Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
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연구는 DZHK 보조금 81Z0600207 (JH, PS 및 DM) 및 81X2600253 (AD 및 TS)이 자금을 지원했습니다.
저자들은 Claudia Fahney, Mei-Ping Wu 및 Matthias Semisch에게 셋업 준비와 조직 재배의 정기적 인 유지 보수에 대한 지원에 감사드립니다.

여기에 설명 된 실험을위한 조직 수집은 뮌헨 대학 (University of Munich)과 루르 대학 보훔 (Ruhr-University Bochum)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았다. 연구는 헬싱키 선언 지침에 따라 수행되었습니다. 환자들은 조직 수집 전에 서면 정보에 입각 한 동의를했습니다.
1. 조직 획득
<ol><li>심장 이식 또는 심장 수술을받는 환자로부터 인간 조직을 얻습...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

과거에는 심혈관 연구가 심근 세포 배양에 큰 발전을 이루었습니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 세포의 3D 배양은 아직 잘 확립되지 않았습니다. 심근 조직의 생체 외 배양에 적용된 이전의 프로토콜과 비교하여, 우리가 여기서 기술한 프로토콜은 조직의 생체내 환경과 더 밀접하게 닮았다. 또한, 사전 및 후부하의 적용은 더 많은 생체 모방 환경을 허용합니다. 우리는 ...

지난 10년 동안, 심근 세포의 시험관내 배양은 2D 및 3차원(3D) 기술에서부터 심장 심근세포 1,2,3으로 분화된 오가노이드 및 유도만능 줄기 세포의 사용에 이르기까지 큰 발전을 이루었다. Ex vivo 및 일차 세포 배양은 특히 유전 연구 및 약물 개발 4,5,6에 큰 가치를 지닌다. 인간 조직을 사용하면 결과의 번역 값이 향상됩니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 조직의 장기적인 3D 배양은 잘 확립되어 있지 않습니다. 손상되지 않은 기하학은 적절한 심장 기능, 다른 세포 간의 의사 소통 및 세포 - 매트릭스 상호 작용이 전제 조건이기 때문에 생체 내 조건을 모방하는 핵심 기능입니다. 심근 조직 재배는 다양한 발달 단계를 거쳤습니다. 생체외 심근 조직 배양의 성공률과 안정성은 처음에는 상당히 낮았지만, 최근의 접근법은 유망한 결과 7,8,9,10,11을 산출했다.
그 중에서도, Fischer 등은 인간 심근 조직의 생존력 및 수축성 성능이수년 7주 동안 생체외 세포 배양에서 유지될 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 그들의 기술은 외래 된 인간 심근에서 절단 된 얇은 조직 조각을 기반으로했으며, 이는 정의 된 생체 역학 조건과 지속적인 전기 자극을 제공하는 새로 개발 된 재배 챔버에 장착되었습니다. 이 배양 방법은 심근 조직의 생체 내 기능과 매우 유사하며 여러 독립적 인 연구 그룹2,12,13,14,15에 의해 재현되었습니다. 중요하게도, Fischer et al.이 사용하는 챔버는 또한 최대 4 개월 동안 개발 된 힘의 지속적인 등록을 가능하게하여 손상되지 않은 인간 심근에 대한 생리 학적 및 약리학 적 연구를위한 전례없는 기회를 열었습니다7.
유사한 기술이 다른 그룹에 의해 독립적으로 개발되어 인간, 래트, 돼지 및 토끼 심근7,10,11에 적용되었다. Pitoulis et al.은 수축 사이클 동안 정상적인 힘-길이 관계를 재현하는 보다 생리학적인 방법을 개발했지만, 고처리량 분석(16)에는 덜 적합하다. 이와 같이, 생체모방 재배의 일반적인 접근법은 동물 실험의 감소, 정제 및 대체(3R)를 위한 추가의 단계로 간주될 수 있다.
그러나 이러한 잠재력을 활용하려면 표준화된 절차, 높은 콘텐츠 분석 및 높은 처리량 수준이 필요합니다. 우리는 상용화 된 생체 모방 재배 시스템에서 살아있는 인간 심근의 자동화 된 슬라이싱과 시험관 내 유지 보수를 결합한 기술을 제시합니다 ( 재료 표 참조). 제안된 접근법으로, 단일 경막 심근 표본으로부터 생성될 수 있는 개별 슬라이스의 수는 처리 시간에 의해서만 제한된다. 충분한 크기와 품질 (3cm x 3cm)의 표본은 종종 자동화 된 vibratome으로 편리하게 절단되는 20-40 개의 조직 조각을 산출합니다. 이들 슬라이스는 시스템에 속하는 재배 챔버에 배치될 수 있다. 챔버는 전기 자극을 허용하며, 그 파라미터는 변조 될 수 있습니다 (즉, 펄스 지속 시간, 극성, 속도 및 전류), 챔버 내부의 스프링 와이어를 사용하여 사전 및 후부하의 조정. 각 슬라이스의 수축은 스프링 와이어에 부착 된 작은 자석의 움직임으로부터 등록되고 해석 가능한 그래프로 표시됩니다. 데이터는 항상 기록되고 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 일정한 기준선 페이싱을 제외하고, 스케줄링된 프로토콜은 그들의 내화 기간, 자극 임계치, 포스트-일시정지-강화 및 힘-주파수 관계를 기능적으로 평가하기 위해 수행될 수 있다.
개별 심장에서 여러 심근 절편의 이러한 장기간의 생체 모방 배양은 인간과 동물 조직 모두에서 미래의 생체 외 연구를위한 길을 열어주고 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한 스크리닝을 용이하게합니다. 이미 다양한 실험적 접근법 2,12,13,15에 적용되었다. 여기에서는 인간 조직 준비에 대한 자세한 단계별 설명을 제공하고 자주 발생하는 재배 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

