Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

A pesquisa foi financiada por bolsas DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Os autores gostariam de agradecer Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch pelo apoio na preparação das configurações, bem como pela manutenção regular do cultivo de tecidos.

A coleta de tecidos para os experimentos aqui descritos foi aprovada pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Munique e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.
1. Aquisição de tecidos
<ol><li>Obtenha tecido humano de pacientes submetidos a transplante de coração ou cirurgia cardíaca.</li>
	<li...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

No passado, a pesquisa cardiovascular fez grandes avanços no cultivo de cardiomiócitos. No entanto, o cultivo 3D de cardiomiócitos com geometria intacta ainda não está bem estabelecido. Em comparação com os protocolos anteriores aplicados para o cultivo ex vivo do tecido miocárdio, o protocolo que descrevemos aqui se assemelha mais ao ambiente in vivo do tecido. Além disso, a aplicação de pré e pós-carga permite um ambiente mais biomimético. Somos capazes de analisar e entender completamen...

Na última década, o cultivo in vitro de células miocárdias fez grandes avanços, desde técnicas 2D e tridimensionais (3D) até o uso de organoides e células-tronco pluripotentes induzidas diferenciadas em miócitos cardíacos 1,2,3. Os cultivos de ex vivo e células primárias têm se mostrado de grande valor, especialmente para estudos genéticos e desenvolvimento de medicamentos 4,5,6. O uso de tecidos humanos melhora o valor translacional dos resultados. O cultivo 3D a longo prazo de tecidos miocárdios com geometria intacta, no entanto, não é bem estabelecido. A geometria intacta é uma característica fundamental para imitar condições in vivo, já que a função cardíaca adequada, a comunicação entre diferentes células, bem como as interações entre matriz celular são pré-requisitos. O cultivo de tecido miocárdio passou por várias fases de desenvolvimento. A taxa de sucesso e a estabilidade do cultivo de tecido miocárdio ex vivo foram inicialmente bastante baixas, mas abordagens recentes produziram resultados promissoresde 7,8,9,10,11.
Entre eles, Fischer et al. foram os primeiros a demonstrar que a viabilidade e o desempenho contítil do tecido miocárdio humano podem ser mantidos no cultivo de células ex vivo por muitas semanas7. Sua técnica foi baseada em fatias finas de tecido cortadas do miocárdio humano explantado, que foram montadas em câmaras de cultivo recém-desenvolvidas que forneceram condições biomecânicas definidas e estimulação elétrica contínua. Este método de cultivo se assemelha muito à função in vivo do tecido miocárdio, e foi reproduzido por vários grupos de pesquisa independentes 2,12,13,14,15. É importante ressaltar que as câmaras utilizadas por Fischer et al. também permitiram o registro contínuo de forças desenvolvidas por até 4 meses, e assim abriram oportunidades inéditas para pesquisas fisiológicas e farmacológicas sobre miocárdio humanointacto 7.
Técnicas semelhantes foram desenvolvidas independentemente por outros grupos e aplicadas ao miocárdio humano, rato, suíno e coelho 7,10,11. Pitoulis et al. desenvolveram posteriormente um método mais fisiológico, que reproduz a relação normal de comprimento de força durante um ciclo de contração, mas é menos adequado para análise de alto rendimento16. Como tal, a abordagem geral do cultivo biomimético pode ser considerada como mais um passo para a redução, refinamento e substituição (3R) de experimentos animais.
No entanto, a exploração desse potencial requer procedimentos padronizados, análises de alto conteúdo e um alto nível de rendimento. Apresentamos uma técnica que combina o corte automatizado do miocárdio humano vivo com a manutenção in vitro em um sistema de cultivo biomimético que se tornou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Com a abordagem proposta, o número de fatias individuais que podem ser geradas a partir de uma única amostra miocárdia transmural é limitado apenas pelo tempo de processamento. Uma amostra de tamanho e qualidade suficientes (3 cm x 3 cm) muitas vezes produz 20-40 fatias de tecido sendo convenientemente cortadas com um vibratome automatizado. Essas fatias podem ser colocadas em câmaras de cultivo pertencentes ao sistema. As câmaras permitem estimulação elétrica, cujas parâmetros podem ser moduladas (ou seja, duração do pulso, polaridade, taxa e corrente), bem como o ajuste da pré e pós-carga, utilizando fios de mola dentro das câmaras. A contração de cada fatia é registrada a partir do movimento de um pequeno ímã ligado a um fio de mola e exibido como um gráfico interpretável. Os dados podem ser registrados o tempo todo e analisados usando software livremente disponível. Além do ritmo constante da linha de base, protocolos programados podem ser realizados para avaliar funcionalmente seu período refratário, limiar de estimulação, potencialização pós-pausa e relação de frequência de força.
Este cultivo biomimético de longo prazo de múltiplas fatias de miocárdio de um coração individual abre caminho para futuras pesquisas ex vivo em tecido humano e animal, e facilita a triagem para efeitos terapêuticos e cardiotóxicos de drogas na medicina cardiovascular. Já foi aplicado em diversas abordagens experimentais 2,12,13,15. Aqui, damos uma descrição detalhada passo a passo da preparação do tecido humano e fornecemos soluções para problemas de cultivo frequentemente encontrados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

