Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Forskningen finansierades av DZHK-bidrag 81Z0600207 (JH, PS och DM) och 81X2600253 (AD och TS).
Författarna vill tacka Claudia Fahney, Mei-Ping Wu och Matthias Semisch för deras stöd i förberedelserna av uppläggen, samt för det regelbundna underhållet av vävnadsodlingen.

Vävnadsinsamling för de experiment som beskrivs här godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid universitetet i München och Ruhr-University Bochum. Studierna genomfördes enligt Helsingforsdeklarationens riktlinjer. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke före vävnadsinsamlingen.
1. Förvärv av mjukpapper
<ol><li>Få mänsklig vävnad från patienter som genomgår hjärttransplantation eller hjärtkirurgi.</li>
	<li>Innan du skaffar vävnad...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

Tidigare har kardiovaskulär forskning gjort stora framsteg inom odling av kardiomyocyter. 3D-odlingen av kardiomyocyter med intakt geometri är dock ännu inte väletablerad. Jämfört med tidigare protokoll som tillämpats för ex vivo-odling av myokardvävnad, liknar protokollet som vi beskrev här vävnadens in vivo-miljö närmare. Dessutom möjliggör tillämpningen av för- och efterlast en mer biomimetisk miljö. Vi kan fullt ut analysera och förstå den kontinuerliga registreringen av sammandr...

