Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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La ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch per il loro supporto nella preparazione degli allestimenti, nonché per il regolare mantenimento della coltivazione dei tessuti.

La raccolta di tessuti per gli esperimenti qui descritti è stata approvata dai comitati di revisione istituzionale dell'Università di Monaco e dell'Università della Ruhr di Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.
1. Acquisizione tissutale
<ol><li>Ottenere tessuto umano da pazienti sottoposti a trapianto di cuore o cardiochirurgia...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all'ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l'applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzar...

Nell'ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all'uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci 1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci 4,5,6. L'uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei risultati. La coltivazione 3D a lungo termine di tessuti miocardici con geometria intatta, tuttavia, non è ben consolidata. La geometria intatta è una caratteristica chiave per imitare le condizioni in vivo, poiché la corretta funzione cardiaca, la comunicazione tra cellule diverse e le interazioni cellula-matrice sono prerequisiti. La coltivazione del tessuto miocardico ha attraversato varie fasi di sviluppo. Il tasso di successo e la stabilità della coltivazione di tessuti miocardici ex vivo erano inizialmente piuttosto bassi, ma gli approcci recenti hanno prodotto risultati promettenti 7,8,9,10,11.
Tra questi, Fischer et al. sono stati i primi a dimostrare che la vitalità e le prestazioni contrattili del tessuto miocardico umano possono essere mantenute nella coltivazione cellulare ex vivo per molte settimane7. La loro tecnica si basava su sottili fette di tessuto tagliate dal miocardio umano espiantato, che erano montate in camere di coltivazione di nuova concezione che fornivano condizioni biomeccaniche definite e stimolazione elettrica continua. Questo metodo di coltivazione assomiglia molto alla funzione in vivo del tessuto miocardico ed è stato riprodotto da diversi gruppi di ricerca indipendenti 2,12,13,14,15. È importante sottolineare che le camere utilizzate da Fischer et al. hanno anche permesso la registrazione continua delle forze sviluppate per un massimo di 4 mesi, aprendo così opportunità senza precedenti per la ricerca fisiologica e farmacologica sul miocardio umano intatto7.
Tecniche simili sono state sviluppate indipendentemente da altri gruppi e applicate al miocardio umano, di ratto, suino e di coniglio 7,10,11. Pitoulis et al. hanno successivamente sviluppato un metodo più fisiologico, che riproduce la normale relazione forza-lunghezza durante un ciclo di contrazione, ma è meno adatto per l'analisi ad alto rendimento16. In quanto tale, l'approccio generale della coltivazione biomimetica può essere considerato come un ulteriore passo verso la riduzione, l'affinamento e la sostituzione (3R) degli esperimenti sugli animali.
Tuttavia, lo sfruttamento di questo potenziale richiede procedure standardizzate, analisi ad alto contenuto e un elevato livello di throughput. Presentiamo una tecnica che combina l'affettamento automatizzato del miocardio umano vivente con il mantenimento in vitro in un sistema di coltivazione biomimetico che è diventato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Con l'approccio proposto, il numero di singole fette che possono essere generate da un singolo campione miocardico transmurale è limitato solo dal tempo di elaborazione. Un campione di dimensioni e qualità sufficienti (3 cm x 3 cm) produce spesso 20-40 fette di tessuto che vengono comodamente tagliate con un vibratoma automatizzato. Queste fette possono essere collocate in camere di coltivazione appartenenti al sistema. Le camere consentono la stimolazione elettrica, i cui parametri possono essere modulati (cioè durata dell'impulso, polarità, velocità e corrente), nonché la regolazione del pre- e postcarico, utilizzando fili a molla all'interno delle camere. La contrazione di ogni fetta è registrata dal movimento di un piccolo magnete attaccato a un filo a molla e visualizzato come un grafico interpretabile. I dati possono essere registrati in ogni momento e analizzati utilizzando un software disponibile gratuitamente. Oltre alla stimolazione costante al basale, è possibile eseguire protocolli programmati per valutare funzionalmente il loro periodo refrattario, la soglia di stimolazione, il potenziamento post-pausa e la relazione forza-frequenza.
Questa coltivazione biomimetica a lungo termine di più fette miocardiche da un singolo cuore apre la strada a future ricerche ex vivo sia nel tessuto umano che in quello animale e facilita lo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci nella medicina cardiovascolare. È già stato applicato a vari approcci sperimentali 2,12,13,15. Qui, forniamo una descrizione dettagliata passo-passo della preparazione del tessuto umano e forniamo soluzioni per i problemi di coltivazione frequentemente incontrati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall'utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un'impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.
Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.

