Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Araştırma DZHK hibeleri 81Z0600207 (JH, PS ve DM) ve 81X2600253 (AD ve TS) tarafından finanse edildi.
Yazarlar, Claudia Fahney, Mei-Ping Wu ve Matthias Semisch'e, kurulumların hazırlanmasındaki destekleri ve doku ekiminin düzenli olarak sürdürülmesi için teşekkür eder.

Burada açıklanan deneyler için doku toplama, Münih Üniversitesi ve Bochum Ruhr Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Deklarasyonu kılavuzlarına göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.
1. Doku edinimi
<ol><li>Kalp nakli veya kalp ameliyatı geçiren hastalardan insan dokusu elde edin.</li>
	<li>Dokuyu tedarik etmeden önce, 2 L kardiyoplejik ç...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

Geçmişte, kardiyovasküler araştırmalar kardiyomiyositlerin yetiştirilmesinde büyük ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip kardiyomiyositlerin 3D ekimi henüz iyi kurulmamıştır. Miyokard dokusunun ex vivo yetiştirilmesi için uygulanan önceki protokollerle karşılaştırıldığında, burada anlattığımız protokol, dokunun in vivo ortamını daha yakından andırmaktadır. Ayrıca, yükleme öncesi ve sonrası uygulama daha biyomimetik bir ortam sağla...

