Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Forskning ble finansiert av DZHK-tilskudd 81Z0600207 (JH, PS og DM) og 81X2600253 (AD og TS).
Forfatterne vil gjerne takke Claudia Fahney, Mei-Ping Wu og Matthias Semisch for deres støtte til å forberede oppsettene, samt for regelmessig vedlikehold av vevsdyrkingen.

Vevssamling for eksperimentene beskrevet her ble godkjent av Institutional Review Boards ved Universitetet i München og Ruhr-Universitetet Bochum. Studier ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonens retningslinjer. Pasientene ga skriftlig informert samtykke før vevsinnsamling.
1. Oppkjøp av vev
<ol><li>Få menneskelig vev fra pasienter som gjennomgår hjertetransplantasjon eller hjertekirurgi.</li>
	<li>Før du anskaffer vevet, klargjør du 2 liter kardioplegisk løs...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

Tidligere har kardiovaskulær forskning gjort store fremskritt i dyrking av kardiomyocytter. Imidlertid er 3D-dyrking av kardiomyocytter med intakt geometri ennå ikke godt etablert. Sammenlignet med tidligere protokoller anvendt for ex vivo dyrking av myokardvev, ligner protokollen som vi beskrev her vevets in vivo-miljø nærmere. Videre gir anvendelsen av for- og etterbelastning et mer biomimetisk miljø. Vi er i stand til fullt ut å analysere og forstå kontinuerlig registrering av kontraksjonsdata...