La contrazione delle fette miocardiche è stata visualizzata sullo schermo del computer dopo l'inserimento della camera di coltivazione nel connettore corrispondente (Figura 3). La contrazione delle fette miocardiche umane è iniziata immediatamente dopo la stimolazione. Le fette ipercontrastratte per 5-10 min. Ciò era visibile come un aumento delle forze diastoliche, causato da una contrattura tonica delle frazioni tissutali danneggiate. Questo processo è stato ripristinato a vari livelli...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un'analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l'applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l'ambiente fisiologico in vivo .

Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Utilizzando questo protocollo, le fette di tessuto ventricolare sinistro umano possono essere coltivate ex vivo in una camera biomimetica. L'applicazione di pre e postcarico migliora la somiglianza dell'ambiente fisiologico. Questa tecnica consente la registrazione continua della contrazione tissutale.I protocolli di stimolazione definiti dall'utente consentono la valutazione dei parametri di contrazione vitale come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. La coltivazione a lungo termine di fette miocardiche, utilizzando questa configurazione, aprirà la strada alla futura ricerca ex vivo, facilitando questo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci in medicina cardiovascolare. Per iniziare, immergere le camere di coltivazione e gli elettrodi di grafite in un litro di una soluzione di isopropanolo al 10% e agitare durante la notte.Il giorno seguente, trasferire le camere in una soluzione di isopropanolo al 100% per 3 minuti, quindi lasciare asciugare all'aria le camere e gli elettrodi di grafite sotto una cappa a flusso laminare. Collegare un circuito stampato a ciascuna camera in base alle posizioni disponibili sul bilanciere. Posizionare due elettrodi di grafite sul circuito stampato secondo le istruzioni del produttore, quindi posizionare un coperchio della capsula di Petri da 35 millimetri sulla camera per prevenire l'infezione.Quindi, riempire il vassoio di taglio fino al 90-95% con tampone di affettatura. Trasferire il campione di tessuto in una capsula di Petri da 100 millimetri riempita con tampone di affettatura a freddo e posizionare la piastra su una piastra di raffreddamento a 4 gradi Celsius. Rimuovere le trabecole endocardiche tenendo l'endocardio con una pinzetta, quindi utilizzare le forbici per tagliare via circa 3 millimetri di tessuto endocardico.Fissare il campione di tessuto tagliato, lato endocardico fino a un cerotto di gomma di 2 per 2 centimetri utilizzando quattro aghi da 0,9 per 70 millimetri calibro 20 che sono fissati in posizione quadrata. Assicurarsi che il bordo diagonale di ciascuna punta dell'ago sia rivolto verso l'interno, migliorando la fissazione e prevenendo danni al miocardio. Usando un bisturi, tagliare via tutto il tessuto in eccesso al di fuori dei quattro quadrati dell'ago.Usando una pinzetta, posizionare il campione tagliato su un pezzo di tessuto sterile per 10 secondi per rimuovere il tampone di affettamento in eccesso. Quindi, rimuovere la siringa di agarosio dal bagno d'acqua e immergere il campione in agarosio. Lasciare solidificare l'agarosio per cinque minuti su una piastra di raffreddamento.Il lato endocardico del campione deve essere visibile nell'agarosio. Usando una pinzetta, posizionare il lato epicardico del campione contenuto nell'agarosio sopra l'area incollata, quindi premere delicatamente il campione contenente agarosio dall'alto con uno strumento smussato senza tagliare o danneggiare l'agarosio. Lasciare solidificare la colla per 1 minuto.Impostare l'ampiezza della vibrazione su 1 millimetro, la velocità di taglio iniziale a 0,07 millimetri al secondo e lo spessore della fetta a 300 micron. Dopo aver collegato il sistema di coltivazione a un computer, avviare il programma software corrispondente. Impostare la velocità del bilanciere a 60 giri/min e preimpostare i parametri di stimolazione.Per le fette cardiache umane, impostare la stimolazione standard su impulsi bifasici con 50 milliampere o corrente costituiti da corrente positiva di 3 millisecondi, pausa di 1 millisecondo e un impulso di 3 millisecondi di corrente invertita a una velocità di stimolazione di 30 battiti al minuto o bpm, quindi controllare gli indicatori degli elettrodi del software e verificare che gli elettrodi delle camere di