Son on yılda, miyokard hücrelerinin in vitro yetiştirilmesi, 2D ve üç boyutlu (3D) tekniklerden, organoidlerin kullanımına ve kardiyak miyositlere farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımına kadar büyük ilerlemeler kaydetmiştir 1,2,3. Ex vivo ve primer hücre yetiştiriciliğinin, özellikle genetik çalışmalar ve ilaç geliştirme için büyük bir değere sahip olduğu gösterilmiştir 4,5,6. İnsan dokularının kullanılması, sonuçların translasyonel değerini arttırır. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip miyokard dokularının uzun süreli 3D yetiştiriciliği iyi kurulmamıştır. Bozulmamış geometri, in vivo koşulları taklit etmek için önemli bir özelliktir, çünkü uygun kalp fonksiyonu, farklı hücreler arasındaki iletişim ve hücre-matris etkileşimleri ön koşuldur. Miyokard doku yetiştiriciliği, gelişimin çeşitli aşamalarından geçti. Ex vivo miyokard doku yetiştiriciliğinin başarı oranı ve stabilitesi başlangıçta oldukça düşüktü, ancak son yaklaşımlar umut verici sonuçlar verdi 7,8,9,10,11.
Bunlar arasında, Fischer ve ark., insan miyokard dokusunun yaşayabilirliğinin ve kontraktil performansının ex vivo hücre yetiştiriciliğinde7. hafta boyunca korunabileceğini gösteren ilk kişilerdi. Teknikleri, tanımlanmış biyomekanik koşullar ve sürekli elektriksel stimülasyon sağlayan yeni geliştirilen yetiştirme odalarına monte edilen ekilen insan miyokardından kesilen ince doku dilimlerine dayanıyordu. Bu yetiştirme yöntemi, miyokard dokusunun in vivo fonksiyonuna çok benzemektedir ve birkaç bağımsız araştırma grubu2,12,13,14,15 tarafından çoğaltılmıştır. Daha da önemlisi, Fischer ve ark. tarafından kullanılan odalar, gelişmiş kuvvetlerin 4 aya kadar sürekli olarak kaydedilmesini sağladı ve böylece bozulmamış insan miyokardının7 fizyolojik ve farmakolojik araştırması için benzeri görülmemiş fırsatlar yarattı.
Benzer teknikler diğer gruplar tarafından bağımsız olarak geliştirilmiş ve insan, sıçan, domuz ve tavşan miyokard 7,10,11'e uygulanmıştır. Pitoulis ve ark. daha sonra bir büzülme döngüsü sırasında normal kuvvet-uzunluk ilişkisini yeniden üreten, ancak yüksek verimli analiz için daha az uygun olan daha fizyolojik bir yöntem geliştirdiler16. Bu nedenle, biyomimetik yetiştiriciliğin genel yaklaşımı, hayvan deneylerinin azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi (3R) için bir sonraki adım olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu potansiyelden yararlanmak için standartlaştırılmış prosedürler, yüksek içerik analizleri ve yüksek bir verim seviyesi gerekir. Yaşayan insan miyokardının otomatik dilimlenmesini, ticari olarak temin edilebilen biyomimetik bir yetiştirme sisteminde in vitro bakım ile birleştiren bir teknik sunuyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Önerilen yaklaşımla, tek bir transmural miyokard örneğinden üretilebilecek bireysel dilimlerin sayısı sadece işlem süresi ile sınırlıdır. Yeterli boyut ve kalitede (3 cm x 3 cm) bir örnek genellikle otomatik bir vibratom ile uygun şekilde kesilen 20-40 doku dilimi verir. Bu dilimler sisteme ait yetiştirme odalarına yerleştirilebilir. Odalar, parametreleri modüle edilebilen elektriksel stimülasyona (yani, darbe süresi, polarite, hız ve akım) ve ayrıca odaların içindeki yaylı teller kullanılarak ön ve son yükün ayarlanmasına izin verir. Her dilimin büzülmesi, bir yay teline bağlı küçük bir mıknatısın hareketinden kaydedilir ve yorumlanabilir bir grafik olarak görüntülenir. Veriler her zaman kaydedilebilir ve serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. Sabit taban çizgisi hızının yanı sıra, refrakter dönemlerini, stimülasyon eşiğini, duraklama sonrası potansiyellerini ve kuvvet-frekans ilişkilerini işlevsel olarak değerlendirmek için planlanmış protokoller gerçekleştirilebilir.
Bireysel bir kalpten çoklu miyokard dilimlerinin bu uzun süreli biyomimetik ekimi, hem insan hem de hayvan dokusunda gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açar ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkilerinin taranmasını kolaylaştırır. Çeşitli deneysel yaklaşımlara zaten uygulanmıştır 2,12,13,15. Burada, insan dokusunun hazırlanmasının ayrıntılı bir adım adım tanımını veriyoruz ve sık karşılaşılan yetiştirme sorunlarına çözümler sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Kardiyomiyosit yetiştiriciliği, iki boyutlu (2D) hücre yetiştiriciliğinden iPSC türevi organoidlere kadar çok sayıda gelişme göstermiştir. 2019 yılında, miyokard kasılmasının in vivo durumuna yaklaşırken, insan kalp örneklerinden elde edilen miyokard dilimlerini yetiştirmenin ex vivo bir yolu gösterilmiştir. Bu örnekler çoğunlukla kalp transplantasyonlarından veya sol ventrikül destek cihazı yerleşimlerinden kaynaklanmaktadır. Bir vibratom ve özel olarak geliştirilmiş bir yetiştirme sistemi kullanılarak, sabit ve yaylı bir tel arasına 300 μm kalınlığında dilimler yerleştirilir ve birkaç hafta boyunca istikrarlı ve tekrarlanabilir bir ekime izin verir. Yetiştirme sırasında, dilimler bireysel ayarlara göre sürekli olarak uyarılır. Kasılmalar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve kaydedilebilir ve farmakolojik ajanlar kolayca uygulanabilir. Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerini değerlendirmek için planlanabilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, sistem daha fizyolojik bir yetiştirme için değişken bir ön ve son yük ayarı sağlar.
Burada, ticari bir biyomimetik yetiştirme çözeltisi kullanarak, insan sol ventrikül miyokard dilimlerinin başarılı bir şekilde uzun vadeli bir şekilde nasıl yetiştirileceğine dair adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Miyokard dilimlerinin daralması, yetiştirme odasının karşılık gelen konektörüne yerleştirilmesinden sonra bilgisayar ekranında görüntülendi (Şekil 3). İnsan miyokard dilimlerinin kasılması, stimülasyondan hemen sonra başladı. Dilimler 5-10 dakika boyunca hiperkontrakte edildi. Bu, hasarlı doku fraksiyonlarının tonik kontraktürünün neden olduğu diyastolik kuvvetlerin artması olarak görülebiliyordu. Bu işlem 1-1.5 saat içinde değişen derecelere geri döndür?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.

