Name: preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Araştırma DZHK hibeleri 81Z0600207 (JH, PS ve DM) ve 81X2600253 (AD ve TS) tarafından finanse edildi.
Yazarlar, Claudia Fahney, Mei-Ping Wu ve Matthias Semisch'e, kurulumların hazırlanmasındaki destekleri ve doku ekiminin düzenli olarak sürdürülmesi için teşekkür eder.

Burada açıklanan deneyler için doku toplama, Münih Üniversitesi ve Bochum Ruhr Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Deklarasyonu kılavuzlarına göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.
1. Doku edinimi
<ol><li>Kalp nakli veya kalp ameliyatı geçiren hastalardan insan dokusu elde edin.</li>
	<li>Dokuyu tedarik etmeden önce, 2 L kardiyoplejik ç...

<ol>
	<li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices.">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).</li><li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium.">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li><li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147 (2012).</li><li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium.">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).</li><li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome.">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li><li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity.">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organotypic+cultured+cardiac+slices:+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials.">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions.">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices.">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li><li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium.">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).</li><li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes.">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li><li>Esfandyari, D. A. -. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration.">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li><li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro.">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li><li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nifedipine+blocks+Ca2++store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2++channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle.">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li><li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calciseptine,+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom,+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel.">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li><li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2.">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li><li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dihydropyridine+(Bay-K8644)+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent.">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li></ol>

Geçmişte, kardiyovasküler araştırmalar kardiyomiyositlerin yetiştirilmesinde büyük ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip kardiyomiyositlerin 3D ekimi henüz iyi kurulmamıştır. Miyokard dokusunun ex vivo yetiştirilmesi için uygulanan önceki protokollerle karşılaştırıldığında, burada anlattığımız protokol, dokunun in vivo ortamını daha yakından andırmaktadır. Ayrıca, yükleme öncesi ve sonrası uygulama daha biyomimetik bir ortam sağla...

Son on yılda, miyokard hücrelerinin in vitro yetiştirilmesi, 2D ve üç boyutlu (3D) tekniklerden, organoidlerin kullanımına ve kardiyak miyositlere farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımına kadar büyük ilerlemeler kaydetmiştir 1,2,3. Ex vivo ve primer hücre yetiştiriciliğinin, özellikle genetik çalışmalar ve ilaç geliştirme için büyük bir değere sahip olduğu gösterilmiştir 4,5,6. İnsan dokularının kullanılması, sonuçların translasyonel değerini arttırır. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip miyokard dokularının uzun süreli 3D yetiştiriciliği iyi kurulmamıştır. Bozulmamış geometri, in vivo koşulları taklit etmek için önemli bir özelliktir, çünkü uygun kalp fonksiyonu, farklı hücreler arasındaki iletişim ve hücre-matris etkileşimleri ön koşuldur. Miyokard doku yetiştiriciliği, gelişimin çeşitli aşamalarından geçti. Ex vivo miyokard doku yetiştiriciliğinin başarı oranı ve stabilitesi başlangıçta oldukça düşüktü, ancak son yaklaşımlar umut verici sonuçlar verdi 7,8,9,10,11.
Bunlar arasında, Fischer ve ark., insan miyokard dokusunun yaşayabilirliğinin ve kontraktil performansının ex vivo hücre yetiştiriciliğinde7. hafta boyunca korunabileceğini gösteren ilk kişilerdi. Teknikleri, tanımlanmış biyomekanik koşullar ve sürekli elektriksel stimülasyon sağlayan yeni geliştirilen yetiştirme odalarına monte edilen ekilen insan miyokardından kesilen ince doku dilimlerine dayanıyordu. Bu yetiştirme yöntemi, miyokard dokusunun in vivo fonksiyonuna çok benzemektedir ve birkaç bağımsız araştırma grubu2,12,13,14,15 tarafından çoğaltılmıştır. Daha da önemlisi, Fischer ve ark. tarafından kullanılan odalar, gelişmiş kuvvetlerin 4 aya kadar sürekli olarak kaydedilmesini sağladı ve böylece bozulmamış insan miyokardının7 fizyolojik ve farmakolojik araştırması için benzeri görülmemiş fırsatlar yarattı.
Benzer teknikler diğer gruplar tarafından bağımsız olarak geliştirilmiş ve insan, sıçan, domuz ve tavşan miyokard 7,10,11'e uygulanmıştır. Pitoulis ve ark. daha sonra bir büzülme döngüsü sırasında normal kuvvet-uzunluk ilişkisini yeniden üreten, ancak yüksek verimli analiz için daha az uygun olan daha fizyolojik bir yöntem geliştirdiler16. Bu nedenle, biyomimetik yetiştiriciliğin genel yaklaşımı, hayvan deneylerinin azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi (3R) için bir sonraki adım olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu potansiyelden yararlanmak için standartlaştırılmış prosedürler, yüksek içerik analizleri ve yüksek bir verim seviyesi gerekir. Yaşayan insan miyokardının otomatik dilimlenmesini, ticari olarak temin edilebilen biyomimetik bir yetiştirme sisteminde in vitro bakım ile birleştiren bir teknik sunuyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Önerilen yaklaşımla, tek bir transmural miyokard örneğinden üretilebilecek bireysel dilimlerin sayısı sadece işlem süresi ile sınırlıdır. Yeterli boyut ve kalitede (3 cm x 3 cm) bir örnek genellikle otomatik bir vibratom ile uygun şekilde kesilen 20-40 doku dilimi verir. Bu dilimler sisteme ait yetiştirme odalarına yerleştirilebilir. Odalar, parametreleri modüle edilebilen elektriksel stimülasyona (yani, darbe süresi, polarite, hız ve akım) ve ayrıca odaların içindeki yaylı teller kullanılarak ön ve son yükün ayarlanmasına izin verir. Her dilimin büzülmesi, bir yay teline bağlı küçük bir mıknatısın hareketinden kaydedilir ve yorumlanabilir bir grafik olarak görüntülenir. Veriler her zaman kaydedilebilir ve serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. Sabit taban çizgisi hızının yanı sıra, refrakter dönemlerini, stimülasyon eşiğini, duraklama sonrası potansiyellerini ve kuvvet-frekans ilişkilerini işlevsel olarak değerlendirmek için planlanmış protokoller gerçekleştirilebilir.
Bireysel bir kalpten çoklu miyokard dilimlerinin bu uzun süreli biyomimetik ekimi, hem insan hem de hayvan dokusunda gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açar ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkilerinin taranmasını kolaylaştırır. Çeşitli deneysel yaklaşımlara zaten uygulanmıştır 2,12,13,15. Burada, insan dokusunun hazırlanmasının ayrıntılı bir adım adım tanımını veriyoruz ve sık karşılaşılan yetiştirme sorunlarına çözümler sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Low melting point</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bay-K8644</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>19988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calciseptine</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>SPC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose*H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3730.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>3703452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>SAV LP GmbH</td>
			<td>UN1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X-supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5150056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04933.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2*6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1036.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4*H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin x100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1108.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>KS15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM</td>
			<td>BBraun</td>
			<td></td>
			<td>In-house made combination of cooling and heating solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>CB240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoDish bioreactor system</td>
			<td>InVitroSys GmbH</td>
			<td>MyoDish 1</td>
			<td>Myodish cultute system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 37 degrees</td>
			<td>Haake</td>
			<td>SWB25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath 80 degrees</td>
			<td>Daglef Patz KG</td>
			<td>7070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL plastic single-use beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration unit, Steritop Quick Release</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.9 x 70 mm 20G</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4665791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic triangles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Derby premium</td>
			<td>Derby Tokai</td>
			<td>B072HJCFK6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Gillette Silver Blue</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>7393560010170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.30.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 10 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 3.5 cm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human myocardial tissue for long-term cultivation