I løpet av det siste tiåret har in vitro dyrking av myokardceller gjort store fremskritt, alt fra 2D og tredimensjonale (3D) teknikker til bruk av organoider og induserte pluripotente stamceller differensiert til hjertemyocytter 1,2,3. Ex vivo og primærcelledyrking har vist seg å være av stor verdi, spesielt for genetiske studier og legemiddelutvikling 4,5,6. Bruk av menneskelig vev forbedrer translasjonsverdien av resultatene. Langsiktig 3D-dyrking av myokardvev med intakt geometri er imidlertid ikke godt etablert. Den intakte geometrien er en nøkkelfunksjon for å etterligne in vivo-forhold, da riktig hjertefunksjon, kommunikasjon mellom forskjellige celler, samt cellematrise-interaksjoner er forutsetninger. Dyrking av myokardvev gikk gjennom ulike faser av utviklingen. Suksessraten og stabiliteten til ex vivo myokardvevsdyrking var i utgangspunktet ganske lav, men nyere tilnærminger har gitt lovende resultater 7,8,9,10,11.
Blant disse var Fischer og medarbeidere de første som demonstrerte at levedyktighet og kontraktil ytelse av humant myokardvev kan opprettholdes i ex vivo celledyrking i mange uker7. Deres teknikk var basert på tynne vevsskiver skåret fra eksplantert humant myokardium, som ble montert i nyutviklede dyrkingskamre som ga definerte biomekaniske forhold og kontinuerlig elektrisk stimulering. Denne kultiveringsmetoden ligner in vivo-funksjonen til myokardvev, og har blitt reprodusert av flere uavhengige forskningsgrupper 2,12,13,14,15. Det er viktig at kamrene som Fischer og medarbeidere brukte også muliggjorde kontinuerlig registrering av utviklede krefter i opptil 4 måneder, og dermed åpnet enestående muligheter for fysiologisk og farmakologisk forskning på intakt humant myokard7.
Lignende teknikker ble uavhengig utviklet av andre grupper og anvendt på mennesker, rotter, svin og kaninmyokard 7,10,11. Pitoulis og medarbeidere utviklet senere en mer fysiologisk metode, som reproduserer den normale kraftlengderelasjonen under en kontraksjonssyklus, men er mindre egnet for høy gjennomstrømningsanalyse16. Som sådan kan den generelle tilnærmingen til biomimetisk dyrking betraktes som et ytterligere skritt inn i reduksjon, raffinering og erstatning (3R) av dyreforsøk.
Utnyttelse av dette potensialet krever imidlertid standardiserte prosedyrer, analyser med høyt innhold og et høyt gjennomstrømningsnivå. Vi presenterer en teknikk som kombinerer automatisert kutting av levende humant myokardium med in vitro vedlikehold i et biomimetisk dyrkingssystem som har blitt kommersielt tilgjengelig (se Materialtabell). Med den foreslåtte tilnærmingen er antall individuelle skiver som kan genereres fra en enkelt transmural myokardprøve bare begrenset av behandlingstiden. Et eksemplar av tilstrekkelig størrelse og kvalitet (3 cm x 3 cm) gir ofte 20-40 vevsskiver som er beleilig kuttet med en automatisert vibratom. Disse skivene kan plasseres i dyrkingskamre som tilhører systemet. Kamrene tillater elektrisk stimulering, hvis parametere kan moduleres (dvs. pulsvarighet, polaritet, hastighet og strøm), samt justering av for- og etterbelastning ved hjelp av fjærledninger inne i kamrene. Sammentrekningen av hver skive registreres fra bevegelsen av en liten magnet festet til en fjærtråd og vises som en tolkbar graf. Data kan til enhver tid registreres og analyseres ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Bortsett fra den konstante baseline pacing, kan planlagte protokoller utføres for å funksjonelt vurdere deres ildfaste periode, stimuleringsterskel, post-pause-potensiering og kraftfrekvensforhold.
Denne langsiktige biomimetiske dyrkingen av flere myokardskiver fra et individuelt hjerte baner vei for fremtidig ex vivo-forskning i både menneskelig og animalsk vev, og letter screeningen for terapeutiske og kardiotoksiske legemiddeleffekter i kardiovaskulær medisin. Det har allerede blitt brukt på ulike eksperimentelle tilnærminger 2,12,13,15. Her gir vi en detaljert trinnvis beskrivelse av fremstillingen av menneskelig vev og gir løsninger for ofte oppståtte dyrkingsproblemer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Kardiomyocyttdyrking har sett et stort antall utviklinger, alt fra todimensjonal (2D) celledyrking til iPSC-avledede organoider. I 2019 ble det vist en ex vivo måte å dyrke myokardskiver oppnådd fra menneskelige hjerteprøver, mens de nærmet seg in vivo tilstand av myokardial sammentrekning. Disse prøvene stammer hovedsakelig fra hjertetransplantasjoner eller plasseringer av venstre ventrikkelhjelpemidler. Ved hjelp av en vibratom og et spesialutviklet dyrkingssystem plasseres 300 μm tykke skiver mellom en fast og en fjærtråd, noe som muliggjør stabil og reproduserbar dyrking i flere uker. Under dyrking stimuleres skivene kontinuerlig i henhold til individuelle innstillinger. Sammentrekninger kan vises og registreres i sanntid, og farmakologiske midler kan lett påføres. Brukerdefinerte stimuleringsprotokoller kan planlegges og utføres for å vurdere vitale kontraksjonsparametere som potensering etter pause, stimuleringsterskel, kraftfrekvensforhold og ildfast periode. Videre muliggjør systemet en variabel innstilling før og etter belastning for en mer fysiologisk dyrking.
Her presenterer vi en trinnvis veiledning om hvordan man genererer en vellykket langsiktig dyrking av menneskelige venstre ventrikulære myokardskiver, ved hjelp av en kommersiell biomimetisk dyrkingsløsning.

Sammentrekningen av myokardskivene ble vist på dataskjermen etter innsetting av dyrkingskammeret i den tilsvarende kontakten (figur 3). Sammentrekning av de menneskelige myokardskivene startet umiddelbart etter stimulering. Skivene hyperkontrakteres i 5-10 min. Dette var synlig som en økning av diastoliske krefter, forårsaket av en tonisk kontraktur av skadede vevsfraksjoner. Denne prosessen ble i varierende grad tilbakeført innen 1-1,5 time. Etter stabilisering viste humane LV-vevsskive...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Vi presenterer en protokoll for ex vivo dyrking av humant ventrikkel myokardvev. Det muliggjør detaljert analyse av kontraksjonskraft og kinetikk, samt anvendelse av pre- og etterbelastning for å etterligne det in vivo fysiologiske miljøet nærmere.