O cultivo de cardiomiócitos tem visto um grande número de desenvolvimentos, desde o cultivo de células bidimensionais (2D) até organoides derivados do iPSC. Em 2019, foi demonstrada uma forma ex vivo de cultivar fatias de miocárdio obtidas a partir de amostras de coração humano, ao mesmo tempo em que se aproximava da condição in vivo de contração do miocárdio. Estas amostras são originárias principalmente de transplantes cardíacos ou colocações de dispositivos de assistência à esquerda. Utilizando um vibratome e um sistema de cultivo especialmente desenvolvido, fatias de 300 μm de espessura são colocadas entre um fio fixo e um fio de mola, permitindo um cultivo estável e reprodutível por várias semanas. Durante o cultivo, as fatias são continuamente estimuladas de acordo com as configurações individuais. Contrações podem ser exibidas e registradas em tempo real, e agentes farmacológicos podem ser prontamente aplicados. Os protocolos de estimulação definidos pelo usuário podem ser agendados e realizados para avaliar parâmetros vitais de contração, como potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. Além disso, o sistema permite uma configuração variável de pré e pós-carga para um cultivo mais fisiológico.
Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo sobre como gerar um cultivo bem-sucedido a longo prazo de fatias de miocárdio ventricular esquerdo humano, utilizando uma solução comercial de cultivo biomimético.

A contração das fatias do miocárdio foi exibida na tela do computador após a inserção da câmara de cultivo em seu conector correspondente (Figura 3). A contração das fatias do miocárdio humano começou imediatamente após a estimulação. As fatias hipercontratadas por 5-10 min. Isso foi visível como um aumento das forças diastólicas, causadas por uma contratura tônica de frações de tecido danificadas. Esse processo foi revertido para diferentes graus dentro de 1-1,5 h. Após...

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Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Apresentamos um protocolo para o cultivo ex vivo de tecido miocárdio ventricular humano. Permite uma análise detalhada da força de contração e cinética, bem como a aplicação de carga pré e posterior para imitar o ambiente fisiológico in vivo mais de perto.