Under det senaste decenniet har in vitro-odling av myokardceller gjort stora framsteg, allt från 2D- och tredimensionella (3D) tekniker till användning av organoider och inducerade pluripotenta stamceller differentierade till hjärtmyocyter 1,2,3. Ex vivo- och primärcellsodlingar har visat sig vara av stort värde, särskilt för genetiska studier och läkemedelsutveckling 4,5,6. Att använda mänskliga vävnader förbättrar resultatens translationella värde. Långsiktig 3D-odling av myokardvävnader med intakt geometri är dock inte väletablerad. Den intakta geometrin är en nyckelfunktion för att efterlikna in vivo-förhållanden, eftersom korrekt hjärtfunktion, kommunikation mellan olika celler samt cell-matrisinteraktioner är förutsättningar. Odling av myokardvävnad gick igenom olika utvecklingsfaser. Framgångsgraden och stabiliteten för odling av ex vivo myokardvävnad var initialt ganska låg, men de senaste metoderna har gett lovande resultat 7,8,9,10,11.
var bland dem de första som visade att livskraft och kontraktil prestanda hos mänsklig myokardvävnad kan bibehållas vid ex vivo-cellodling under många veckor7. Deras teknik baserades på tunna vävnadsskivor skurna från explanterat humant myokardium, som monterades i nyutvecklade odlingskammare som gav definierade biomekaniska förhållanden och kontinuerlig elektrisk stimulering. Denna odlingsmetod liknar myokardvävnadens in vivo-funktion och har reproducerats av flera oberoende forskargrupper 2,12,13,14,15. Viktigt är att kamrarna som användes av Fischer m.fl. också möjliggjorde kontinuerlig registrering av utvecklade krafter i upp till 4 månader och därmed öppnade oöverträffade möjligheter för fysiologisk och farmakologisk forskning om intakt humant myokardium7.
Liknande tekniker utvecklades oberoende av andra grupper och tillämpades på humant, råtta, svin och kaninmyokardium 7,10,11. utvecklade därefter en mer fysiologisk metod, som reproducerar det normala kraft-längdförhållandet under en sammandragningscykel, men är mindre lämplig för analys med hög genomströmning16. Som sådan kan det allmänna tillvägagångssättet för biomimetisk odling betraktas som ett ytterligare steg in i minskning, förfining och ersättning (3R) av djurförsök.
Utnyttjandet av denna potential kräver dock standardiserade procedurer, analyser med högt innehåll och en hög genomströmningsnivå. Vi presenterar en teknik som kombinerar automatiserad skivning av levande mänskligt myokardium med in vitro-underhåll i ett biomimetiskt odlingssystem som har blivit kommersiellt tillgängligt (se materialtabell). Med det föreslagna tillvägagångssättet begränsas antalet enskilda skivor som kan genereras från ett enda transmuralt myokardprov endast av bearbetningstiden. Ett prov av tillräcklig storlek och kvalitet (3 cm x 3 cm) ger ofta 20-40 vävnadsskivor som bekvämt skärs med ett automatiserat vibratom. Dessa skivor kan placeras i odlingskamrar som tillhör systemet. Kamrarna möjliggör elektrisk stimulering, vars parametrar kan moduleras (dvs pulsvaraktighet, polaritet, hastighet och ström), samt justering av för- och efterbelastning med hjälp av fjädertrådar inuti kamrarna. Sammandragningen av varje skiva registreras från rörelsen av en liten magnet fäst vid en fjädertråd och visas som en tolkningsbar graf. Data kan spelas in hela tiden och analyseras med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Bortsett från den konstanta baslinjepacing kan schemalagda protokoll utföras för att funktionellt bedöma deras eldfasta period, stimuleringströskel, post-paus-potentiering och kraft-frekvensrelation.
Denna långsiktiga biomimetiska odling av flera myokardskivor från ett enskilt hjärta banar väg för framtida ex vivo-forskning i både mänsklig och djurvävnad och underlättar screening för terapeutiska och kardiotoxiska läkemedelseffekter inom kardiovaskulär medicin. Det har redan tillämpats på olika experimentella tillvägagångssätt 2,12,13,15. Här ger vi en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av beredningen av mänsklig vävnad och ger lösningar för ofta förekommande odlingsproblem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Kardiomyocytodling har sett ett stort antal utvecklingar, allt från tvådimensionell (2D) cellodling till iPSC-härledda organoider. År 2019 demonstrerades ett ex vivo-sätt att odla myokardskivor erhållna från humana hjärtprover, samtidigt som man närmade sig in vivo-tillstånd av myokardiell sammandragning. Dessa prover kommer främst från hjärttransplantationer eller placeringar av vänsterkammarassistansanordningar. Med hjälp av ett vibratom och ett specialutvecklat odlingssystem placeras 300 μm tjocka skivor mellan en fast och en fjädertråd, vilket möjliggör stabil och reproducerbar odling i flera veckor. Under odlingen stimuleras skivorna kontinuerligt enligt individuella inställningar. Sammandragningar kan visas och registreras i realtid, och farmakologiska medel kan lätt appliceras. Användardefinierade stimuleringsprotokoll kan schemaläggas och utföras för att bedöma vitala sammandragningsparametrar som potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period. Dessutom möjliggör systemet en variabel för- och efterspänningsinställning för en mer fysiologisk odling.
Här presenterar vi en steg-för-steg-guide om hur man genererar en framgångsrik långsiktig odling av mänskliga vänstra ventrikulära myokardskivor med hjälp av en kommersiell biomimetisk odlingslösning.

Sammandragningen av myokardskivorna visades på datorskärmen efter införande av odlingskammaren i motsvarande kontakt (figur 3). Sammandragning av de mänskliga myokardskivorna började omedelbart efter stimulering. Skivorna hyperkontrakterade i 5-10 min. Detta var synligt som en ökning av diastoliska krafter, orsakad av en tonisk kontraktur av skadade vävnadsfraktioner. Denna process återställdes i varierande grad inom 1-1,5 h. Efter stabilisering visade mänskliga LV-vävnadsskivor r...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Vi presenterar ett protokoll för ex vivo odling av human ventrikulär myokardiell vävnad. Det möjliggör detaljerad analys av sammandragningskraft och kinetik, samt applicering av för- och efterbelastning för att efterlikna den fysiologiska miljön in vivo närmare.