Forberedelse av humant myokardvev for langsiktig dyrking

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Ved hjelp av denne protokollen kan humane venstre ventrikulære vevsskiver dyrkes ex vivo i et biomimetisk kammer. Påføringen av pre- og afterloads forbedrer likheten til det fysiologiske miljøet. Denne teknikken tillater kontinuerlig registrering av vevskontraksjon.Brukerdefinerte stimuleringsprotokoller tillater vurdering av vitale kontraksjonsparametere som potensiering etter pause, stimuleringsterskel, kraftfrekvensforhold og ildfast periode. Den langsiktige dyrkingen av myokardskiver, ved hjelp av dette oppsettet, vil bane vei for fremtidig ex vivo-forskning, noe som letter denne screeningen for terapeutiske og kardiotoksiske legemiddeleffekter i kardiovaskulær medisin. For å begynne, senk dyrkingskamrene og grafittelektrodene i en liter av en 10% isopropanolløsning og omrør over natten.Neste dag, overfør kamrene til en 100% isopropanolløsning i 3 minutter, og la deretter kamrene og grafittelektrodene lufttørke under en laminær strømningshette. Fest et kretskort til hvert kammer i henhold til de tilgjengelige posisjonene på vippemaskinen. Plasser to grafittelektroder på kretskortet i henhold til produsentens instruksjoner, og plasser deretter et 35 millimeter petriskållokk på kammeret for å forhindre infeksjon.Deretter fyller du skjærebrettet opptil 90 til 95% med skivebuffer. Overfør vevsprøven til en 100 millimeter petriskål fylt med kald skivebuffer, og legg fatet på en kjøleplate ved 4 grader Celsius. Fjern endokardtrabeculae ved å holde endokardiet med pinsett, og bruk deretter saks til å kutte bort ca. 3 millimeter endokardvev.Fest den kuttede vevsprøven, endokardial side opp til en 2-til-2-centimeter gummiplaster ved hjelp av fire 0,9 x 70 millimeter 20-gauge nåler som er festet i en firkantet stilling. Forsikre deg om at den diagonale kanten av hver nålespiss peker innover, forbedrer fiksering og forhindrer skade på myokardiet. Bruk en skalpell til å skjære bort alt overflødig vev utenfor de fire nålefirkantene.Bruk pinsett til å plassere den trimmede prøven på et sterilt stykke vev i 10 sekunder for å fjerne overflødig skivebuffer. Fjern deretter agarosesprøyten fra vannbadet og senk prøven i agarose. La agarose størkne i fem minutter på en kjøleplate.Den endokardiale siden av prøven må være synlig i agarose. Bruk pinsett, plasser epikardiale siden av prøven inneholdt i agarose på toppen av det limte området, og trykk deretter forsiktig på den agaroseholdige prøven fra toppen med et stump verktøy uten å kutte eller skade agarose. La limet stivne i 1 minutt.Sett vibrasjonsamplituden til 1 millimeter, innledende skjærehastighet til 0,07 millimeter per sekund, og tykkelsen på skiven til 300 mikron. Etter å ha koblet dyrkingssystemet til en datamaskin, start det tilsvarende programmet. Sett vippehastigheten til 60 o / min og forhåndsinnstilt stimuleringsparametrene.For menneskelige hjerteskiver, sett standardstimuleringen til bifasiske impulser med 50 milliamper eller strøm bestående av 3 millisekunder positiv strøm, 1 millisekund pause og en 3 millisekund puls av invertert strøm med en pacing rate på 30 slag per minutt eller bpm, kontroller deretter elektrodeindikatorene til programvaren og kontroller at elektrodene i dyrkingskamrene fungerer som de skal. Bruk pinsett, skille agarose fra vevet. Unngå å berøre vevet og håndter det forsiktig, da eventuelle skader på vevet vil redusere suksessraten for dyrkingen.For å feste to plasttrekanter til en prøve, legg 1 mikroliter lim på et sterilt petriskållokk. Bruk en kroket pinsett for å plukke opp en autoklavert plasttrekant. Dypp raskt forkanten av trekanten i limet og lim trekanten på prøven vinkelrett på kardiomyocyttjusteringen.Gjenta for den andre trekanten. Bruk en skalpell, trim av vev som overskrider trekantbredden og legg skiven med de to monterte trekantene tilbake i skjærebrettet som inneholder skivebuffer. Fjern det middels fylte dyrkingskammeret fra inkubatoren.Velg en forberedt skive og sett den inn i kammeret ved å koble en trekant til hver pinne. Juster avstanden mellom monteringspinnene til prøvestørrelsen. Kontroller at prøven er nedsenket i mediet.Etter å ha plassert parabolen på