Preparação do tecido miocárdio humano para cultivo a longo prazo

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Usando este protocolo, fatias de tecido ventricular esquerdo humano podem ser cultivadas ex vivo em uma câmara biomimética. A aplicação de pré e pós-carga melhora a semelhança do ambiente fisiológico. Esta técnica permite o registro contínuo de contração tecidual.Os protocolos de estimulação definidos pelo usuário permitem a avaliação de parâmetros vitais de contração, como potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. O cultivo a longo prazo de fatias de miocárdio, utilizando essa configuração, abrirá caminho para futuras pesquisas ex vivo, facilitando essa triagem para efeitos terapêuticos e cardiotóxicos na medicina cardiovascular. Para começar, submergir as câmaras de cultivo e os eletrodos de grafite em um litro de uma solução isopropanol de 10% e agitar durante a noite.No dia seguinte, transfira as câmaras para uma solução de isopropanol 100% por 3 minutos e, em seguida, permita que as câmaras e eletrodos de grafite sequem sob um capô de fluxo laminar. Conecte uma placa de circuito a cada câmara de acordo com as posições disponíveis no roqueiro. Coloque dois eletrodos de grafite na placa do circuito de acordo com as instruções do fabricante e coloque uma tampa de placa de Petri de 35 milímetros na câmara para evitar infecções.Em seguida, encha a bandeja de corte de até 90 a 95% com tampão de corte. Transfira a amostra de tecido para uma placa de Petri de 100 milímetros cheia de tampão de corte frio, e coloque a placa em uma placa de resfriamento a 4 graus Celsius. Remova a trabecula do endocárdio segurando o endoárdio com pinças e use uma tesoura para cortar aproximadamente 3 milímetros de tecido endocárdio.Fixar a amostra de tecido cortado, lado endocárdio até um patch de borracha de 2 por 2 centímetros usando quatro agulhas de calibre 0,9 por 70 milímetros de calibre 20 que são fixadas em uma posição quadrada. Certifique-se de que a borda diagonal de cada ponta da agulha está apontando para dentro, melhorando a fixação e evitando danos ao miocárdio. Usando um bisturi, corte todo o excesso de tecido fora dos quatro quadrados de agulha.Usando pinças, coloque a amostra aparada em um pedaço de tecido estéril por 10 segundos para remover o excesso de tampão de corte. Em seguida, remova a seringa agarose do banho de água e submerse a amostra em agarose. Deixe a agarose solidificar por cinco minutos em uma placa de resfriamento.O lado endocárdio da amostra deve ser visível na agarose. Usando pinças, coloque o lado epicárido da amostra contida em agarose em cima da área colada e pressione suavemente a amostra contendo agarose do topo com uma ferramenta sem cortar ou danificar a agarose. Deixe a cola se solidificar por 1 minuto.Defina a amplitude de vibração para 1 milímetro, velocidade inicial de corte para 0,07 milímetros por segundo, e espessura da fatia para 300 mícrons. Depois de conectar o sistema de cultivo a um computador, inicie o programa de software correspondente. Defina a velocidade do roqueiro para 60 rpm e predefina os parâmetros de estimulação.Para fatias cardíacas humanas, defina a estimulação padrão para impulsos bifásicos com 50 miliamperes ou corrente composta por 3 milissegundos de corrente positiva, 1 milissegundo pausa, e um pulso de 3 milissegundos de corrente invertida a uma taxa de ritmo de 30 batidas por minuto ou bpm, em seguida, verifique os indicadores de eletrodos do software e verifique se os eletrodos das câmaras de cultivo estão funcionando corretamente. Usando pinças, separe a ágarose do tecido. Evite tocar o tecido e manuseá-lo cuidadosamente, pois qualquer dano ao tecido reduzirá a taxa de sucesso do cultivo.Para anexar dois triângulos plásticos a uma amostra, coloque 1 microliter de cola em uma tampa estéril da placa de Petri. Use uma pinça ligada para pegar um triângulo plástico autoclaved. Mergulhe rapidamente a borda frontal do triângulo na cola e cole o triângulo na amostra perpendicular ao alinhamento cardiomioceste.Repita para o outro triângulo. Usando um bisturi, corte o tecido que exceda a largura do triângulo e coloque a fatia com os dois triângulos montados de volta na bandeja de corte contendo tampão de corte. Remova a câmara de cultivo de preenchimento