coltivazione funzionino correttamente. Usando una pinzetta, separare l'agarosio dal tessuto. Evitare di toccare il tessuto e maneggiarlo con attenzione poiché qualsiasi danno al tessuto ridurrà il tasso di successo della coltivazione.Per attaccare due triangoli di plastica a un campione, posizionare 1 microlitro di colla su un coperchio sterile della capsula di Petri. Usa una pinzetta agganciata per raccogliere un triangolo di plastica autoclavato. Immergere rapidamente il bordo anteriore del triangolo nella colla e incollare il triangolo sul campione perpendicolare all'allineamento dei cardiomiociti.Ripetere l'operazione per l'altro triangolo. Usando un bisturi, tagliare il tessuto che supera la larghezza del triangolo e posizionare la fetta con i due triangoli montati nel vassoio di taglio contenente il tampone di affettatura. Rimuovere la camera di coltivazione a riempimento medio dall'incubatore.Selezionare una fetta preparata e inserirla nella camera collegando un triangolo a ciascun perno. Regolare la distanza tra i pin di montaggio in base alle dimensioni del campione. Assicurarsi che il campione sia immerso nel mezzo.Dopo aver posizionato la parabola sul bilanciere, diminuire il precarico ruotando la vite di regolazione in senso antiorario fino a quando la linea di base del grafico corrispondente sullo schermo del computer non cambia più, quindi aumentare attentamente il precarico o la tensione ruotando la vite di regolazione in senso orario. Per le camere con elevata rigidità, continuare fino a quando la linea di base corrispondente nel grafico non è aumentata da 1.000 a 1.200 unità corrispondenti a un precarico di millinewton. Dopo aver preparato il terreno di coltivazione fresco, preriscaldare il mezzo a bagnomaria o in un incubatore ad aria calda a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti.Rimuovere il mezzo dalla camera, lasciando circa 0,8 millilitri nella camera, quindi aggiungere 1,6 millilitri di mezzo fresco alla stessa camera, per un volume totale di mezzo a 2,4 millilitri per camera. Infine, posizionare il coperchio della camera indietro e posizionare la camera di coltivazione nella rispettiva posizione. La lettura della contrazione di cinque fette miocardiche durante una stimolazione tipica consisteva in quattro sezioni distinte di potenziamento post-pausa, soglia di stimolazione, relazione forza-frequenza e periodo refrattario.Rispetto al controllo, la forza di contrazione delle fette trattate con calcio antagonisti, nifedipina e calciseptina, è diminuita entro 10 minuti. Al contrario, l'agonista del canale del calcio voltaggio-dipendente, Bay-K8644, ha aumentato la forza di contrazione. Il potenziamento post-pausa delle fette di controllo e trattate è stato valutato per il rilascio intracellulare di calcio dal reticolo sarcoplasmatico.La sezione di controllo non ha mostrato alcuna modifica. In presenza di calciseptina e nifedipina, l'inibizione dei canali del calcio di tipo L ha portato al potenziamento della prima contrazione dopo una pausa di 50 secondi, riflettendo un maggiore contributo relativo del rilascio intracellulare di calcio alla contrattilità totale. L'effetto opposto è stato osservato con Bay-K8644, che stimola l'ingresso del calcio extracellulare attraverso i canali del calcio di tipo L.Nell'analisi della relazione forza-frequenza, non è stato osservato alcun cambiamento nella fetta di controllo. Il trattamento con calciseptina non ha modificato la capacità della fetta di seguire gli stimoli in caso di aumento della frequenza di stimolazione quando si confrontano i dati pre e post-trattamento. Rispetto alla calciseptina, la nifedipina ha impedito un aumento della contrattilità a velocità di stimolazione più elevate e ha ridotto la velocità massima di cattura a 80 bpm.Con Bay-K8644, è stato osservato un aumento della forza di contrazione a frequenze di stimolazione molto basse. Tuttavia, a frequenze superiori a 50 bpm, la forza di contrazione era inferiore rispetto alla condizione di pre-trattamento. Il tessuto asportato deve essere rapidamente trasferito a 4 gradi cardioplegia.Dopo l'affettamento, i triangoli di plastica devono essere attaccati perpendicolarmente alla direzione della fibra. Il precarico non deve superare i 1500 millinewton. La coltura a fette biomimetiche può aiutare i ricercatori a utilizzare manipolazioni genetiche e terapie cellulari per studiare la rigenerazione e la riparazione nel miocardio umano adulto.

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