Beredning av mänsklig myokardvävnad för långsiktig odling

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Med hjälp av detta protokoll kan mänskliga vänstra ventrikulära vävnadsskivor odlas ex vivo i en biomimetisk kammare. Tillämpningen av för- och efterbelastningar förbättrar likheten med den fysiologiska miljön. Denna teknik möjliggör kontinuerlig registrering av vävnadskontraktion.Användardefinierade stimuleringsprotokoll möjliggör bedömning av vitala sammandragningsparametrar som potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period. Den långsiktiga odlingen av myokardskivor, med hjälp av denna inställning, kommer att bana väg för framtida ex vivo-forskning, vilket underlättar denna screening för terapeutiska och kardiotoxiska läkemedelseffekter inom kardiovaskulär medicin. Börja med att sänka ner odlingskamrarna och grafitelektroderna i en liter av en 10% isopropanollösning och agitera över natten.Följande dag överför kamrarna till en 100% isopropanollösning i 3 minuter och låt sedan kamrarna och grafitelektroderna lufttorka under en laminär flödeshuv. Fäst ett kretskort på varje kammare enligt tillgängliga positioner på vippan. Placera två grafitelektroder på kretskortet enligt tillverkarens instruktioner, placera sedan ett 35 millimeter petriskållock på kammaren för att förhindra infektion.Fyll sedan skärbrickan upp till 90 till 95% med skivbuffert. Överför vävnadsprovet till en 100 millimeter petriskål fylld med kall skivbuffert och lägg skålen på en kylplatta vid 4 grader Celsius. Ta bort endokardiell trabeculae genom att hålla endokardiet med pincett och använd sedan sax för att skära bort cirka 3 millimeter endokardiell vävnad.Fixera det skurna vävnadsprovet, endokardiell sida upp till en 2 gånger 2 centimeter gummilapp med fyra 0,9 x 70 millimeter 20-gauge nålar som är fixerade i ett fyrkantigt läge. Se till att den diagonala kanten på varje nålspets pekar inåt, förbättrar fixeringen och förhindrar skador på myokardiet. Skär bort all överflödig vävnad utanför de fyra nålrutorna med en skalpell.Använd pincett och placera det trimmade provet på en steril bit vävnad i 10 sekunder för att ta bort överflödig skivbuffert. Ta sedan bort agarossprutan från vattenbadet och sänk ner provet i agaros. Låt agarosen stelna i fem minuter på en kylplatta.Provets endokardiella sida måste vara synlig i agarosen. Använd pincett, placera epikardiell sida av provet i agaros ovanpå det limmade området och tryck sedan försiktigt på det agarosinnehållande provet uppifrån med ett trubbigt verktyg utan att skära eller skada agarosen. Låt limet stelna i 1 minut.Ställ in vibrationsamplituden på 1 millimeter, initial skärhastighet till 0,07 millimeter per sekund och skivans tjocklek till 300 mikron. När du har anslutit odlingssystemet till en dator startar du motsvarande program. Ställ in vipphastigheten till 60 varv / min och förinställ stimuleringsparametrarna.För mänskliga hjärtskivor, ställ in standardstimuleringen till bifasiska impulser med 50 milliampere eller ström bestående av 3 millisekunder positiv ström, 1 millisekund paus och en 3-millisekundpuls av inverterad ström med en pacinghastighet på 30 slag per minut eller bpm, kontrollera sedan elektrodindikatorerna för programvaran och verifiera att elektroderna i odlingskamrarna fungerar korrekt. Använd pincett, separera agarosen från vävnaden. Undvik att röra vid vävnaden och hantera den försiktigt eftersom eventuella skador på vävnaden kommer att minska odlingens framgångsgrad.För att fästa två plasttrianglar på ett prov, placera 1 mikroliter lim på ett sterilt petriskållock. Använd en krokig pincett för att plocka upp en autoklaverad plasttriangel. Doppa snabbt triangelns framkant i limet och klistra in triangeln på provet vinkelrätt mot kardiomyocytinriktningen.Upprepa för den andra triangeln. Klipp av vävnad som överskrider triangelbredden med hjälp av en skalpell och placera skivan med de två monterade trianglarna tillbaka i skärbrickan som innehåller skivbuffert. Ta bort den medelfyllda odlingskammaren från inkubatorn.Välj en förberedd skiva och sätt in den i kammaren genom att ansluta en triangel till varje stift. Justera avståndet mellan monteringsstiften till provstorleken. Se till att provet är nedsänkt i