심근세포 배양은 2차원(2D) 세포 배양에서 iPSC 유래 오가노이드에 이르기까지 방대한 수의 발전을 이뤘다. 2019 년에는 심근 수축의 생체 내 상태에 접근하면서 인간 심장 샘플에서 얻은 심근 절편을 배양하는 생체 외 방법이 입증되었습니다. 이 샘플은 주로 심장 이식 또는 좌심실 보조 장치 배치에서 비롯됩니다. 비브라톰과 특별히 개발된 재배 시스템을 사용하여 300μm 두께의 슬라이스를 고정된 와이어와 스프링 와이어 사이에 배치하여 몇 주 동안 안정적이고 재현 가능한 재배가 가능합니다. 재배하는 동안 조각은 개별 설정에 따라 지속적으로 자극됩니다. 수축은 실시간으로 표시되고 기록 될 수 있으며 약리학 적 제제를 쉽게 적용 할 수 있습니다. 사용자-정의된 자극 프로토콜은 일시정지-강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터를 평가하기 위해 스케줄링되고 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 시스템은 보다 생리학적 재배를 위한 가변 사전-후 하중 설정을 가능하게 한다.
여기에서, 우리는 상업적 생체 모방 재배 용액을 사용하여 인간 좌심실 심근 절편의 성공적인 장기 배양을 생성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제시합니다.

심근 조각의 수축은 재배 챔버를 해당 커넥터에 삽입 한 후 컴퓨터 화면에 표시되었습니다 (그림 3). 인간 심근 조각의 수축은 자극 즉시 시작되었습니다. 조각은 5-10 분 동안 과도하게 수축되었습니다. 이것은 손상된 조직 분획의 강장제 수축으로 인한 이완기 힘의 증가로 나타났습니다. 이 과정은 1-1.5 h 내에서 다양한 정도로 되돌렸다. 안정화 후, 인간 LV 조직 절편은 자극?...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

