Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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La ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch per il loro supporto nella preparazione degli allestimenti, nonché per il regolare mantenimento della coltivazione dei tessuti.

La raccolta di tessuti per gli esperimenti qui descritti è stata approvata dai comitati di revisione istituzionale dell'Università di Monaco e dell'Università della Ruhr di Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.
1. Acquisizione tissutale
<ol><li>Ottenere tessuto umano da pazienti sottoposti a trapianto di cuore o cardiochirurgia...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all'ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l'applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzar...

Nell'ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all'uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci 1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci 4,5,6. L'uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei risultati. La coltivazione 3D a lungo termine di tessuti miocardici con geometria intatta, tuttavia, non è ben consolidata. La geometria intatta è una caratteristica chiave per imitare le condizioni in vivo, poiché la corretta funzione cardiaca, la comunicazione tra cellule diverse e le interazioni cellula-matrice sono prerequisiti. La coltivazione del tessuto miocardico ha attraversato varie fasi di sviluppo. Il tasso di successo e la stabilità della coltivazione di tessuti miocardici ex vivo erano inizialmente piuttosto bassi, ma gli approcci recenti hanno prodotto risultati promettenti 7,8,9,10,11.
Tra questi, Fischer et al. sono stati i primi a dimostrare che la vitalità e le prestazioni contrattili del tessuto miocardico umano possono essere mantenute nella coltivazione cellulare ex vivo per molte settimane7. La loro tecnica si basava su sottili fette di tessuto tagliate dal miocardio umano espiantato, che erano montate in camere di coltivazione di nuova concezione che fornivano condizioni biomeccaniche definite e stimolazione elettrica continua. Questo metodo di coltivazione assomiglia molto alla funzione in vivo del tessuto miocardico ed è stato riprodotto da diversi gruppi di ricerca indipendenti 2,12,13,14,15. È importante sottolineare che le camere utilizzate da Fischer et al. hanno anche permesso la registrazione continua delle forze sviluppate per un massimo di 4 mesi, aprendo così opportunità senza precedenti per la ricerca fisiologica e farmacologica sul miocardio umano intatto7.
Tecniche simili sono state sviluppate indipendentemente da altri gruppi e applicate al miocardio umano, di ratto, suino e di coniglio 7,10,11. Pitoulis et al. hanno successivamente sviluppato un metodo più fisiologico, che riproduce la normale relazione forza-lunghezza durante un ciclo di contrazione, ma è meno adatto per l'analisi ad alto rendimento16. In quanto tale, l'approccio generale della coltivazione biomimetica può essere considerato come un ulteriore passo verso la riduzione, l'affinamento e la sostituzione (3R) degli esperimenti sugli animali.
Tuttavia, lo sfruttamento di questo potenziale richiede procedure standardizzate, analisi ad alto contenuto e un elevato livello di throughput. Presentiamo una tecnica che combina l'affettamento automatizzato del miocardio umano vivente con il mantenimento in vitro in un sistema di coltivazione biomimetico che è diventato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Con l'approccio proposto, il numero di singole fette che possono essere generate da un singolo campione miocardico transmurale è limitato solo dal tempo di elaborazione. Un campione di dimensioni e qualità sufficienti (3 cm x 3 cm) produce spesso 20-40 fette di tessuto che vengono comodamente tagliate con un vibratoma automatizzato. Queste fette possono essere collocate in camere di coltivazione appartenenti al sistema. Le camere consentono la stimolazione elettrica, i cui parametri possono essere modulati (cioè durata dell'impulso, polarità, velocità e corrente), nonché la regolazione del pre- e postcarico, utilizzando fili a molla all'interno delle camere. La contrazione di ogni fetta è registrata dal movimento di un piccolo magnete attaccato a un filo a molla e visualizzato come un grafico interpretabile. I dati possono essere registrati in ogni momento e analizzati utilizzando un software disponibile gratuitamente. Oltre alla stimolazione costante al basale, è possibile eseguire protocolli programmati per valutare funzionalmente il loro periodo refrattario, la soglia di stimolazione, il potenziamento post-pausa e la relazione forza-frequenza.
Questa coltivazione biomimetica a lungo termine di più fette miocardiche da un singolo cuore apre la strada a future ricerche ex vivo sia nel tessuto umano che in quello animale e facilita lo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci nella medicina cardiovascolare. È già stato applicato a vari approcci sperimentali 2,12,13,15. Qui, forniamo una descrizione dettagliata passo-passo della preparazione del tessuto umano e forniamo soluzioni per i problemi di coltivazione frequentemente incontrati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall'utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un'impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.
Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.

La contrazione delle fette miocardiche è stata visualizzata sullo schermo del computer dopo l'inserimento della camera di coltivazione nel connettore corrispondente (Figura 3). La contrazione delle fette miocardiche umane è iniziata immediatamente dopo la stimolazione. Le fette ipercontrastratte per 5-10 min. Ciò era visibile come un aumento delle forze diastoliche, causato da una contrattura tonica delle frazioni tissutali danneggiate. Questo processo è stato ripristinato a vari livelli...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un'analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l'applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l'ambiente fisiologico in vivo .

Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Utilizzando questo protocollo, le fette di tessuto ventricolare sinistro umano possono essere coltivate ex vivo in una camera biomimetica. L'applicazione di pre e postcarico migliora la somiglianza dell'ambiente fisiologico. Questa tecnica consente la registrazione continua della contrazione tissutale.I protocolli di stimolazione definiti dall'utente consentono la valutazione dei parametri di contrazione vitale come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. La coltivazione a lungo termine di fette miocardiche, utilizzando questa configurazione, aprirà la strada alla futura ricerca ex vivo, facilitando questo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci in medicina cardiovascolare. Per iniziare, immergere le camere di coltivazione e gli elettrodi di grafite in un litro di una soluzione di isopropanolo al 10% e agitare durante la notte.Il giorno seguente, trasferire le camere in una soluzione di isopropanolo al 100% per 3 minuti, quindi lasciare asciugare all'aria le camere e gli elettrodi di grafite sotto una cappa a flusso laminare. Collegare un circuito stampato a ciascuna camera in base alle posizioni disponibili sul bilanciere. Posizionare due elettrodi di grafite sul circuito stampato secondo le istruzioni del produttore, quindi posizionare un coperchio della capsula di Petri da 35 millimetri sulla camera per prevenire l'infezione.Quindi, riempire il vassoio di taglio fino al 90-95% con tampone di affettatura. Trasferire il campione di tessuto in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita con tampone di affettatura a freddo e posizionare la piastra su una piastra di raffreddamento a 4 gradi Celsius. Rimuovere le trabecole endocardiche tenendo l'endocardio con una pinzetta, quindi utilizzare le forbici per tagliare via circa 3 millimetri di tessuto endocardico.Fissare il campione di tessuto tagliato, lato endocardico fino a un cerotto di gomma di 2 per 2 centimetri utilizzando quattro aghi da 0,9 per 70 millimetri calibro 20 che sono fissati in posizione quadrata. Assicurarsi che il bordo diagonale di ciascuna punta dell'ago sia rivolto verso l'interno, migliorando la fissazione e prevenendo danni al miocardio. Usando un bisturi, tagliare via tutto il tessuto in eccesso al di fuori dei quattro quadrati dell'ago.Usando una pinzetta, posizionare il campione tagliato su un pezzo di tessuto sterile per 10 secondi per rimuovere il tampone di affettamento in eccesso. Quindi, rimuovere la siringa di agarosio dal bagno d'acqua e immergere il campione in agarosio. Lasciare solidificare l'agarosio per cinque minuti su una piastra di raffreddamento.Il lato endocardico del campione deve essere visibile nell'agarosio. Usando una pinzetta, posizionare il lato epicardico del campione contenuto nell'agarosio sopra l'area incollata, quindi premere delicatamente il campione contenente agarosio dall'alto con uno strumento smussato senza tagliare o danneggiare l'agarosio. Lasciare solidificare la colla per 1 minuto.Impostare l'ampiezza della vibrazione su 1 millimetro, la velocità di taglio iniziale a 0,07 millimetri al secondo e lo spessore della fetta a 300 micron. Dopo aver collegato il sistema di coltivazione a un computer, avviare il programma software corrispondente. Impostare la velocità del bilanciere a 60 giri/min e preimpostare i parametri di stimolazione.Per le fette cardiache umane, impostare la stimolazione standard su impulsi bifasici con 50 milliampere o corrente costituiti da corrente positiva di 3 millisecondi, pausa di 1 millisecondo e un impulso di 3 millisecondi di corrente invertita a una velocità di stimolazione di 30 battiti al minuto o bpm, quindi controllare gli indicatori degli elettrodi del software e verificare che gli elettrodi delle camere di coltivazione funzionino correttamente. Usando una pinzetta, separare l'agarosio dal tessuto. Evitare di toccare il tessuto e maneggiarlo con attenzione poiché qualsiasi danno al tessuto ridurrà il tasso di successo della coltivazione.Per attaccare due triangoli di plastica a un campione, posizionare 1 microlitro di colla su un coperchio sterile della capsula di Petri. Usa una pinzetta agganciata per raccogliere un triangolo di plastica autoclavato. Immergere rapidamente il bordo anteriore del triangolo nella colla e incollare il triangolo sul campione perpendicolare all'allineamento dei cardiomiociti.Ripetere l'operazione per l'altro triangolo. Usando un bisturi, tagliare il tessuto che supera la larghezza del triangolo e posizionare la fetta con i due triangoli montati nel vassoio di taglio contenente il tampone di affettatura. Rimuovere la camera di coltivazione a riempimento medio dall'incubatore.Selezionare una fetta preparata e inserirla nella camera collegando un triangolo a ciascun perno. Regolare la distanza tra i pin di montaggio in base alle dimensioni del campione. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo.Dopo aver posizionato la parabola sul bilanciere, diminuire il precarico ruotando la vite di regolazione in senso antiorario fino a quando la linea di base del grafico corrispondente sullo schermo del computer non cambia più, quindi aumentare attentamente il precarico o la tensione ruotando la vite di regolazione in senso orario. Per le camere con elevata rigidità, continuare fino a quando la linea di base corrispondente nel grafico non è aumentata da 1.000 a 1.200 unità corrispondenti a un precarico di millinewton. Dopo aver preparato il terreno di coltivazione fresco, preriscaldare il mezzo a bagnomaria o in un incubatore ad aria calda a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti.Rimuovere il mezzo dalla camera, lasciando circa 0,8 millilitri nella camera, quindi aggiungere 1,6 millilitri di mezzo fresco alla stessa camera, per un volume totale di mezzo a 2,4 millilitri per camera. Infine, posizionare il coperchio della camera indietro e posizionare la camera di coltivazione nella rispettiva posizione. La lettura della contrazione di cinque fette miocardiche durante una stimolazione tipica consisteva in quattro sezioni distinte di potenziamento post-pausa, soglia di stimolazione, relazione forza-frequenza e periodo refrattario.Rispetto al controllo, la forza di contrazione delle fette trattate con calcio antagonisti, nifedipina e calciseptina, è diminuita entro 10 minuti. Al contrario, l'agonista del canale del calcio voltaggio-dipendente, Bay-K8644, ha aumentato la forza di contrazione. Il potenziamento post-pausa delle fette di controllo e trattate è stato valutato per il rilascio intracellulare di calcio dal reticolo sarcoplasmatico.La sezione di controllo non ha mostrato alcuna modifica. In presenza di calciseptina e nifedipina, l'inibizione dei canali del calcio di tipo L ha portato al potenziamento della prima contrazione dopo una pausa di 50 secondi, riflettendo un maggiore contributo relativo del rilascio intracellulare di calcio alla contrattilità totale. L'effetto opposto è stato osservato con Bay-K8644, che stimola l'ingresso del calcio extracellulare attraverso i canali del calcio di tipo L.Nell'analisi della relazione forza-frequenza, non è stato osservato alcun cambiamento nella fetta di controllo. Il trattamento con calciseptina non ha modificato la capacità della fetta di seguire gli stimoli in caso di aumento della frequenza di stimolazione quando si confrontano i dati pre e post-trattamento. Rispetto alla calciseptina, la nifedipina ha impedito un aumento della contrattilità a velocità di stimolazione più elevate e ha ridotto la velocità massima di cattura a 80 bpm.Con Bay-K8644, è stato osservato un aumento della forza di contrazione a frequenze di stimolazione molto basse. Tuttavia, a frequenze superiori a 50 bpm, la forza di contrazione era inferiore rispetto alla condizione di pre-trattamento. Il tessuto asportato deve essere rapidamente trasferito a 4 gradi cardioplegia.Dopo l'affettamento, i triangoli di plastica devono essere attaccati perpendicolarmente alla direzione della fibra. Il precarico non deve superare i 1500 millinewton. La coltura a fette biomimetiche può aiutare i ricercatori a utilizzare manipolazioni genetiche e terapie cellulari per studiare la rigenerazione e la riparazione nel miocardio umano adulto.