mediet.När du har placerat skålen på vippan, minska förspänningen genom att vrida justeringsskruven moturs tills baslinjen för motsvarande graf på datorskärmen inte ändras längre, öka sedan försiktigt förspänningen eller spänningen genom att vrida justeringsskruven medurs. För kamrar med hög styvhet, fortsätt tills motsvarande baslinje i diagrammet har ökat med 1 000 till 1 200 enheter motsvarande en millinewton förspänning. Efter beredning av det färska odlingsmediet, förvärm mediet i ett vattenbad eller varmluftskuvös vid 37 grader Celsius i 30 till 45 minuter.Ta bort medium från kammaren och lämna cirka 0,8 ml i kammaren, tillsätt sedan 1,6 ml färskt medium till samma kammare, vilket gör en total volym medium till 2,4 ml per kammare. Slutligen placera kammarens lock tillbaka och placera odlingskammaren i respektive läge. Avläsningen av sammandragningen av fem myokardskivor under en typisk stimulering bestod av fyra distinkta sektioner av potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period.Jämfört med kontroll minskade sammandragningskraften hos skivorna behandlade med kalciumantagonister, nifedipin och kalceisepin, inom 10 minuter. Däremot ökade den spänningsstyrda kalciumkanalagonisten, Bay-K8644, sammandragningskraften. Potentieringen av kontrollen och behandlade skivor efter paus bedömdes för den intracellulära kalciumfrisättningen från sarkoplasmatisk retikulum.Kontrollsegmentet visade inga ändringar. I närvaro av kalciseptin och nifedipin ledde inhiberingen av kalciumkanalerna av L-typ till potentiering av den första sammandragningen efter en paus på 50 sekunder, vilket återspeglar ett högre relativt bidrag av intracellulär kalciumfrisättning till total kontraktilitet. Den motsatta effekten observerades med Bay-K8644, vilket stimulerar inträdet av extracellulärt kalcium via kalciumkanalerna av L-typ.I kraftfrekvensrelationsanalys observerades ingen förändring i kontrollsegmentet. Calciseptinbehandlingen förändrade inte skivans förmåga att följa stimuli vid en ökning av stimuleringsfrekvensen när man jämförde data före och efter behandlingen. Jämfört med kalciseptin förhindrade nifedipin en ökning av kontraktiliteten vid högre takthastigheter och minskade den maximala fångsthastigheten vid 80 slag per minut.Med Bay-K8644 observerades ökad sammandragningskraft vid mycket låga stimuleringsfrekvenser. Vid frekvenser högre än 50 slag per minut var emellertid sammandragningskraften lägre än under förbehandlingstillståndet. Utskuren vävnad ska snabbt överföras till 4 grader kardioplegi.Efter skivning måste plasttrianglar fästas vinkelrätt mot fiberriktningen. Förspänningen bör inte överstiga 1500 millinewton. Biomimetisk skivkultur kan hjälpa forskare att använda genetiska manipulationer såväl som cellbaserade terapier för att studera regenerering och reparation i vuxen humant myokardium.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Hornhinnan donatorvävnad Förberedelse för Endothelial keratoplasti

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapslings Thermogenic preadipocyter för transplantation till fettvävnad Depåer

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbeta med mänskliga vävnader för translationell cancerforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Långtids Kateterisering av tarm Lymph Trunk och Insamling av lymfa i neonatala grisar

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Kirurgisk placering av katetrar för långsiktigt konditionsträning Testning i svin

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Långsiktig blodtrycksmätning i fritt rörliga Möss Använda Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

3D Whole-hjärta Myocardial Tissue Analys

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Förbättring av en sluten bröstet svin hjärtinfarkt modell av standardisering av vävnad och blod provtagningsmetoder

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Analysera långsiktiga elektrokardiografiinspelningar för att upptäcka arytmier hos möss

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Teknik för att erhålla mesenkymal stamcell från fettvävnad och stromal vaskulär fraktionskaraktärisering vid långvarig kryokonservering

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...