vippemaskinen, reduser forspenningen ved å vri justeringsskruen mot klokken til grunnlinjen til den tilsvarende grafen på dataskjermen ikke endres lenger, og øk deretter forspenningen eller spenningen forsiktig ved å vri justeringsskruen med klokken. For kamre med høy stivhet, fortsett til den tilsvarende grunnlinjen i grafen har økt med 1.000 til 1.200 enheter tilsvarende en millinewton forspenning. Etter å ha tilberedt det friske dyrkingsmediet, forvarm mediet i et vannbad eller varmluftinkubator ved 37 grader Celsius i 30 til 45 minutter.Fjern medium fra kammeret, forlater ca 0,8 milliliter i kammeret, deretter legge 1,6 milliliter friskt medium til samme kammer, noe som gjør et totalt volum av medium til 2,4 milliliter per kammer. Til slutt plasserer du dekselet på kammeret tilbake og plasserer dyrkingskammeret i sin respektive posisjon. Avlesningen av sammentrekningen av fem myokardskiver under en typisk stimulering besto av fire forskjellige seksjoner av potensering etter pause, stimuleringsterskel, kraftfrekvensrelasjon og ildfast periode.Sammenlignet med kontroll ble kontraksjonskraften til skivene behandlet med kalsiumantagonister, nifedipin og kalsiseptin, redusert innen 10 minutter. I motsetning til dette økte den spenningsstyrte kalsiumkanalagonisten, Bay-K8644, sammentrekningskraften. Potenseringen av kontroll- og behandlede skiver etter pause ble vurdert for intracellulær kalsiumfrigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum.Kontrollstykket viste ingen endringer. I nærvær av kalsiseptin og nifedipin førte inhiberingen av L-type kalsiumkanaler til potensering av den første sammentrekningen etter en pause på 50 sekunder, noe som gjenspeiler et høyere relativt bidrag av intracellulær kalsiumfrigivelse til total kontraktilitet. Den motsatte effekten ble observert med Bay-K8644, som stimulerer innføringen av ekstracellulært kalsium via kalsiumkanalene av L-typen.I kraftfrekvensrelasjonsanalyse ble det ikke observert noen endring i kontrollskiven. Kalsiseptinbehandlingen endret ikke skjærets evne til å følge stimuliene ved en økning av stimuleringsfrekvensen ved sammenligning av data før og etter behandling. Sammenlignet med kalsiseptin forhindret nifedipin en økning i kontraktilitet ved høyere pacinghastigheter og reduserte maksimal fangstrate ved 80 bpm.Med Bay-K8644 ble det observert økt kontraksjonskraft ved svært lave stimuleringsfrekvenser. Ved frekvenser høyere enn 50 slag/minutt var imidlertid kontraksjonskraften lavere enn under tilstanden før behandling. Utskåret vev skal raskt overføres til 4 grader kardioplegi.Etter kutting må plast trekanter festes vinkelrett på fiberretningen. Forhåndsbelastningen bør ikke overstige 1500 millinewton. Biomimetisk skivekultur kan hjelpe forskere til å utnytte genetiske manipulasjoner samt cellebaserte terapier for å studere regenerering og reparasjon i voksen menneskelig myokard.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Corneal Donor Tissue Forberedelse til endotel keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Innkapsling Thermogenic preadipocytes for Transplantasjon inn fettvev depoter

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbeide med menneskelig vev for translasjonell kreftforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Long-Term Kateterisering av Intestinal Lymph Trunk og innkreving av lymfe i Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Kirurgisk Plassering av katetre for langsiktig kardiovaskulær trening Testing i Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Langsiktig blodtrykksmåling i fritt bevegelige Mus Bruke Telemetri

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

3D Whole-hjerte Hjerteinfarkt vevet analyse

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Forbedring av en lukket kiste svin hjerteinfarkt modell av standardisering av vev og blod utvalgstrekking

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Analysere langsiktige elektrokardiografiopptak for å oppdage arytmier hos mus

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Teknikk for å oppnå mesenkymal stamcelle fra fettvev og stromal vaskulær fraksjonskarakterisering ved langvarig kryopreservering

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...