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Preparazione del tessuto corneale dei donatori per Keratoplasty Endothelial

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Ricerca

Medicina

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

A lungo termine cateterizzazione della intestinale linfa Tronco e Raccolta della linfa in neonatali Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

Posizionamento chirurgico di cateteri per durata Esercizio cardiovascolare test in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. Indeed, research focusing on the discovery of new potential therapeutic targets using genetically altered mice requires a reliable, long-term assessment of the systemic arterial pressure variation. Currently, the gold standard for obtaining long-term measurements of blood pressure in ambulatory mice uses implantable radio-transmitters, which require&#160;artery cannulation. This technique eliminates the need for tethering, restraining, or anesthetizing the animals which introduce stress and artifacts during data sampling. However, arterial blood pressure monitoring in mice via catheterization can be rather challenging due to the small size of the arteries. Here we present a step-by-step guide to illustrate the crucial key passages for a successful subcutaneous implantation of radio-transmitters and carotid artery cannulation in mice. We also include examples of long-term blood pressure activity taken from freely moving mice after a period of post-surgery recovery. Following this procedure will allow reliable direct blood pressure recordings from multiple animals simultaneously.

The goal of this protocol is to assess systemic blood pressure in conscious freely moving mice using implantable radio-telemetry devices.

Misurazione della pressione sanguigna a lungo termine in topi liberi di muoversi utilizzando la telemetria

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-cuore Analisi tessuto miocardico

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

Miglioramento di un modello di infarto miocardico porcina cassa chiusa tramite la normalizzazione del tessuto e le procedure di campionamento di sangue

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analisi delle registrazioni elettrocardiografiche a lungo termine per rilevare le aritmie nei topi

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).