודל חזירי אוטם שריר החזה סגור על ידי סטנדרטיזציה של רקמות ופרוצדורות דגימה דם

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

ניתוח הקלטות אלקטרוקרדיוגרפיה ארוכות טווח לאיתור הפרעות קצב בעכברים

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).