médio da incubadora.Selecione uma fatia preparada e insira-a na câmara conectando um triângulo a cada pino. Ajuste a distância entre os pinos de montagem até o tamanho da amostra. Certifique-se de que a amostra está submersa no meio.Depois de colocar o prato no roqueiro, diminua a pré-carga girando o parafuso de ajuste no sentido anti-horário até que a linha de base do gráfico correspondente na tela do computador não mude mais, em seguida, aumente cuidadosamente a pré-carga ou tensão girando o parafuso de ajuste no sentido horário. Para câmaras com alta rigidez, continue até que a linha de base correspondente no gráfico tenha aumentado em 1.000 para 1.200 unidades correspondentes a uma pré-carga milinovto. Depois de preparar o meio de cultivo fresco, pré-aqueça o meio em um banho de água ou incubadora de ar quente a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos.Retire o meio da câmara, deixando aproximadamente 0,8 mililitros na câmara, em seguida, adicione 1,6 mililitros de médio fresco para a mesma câmara, fazendo um volume total de médio a 2,4 mililitros por câmara. Por fim, coloque a tampa da câmara de volta e coloque a câmara de cultivo em sua respectiva posição. A leitura da contração de cinco fatias de miocárdio durante uma estimulação típica consistiu em quatro seções distintas de potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário.Em comparação com o controle, a força de contração das fatias tratadas com antagonistas de cálcio, nifedipina e calciseptina, foi diminuída em 10 minutos. Em contraste, o agonista do canal de cálcio fechado de voltagem, Bay-K8644, aumentou a força de contração. A potencialização pós-pausa do controle e das fatias tratadas foi avaliada para a liberação intracelular de cálcio do ânticulo sarcoplasmático.A fatia de controle não mostrou nenhuma mudança. Na presença de calciseptina e nifedipina, a inibição dos canais de cálcio do tipo L levou à potencialização da primeira contração após uma pausa de 50 segundos, refletindo uma maior contribuição relativa da liberação intracelular de cálcio à contratilidade total. O efeito oposto foi observado com Bay-K8644, que estimula a entrada de cálcio extracelular através dos canais de cálcio do tipo L.Na análise da relação de frequência de força, não foi observada alteração na fatia de controle. O tratamento da calciseptina não alterou a capacidade da fatia de seguir os estímulos após o aumento da frequência de estimulação ao comparar os dados pré e pós-tratamento. Em comparação com a calciseptina, a nifeipina impediu um aumento da contração a taxas de ritmo mais altas e reduziu a taxa máxima de captura em 80 bpm.Com Bay-K8644, observou-se aumento da força de contração em frequências de estimulação muito baixas. No entanto, em frequências superiores a 50 bpm, a força de contração foi menor do que durante a condição pré-tratamento. O tecido excisado deve ser rapidamente transferido para 4 graus de cardioplegia.Após o corte, triângulos plásticos devem ser anexados perpendicularmente à direção da fibra. A pré-carga não deve exceder 1500 mililitros. A cultura de fatias biomiméticas pode ajudar os pesquisadores a utilizar manipulações genéticas, bem como terapias baseadas em células para estudar a regeneração e a reparação no miocárdio humano adulto.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Preparação do tecido da córnea Doadores de ceratoplastia endotelial

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Medicina

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Long-Term Cateterismo do tronco linfa intestinal e Recolha de linfa no Neonatais Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Cirurgia de colocação de cateteres para Cardiovascular Testes exercício de longo prazo em Suínos

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Longo prazo medição de pressão arterial em ratos movimentando-se livremente utilizar telemetria

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Aprimoramento do modelo de suínos do miocárdio peito fechado pela padronização do tecido e os procedimentos de recolha de amostras de sangue

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Analisando gravações de eletrocardiografia de longo prazo para detectar arritmias em camundongos

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...