Uzun Süreli Yetiştirme için İnsan Miyokard Dokusunun Hazırlanması

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Bu protokolü kullanarak, insan sol ventrikül dokusu dilimleri biyomimetik bir odada ex vivo olarak yetiştirilebilir. Ön ve son yüklerin uygulanması, fizyolojik ortamın benzerliğini arttırır. Bu teknik, doku kasılmasının sürekli olarak kaydedilmesini sağlar.Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu kurulumu kullanarak miyokard dilimlerinin uzun süreli ekimi, gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açacak ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkileri için bu taramayı kolaylaştıracaktır. Başlamak için, yetiştirme odalarını ve grafit elektrotlarını% 10'luk bir izopropanol çözeltisinin bir litresine batırın ve gece boyunca çalkalayın.Ertesi gün, odaları 3 dakika boyunca% 100 izopropanol çözeltisine aktarın, ardından odaların ve grafit elektrotların laminer bir akış başlığı altında hava ile kurumasına izin verin. Rocker üzerindeki mevcut konumlara göre her odaya bir devre kartı takın. Üreticinin talimatlarına göre devre kartına iki grafit elektrot yerleştirin, ardından enfeksiyonu önlemek için odaya 35 milimetrelik bir Petri kabı kapağı yerleştirin.Ardından, kesme tepsisini% 90 ila% 95'e kadar dilimleme tamponu ile doldurun. Doku örneğini soğuk dilimleme tamponuyla doldurulmuş 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve çanağı 4 santigrat derecede bir soğutma plakasına yerleştirin. Endokardın cımbızla tutularak endokardiyal trabekülleri çıkarın, ardından yaklaşık 3 milimetre endokardiyal dokuyu kesmek için makas kullanın.Kesilmiş doku numunesini, endokardiyal tarafı, kare konumda sabitlenmiş dört adet 0,9 x 70 milimetre 20 gauge iğne kullanarak 2 x 2 santimetrelik bir kauçuk yamaya kadar sabitleyin. Her iğne ucunun çapraz kenarının içe doğru baktığından, fiksasyonu arttırdığından ve miyokardın zarar görmesini önlediğinden emin olun. Bir neşter kullanarak, dört iğne karesinin dışındaki tüm fazla dokuyu kesin.Cımbız kullanarak, fazla dilimleme tamponunu çıkarmak için kesilmiş numuneyi 10 saniye boyunca steril bir doku parçasına yerleştirin. Daha sonra, agaroz şırıngasını su banyosundan çıkarın ve numuneyi agaroza batırın. Agarozun bir soğutma plakasında beş dakika boyunca katılaşmasına izin verin.Numunenin endokardiyal tarafı agarozda görünür olmalıdır. Cımbız kullanarak, agarozda bulunan numunenin epikardiyal tarafını yapıştırılmış alanın üzerine yerleştirin, ardından agaroz içeren numuneyi, agarozu kesmeden veya zarar vermeden künt bir aletle üstten hafifçe bastırın. Tutkalın 1 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.Titreşim genliğini 1 milimetreye, ilk kesme hızını saniyede 0,07 milimetreye ve dilimin kalınlığını 300 mikrona ayarlayın. Yetiştirme sistemini bir bilgisayara bağladıktan sonra, ilgili yazılım programını başlatın. Rocker hızını 60 rpm'ye ayarlayın ve stimülasyon parametrelerini önceden ayarlayın.İnsan kalp dilimleri için, standart stimülasyonu 50 miliamper veya akımla bifazik impulslara ayarlayın 3 milisaniye pozitif akım, 1 milisaniye duraklama ve dakikada 30 atım veya bpm hızında 3 milisaniyelik ters akım darbesinden oluşan bir akım, ardından yazılımın elektrot göstergelerini kontrol edin ve yetiştirme odalarının elektrotlarının doğru çalıştığını doğrulayın. Cımbız kullanarak, agarozu dokudan ayırın. Dokuya dokunmaktan kaçının ve dokuya verilen herhangi bir hasar yetiştiriciliğin başarı oranını azaltacağından dikkatlice kullanın.Bir numuneye iki plastik üçgen takmak için, steril bir Petri kabı kapağına 1 mikrolitre yapıştırıcı yerleştirin. Otoklavlanmış bir plastik üçgeni almak için kancalı bir cımbız kullanın. Üçgenin ön kenarını hızlı bir şekilde yapıştırıcıya batırın ve üçgeni kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak numuneye yapıştırın.Diğer üçgen için bu işlemi tekrarlayın. Bir neşter kullanarak, üçgen genişliğini aşan dokuyu kesin ve iki monte edilmiş üçgenle dilimi, dilimleme tamponu içeren kesme tepsisine geri yerleştirin. Orta dolgulu ekim odasını inkübatörden çıkarın.Hazırlanmış bir dilim seçin ve her pime bir üçgen bağlayarak hazneye yerleştirin. Montaj pimleri arasındaki mesafeyi numune boyutuna göre ayarlayın. Numunenin ortama batırıldığından emin olun.