이 프로토콜을 사용하여, 인간 좌심실 조직 절편은 생체모방 챔버에서 생체외 배양될 수 있다. 사전 및 후부하의 적용은 생리 환경의 유사성을 향상시킵니다. 이 기술은 조직 수축의 지속적인 등록을 허용합니다.사용자 정의 자극 프로토콜은 일시정지 후 강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터의 평가를 허용한다. 이 설정을 사용하여 심근 조각의 장기간 재배는 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한이 스크리닝을 용이하게하여 향후 생체 외 연구를위한 길을 열어 줄 것입니다. 시작하려면 배양 챔버와 흑연 전극을 10 % 이소프로판올 용액 1 리터에 담그고 밤새 교반하십시오.다음날 챔버를 100 % 이소프로판올 용액으로 3 분 동안 옮긴 다음 챔버 및 흑연 전극을 층류 후드 하에서 공기 건조시킵니다. 로커의 사용 가능한 위치에 따라 회로 기판을 각 챔버에 부착하십시오. 제조업체의 지침에 따라 회로 기판에 두 개의 흑연 전극을 놓은 다음 감염을 예방하기 위해 챔버에 35mm 페트리 접시 뚜껑을 놓습니다.그런 다음 절단 트레이를 슬라이싱 버퍼로 최대 90 ~ 95 %까지 채 웁니다. 조직 샘플을 차가운 슬라이싱 버퍼로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시에 옮기고 접시를 섭씨 4도의 냉각 플레이트에 놓습니다. 핀셋으로 심내막을 잡고 심내막 섬유주를 제거한 다음 가위를 사용하여 약 3mm의 심내막 조직을 잘라냅니다.절단된 조직 샘플, 심내막 측면을 정사각형 위치에 고정된 네 개의 0.9x70밀리미터 20게이지 바늘을 사용하여 2x2센티미터 고무 패치까지 고정시킨다. 각 바늘 팁의 대각선 가장자리가 안쪽을 향하고 있는지 확인하여 고정력을 강화하고 심근 손상을 방지하십시오. 메스를 사용하여 네 개의 바늘 사각형 외부의 모든 과도한 조직을 잘라냅니다.핀셋을 사용하여 트리밍된 샘플을 멸균된 조직 조각에 10초 동안 올려 놓고 과도한 슬라이싱 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 수조에서 아가로스 주사기를 제거하고 샘플을 아가로스에 침수시킨다. 아가로스를 냉각판에서 다섯 분 동안 응고시키십시오.샘플의 심내막 측면은 아가로스에서 볼 수 있어야합니다. 핀셋을 사용하여 아가로스에 포함 된 샘플의 심외경면을 접착 된 부위 위에 놓은 다음 아가로스를 자르거나 손상시키지 않고 무딘 도구로 상단에서 아가로스 함유 샘플을 부드럽게 누릅니다. 접착제가 1 분 동안 굳어지게하십시오.진동 진폭을 1mm로, 초기 절삭 속도를 초당 0.07mm로, 슬라이스 두께를 300미크론으로 설정합니다. 재배 시스템을 컴퓨터에 연결 한 후 해당 소프트웨어 프로그램을 시작하십시오. 로커 속도를 60rpm으로 설정하고 자극 매개 변수를 미리 설정합니다.인간의 심장 조각의 경우, 표준 자극을 50 밀리암페어 또는 3 밀리 초 양의 전류, 1 밀리 초 일시 중지 및 분당 30 비트 또는 bpm의 간격 속도로 반전 전류의 3 밀리 초 펄스로 구성된 이단계 임펄스로 설정 한 다음 소프트웨어의 전극 표시기를 확인하고 재배 챔버의 전극이 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 핀셋을 사용하여 아가로스를 조직에서 분리하십시오. 조직을 만지지 말고 조직의 손상이 배양의 성공률을 떨어 뜨릴 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오.두 개의 플라스틱 삼각형을 샘플에 부착하려면 멸균 된 Petri 접시 뚜껑에 1 마이크로 리터의 접착제를 놓습니다. 후크 핀셋을 사용하여 오토클레이브 플라스틱 삼각형 하나를 집어 들으십시오. 삼각형의 앞 가장자리를 접착제에 빠르게 담그고 삼각형을 심근 세포 정렬에 수직인 샘플에 붙여 넣으십시오.다른 삼각형에 대해 반복합니다. 메스를 사용하여 삼각형 너비를 초과하는 조직을 트리밍하고 두 개의 장착된 삼각형이 있는 슬라이스를 슬라이스 버퍼가 있는 절단 트레이에 다시 놓습니다. 배지가 채워진 배양 챔버를 인큐베이터로부터 제거한다.준비된 슬라이스 하나를 선택하고 각 핀에 삼각형 하나를 연결하여 챔버에 삽입합니다. 장착 핀 사이의 거리를 샘플 크기로 조정합니다. 샘플이 배지에 잠겨 있는지 확인하십시오.접시를 로커에 놓은 후 컴퓨터 화면의 해당 그래프의 기준선이 더 이상 변경되지 않을 때까지 조정 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 프리로드를 줄인 다음 조정 나사를 시계 방향으로 돌려 프리로드 또는 장력을 조심스럽게 높입니다. 강성이 높은 챔버의 경우, 그래프의 해당 기준선이 1밀리뉴턴 프리로드에 해당하는 1, 000 ~ 1, 200 단위만큼 증가할 때까지 계속하십시오. 신선한 재배 배지를 준비한 후, 배지를 섭씨 37도의 수조 또는 열풍 배양기에서 30 내지 45분 동안 미리 가온한다.챔버에서 매체를 제거하고 챔버에 약 0.8 밀리리터를 남긴 다음 동일한 챔버에 1.6 밀리리터의 신선한 배지를 추가하여 챔버 당 2.4 밀리리터의 총 부피를 만듭니다. 마지막으로, 챔버의 덮개를 다시 놓고 재배 챔버를 각각의 위치에 놓습니다. 전형적인 자극 동안 다섯 개의 심근 슬라이스의 수축에 대한 판독은 일시 중지 후 강화, 자극 임계 값, 힘 - 주파수 관계 및 난치성 기간의 네 가지 별개의 섹션으로 구성되었습니다.대조군과 비교하여, 칼슘 길항제인 니페디핀 및 칼시셉틴으로 처리된 슬라이스의 수축력은 10분 이내에 감소하였다. 대조적으로, 전압-게이팅된 칼슘 채널 작용제인 Bay-K8644는 수축력을 증가시켰다. 대조군 및 처리된 슬라이스의 일시정지 후 강화를 사르코플라스마 망상체로부터의 세포내 칼슘 방출에 대해 평가하였다.컨트롤 조각에 변경 내용이 표시되지 않았습니다. 칼시셉틴과 니페디핀의 존재 하에서, L형 칼슘 채널의 억제는 50초의 정지 후 첫 번째 수축의 강화로 이어졌고, 이는 전체 수축성에 대한 세포내 칼슘 방출의 더 높은 상대적 기여를 반영한다. 반대 효과는 L형 칼슘 채널을 통해 세포외 칼슘의 진입을 자극하는 Bay-K8644에서 관찰되었다.힘-주파수 관계 분석에서, 제어 슬라이스에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 칼시셉틴 처리는 치료 전후 데이터를 비교할 때 자극 빈도의 증가시 자극을 따르는 슬라이스의 능력을 변화시키지 않았다. 칼시셉틴과 비교했을 때, 니페디핀은 더 높은 페이싱 속도에서 수축성의 증가를 방지하고 80bpm에서 최대 포획률을 감소시켰다.Bay-K8644에서는 매우 낮은 자극 주파수에서 수축력 증가가 관찰되었습니다. 그러나, 50 bpm보다 높은 주파수에서, 수축력은 전처리 조건에서보다 낮았다. 적출 된 조직은 4 도의 심장 흉막으로 신속하게 옮겨야합니다.슬라이스 후 플라스틱 삼각형은 섬유 방향에 수직으로 부착되어야합니다. 프리로드는 1500밀리뉴턴을 초과해서는 안 됩니다. 생체 모방 슬라이스 배양은 연구자가 성인 인간 심근의 재생 및 복구를 연구하기위한 세포 기반 치료법뿐만 아니라 유전자 조작을 활용하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

내피 Keratoplasty을위한 각막 기증자 조직 준비

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

연구

의학

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

번역 상 암 연구를위한 인체 조직에 대한 작업

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

신생아 돼지에서 림프의 창자 림프 트렁크와 컬렉션의 장기 도관

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

돼지의 장기 심장 혈관 운동 테스트를위한 카테터의 외과 배치

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

텔레 메 트리를 사용하여 자유롭게 이동 마우스의 장기 혈압 측정

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

3D 전체 심장 심근 조직 분석

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

조직 및 혈액 샘플링 절차의 표준화에 의해 닫힌된 가슴 돼지 심근 경색 모델의 개선

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

마우스의 부정맥을 감지하기 위한 장기 심전도 기록 분석

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...