Çanağı rocker'a yerleştirdikten sonra, bilgisayar ekranındaki ilgili grafiğin taban çizgisi artık değişmeyene kadar ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ön yükü azaltın, ardından ayar vidasını saat yönünde çevirerek ön yükü veya gerilimi dikkatlice artırın. Yüksek sertliğe sahip odalar için, grafikteki karşılık gelen taban çizgisi bir milinewton ön yüke karşılık gelen 1.000 ila 1.200 birim artana kadar devam edin. Taze ekim ortamını hazırladıktan sonra, ortamı bir su banyosunda veya sıcak hava inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika önceden ısıtın.Haznede yaklaşık 0,8 mililitre bırakarak ortamı odadan çıkarın, ardından aynı odaya 1,6 mililitre taze ortam ekleyin ve oda başına toplam orta ila 2,4 mililitre hacim yapın. Son olarak, odanın kapağını geri yerleştirin ve yetiştirme odasını kendi konumuna yerleştirin. Tipik bir stimülasyon sırasında beş miyokard diliminin kasılmasının okunması, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter periyodun dört ayrı bölümünden oluşuyordu.Kontrol ile karşılaştırıldığında, kalsiyum antagonistleri, nifedipin ve kalsiseptin ile muamele edilen dilimlerin kasılma kuvveti 10 dakika içinde azaltıldı. Buna karşılık, voltaj kapılı kalsiyum kanal agonisti Bay-K8644, büzülme kuvvetini arttırdı. Kontrol ve tedavi edilen dilimlerin duraklama sonrası potansiyeli, sarkoplazmik retikulumdan hücre içi kalsiyum salınımı açısından değerlendirildi.Denetim dilimi herhangi bir değişiklik göstermedi. Kalsiseptin ve nifedipin varlığında, L-tipi kalsiyum kanallarının inhibisyonu 50 saniyelik bir duraklamadan sonra ilk kasılmanın güçlendirilmesine yol açmıştır ve hücre içi kalsiyum salınımının toplam kontraktiliteye daha yüksek bir göreceli katkısını yansıtmaktadır. Ters etki, hücre dışı kalsiyumun L-tipi kalsiyum kanallarından girişini uyaran Bay-K8644 ile gözlenmiştir.Kuvvet-frekans ilişkisi analizinde kontrol diliminde herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Kalsiseptin tedavisi, tedavi öncesi ve sonrası verileri karşılaştırırken stimülasyon sıklığının artması üzerine dilimin uyaranları takip etme yeteneğini değiştirmedi. Kalsiseptin ile karşılaştırıldığında, nifedipin daha yüksek tempolu oranlarda kontraktilitede bir artışı önledi ve maksimum yakalama oranını 80 bpm'de düşürdü.Bay-K8644 ile çok düşük stimülasyon frekanslarında artan büzülme kuvveti gözlendi. Bununla birlikte, 50 bpm'den daha yüksek frekanslarda, kasılma kuvveti ön işlem durumundan daha düşüktü. Eksize edilen doku hızlı bir şekilde 4 derece kardiyoplejiye aktarılmalıdır.Dilimlemeden sonra, plastik üçgenler lif yönüne dik olarak tutturulmalıdır. Ön yük 1500 milinewtonu geçmemelidir. Biyomimetik dilim kültürü, araştırmacıların yetişkin insan miyokardında rejenerasyon ve onarımı incelemek için genetik manipülasyonların yanı sıra hücre bazlı terapileri kullanmalarına yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Endotel Keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Yenidoğan Domuzların Lenf Bağırsak Lenf Trunk ve Koleksiyonu Uzun Vadeli Kateterizasyon

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Domuz uzun süreli Kardiyovasküler Egzersiz Testi için Kateter Cerrahi Yerleştirme

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Telemetri kullanarak Serbestçe Hareketli Fare Uzun süreli Tansiyon Ölçümü

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

3D Tüm kalp Miyokard Doku Analizi

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Kapalı göğüs domuz miyokard infarktüsü manken standardizasyon doku ve kan örnekleme prosedürleri tarafından geliştirilmesi

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Farelerde Aritmileri Tespit Etmek için Uzun Süreli Elektrokardiyografi Kayıtlarının Analizi

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...