Kardiyomiyosit yetiştiriciliği, iki boyutlu (2D) hücre yetiştiriciliğinden iPSC türevi organoidlere kadar çok sayıda gelişme göstermiştir. 2019 yılında, miyokard kasılmasının in vivo durumuna yaklaşırken, insan kalp örneklerinden elde edilen miyokard dilimlerini yetiştirmenin ex vivo bir yolu gösterilmiştir. Bu örnekler çoğunlukla kalp transplantasyonlarından veya sol ventrikül destek cihazı yerleşimlerinden kaynaklanmaktadır. Bir vibratom ve özel olarak geliştirilmiş bir yetiştirme sistemi kullanılarak, sabit ve yaylı bir tel arasına 300 μm kalınlığında dilimler yerleştirilir ve birkaç hafta boyunca istikrarlı ve tekrarlanabilir bir ekime izin verir. Yetiştirme sırasında, dilimler bireysel ayarlara göre sürekli olarak uyarılır. Kasılmalar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve kaydedilebilir ve farmakolojik ajanlar kolayca uygulanabilir. Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerini değerlendirmek için planlanabilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, sistem daha fizyolojik bir yetiştirme için değişken bir ön ve son yük ayarı sağlar.
Burada, ticari bir biyomimetik yetiştirme çözeltisi kullanarak, insan sol ventrikül miyokard dilimlerinin başarılı bir şekilde uzun vadeli bir şekilde nasıl yetiştirileceğine dair adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Miyokard dilimlerinin daralması, yetiştirme odasının karşılık gelen konektörüne yerleştirilmesinden sonra bilgisayar ekranında görüntülendi (Şekil 3). İnsan miyokard dilimlerinin kasılması, stimülasyondan hemen sonra başladı. Dilimler 5-10 dakika boyunca hiperkontrakte edildi. Bu, hasarlı doku fraksiyonlarının tonik kontraktürünün neden olduğu diyastolik kuvvetlerin artması olarak görülebiliyordu. Bu işlem 1-1.5 saat içinde değişen derecelere geri döndür?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation at JoVE.com

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.

Uzun Süreli Yetiştirme için İnsan Miyokard Dokusunun Hazırlanması

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Bu protokolü kullanarak, insan sol ventrikül dokusu dilimleri biyomimetik bir odada ex vivo olarak yetiştirilebilir. Ön ve son yüklerin uygulanması, fizyolojik ortamın benzerliğini arttırır. Bu teknik, doku kasılmasının sürekli olarak kaydedilmesini sağlar.Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu kurulumu kullanarak miyokard dilimlerinin uzun süreli ekimi, gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açacak ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkileri için bu taramayı kolaylaştıracaktır. Başlamak için, yetiştirme odalarını ve grafit elektrotlarını% 10'luk bir izopropanol çözeltisinin bir litresine batırın ve gece boyunca çalkalayın.Ertesi gün, odaları 3 dakika boyunca% 100 izopropanol çözeltisine aktarın, ardından odaların ve grafit elektrotların laminer bir akış başlığı altında hava ile kurumasına izin verin. Rocker üzerindeki mevcut konumlara göre her odaya bir devre kartı takın. Üreticinin talimatlarına göre devre kartına iki grafit elektrot yerleştirin, ardından enfeksiyonu önlemek için odaya 35 milimetrelik bir Petri kabı kapağı yerleştirin.Ardından, kesme tepsisini% 90 ila% 95'e kadar dilimleme tamponu ile doldurun. Doku örneğini soğuk dilimleme tamponuyla doldurulmuş 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve çanağı 4 santigrat derecede bir soğutma plakasına yerleştirin. Endokardın cımbızla tutularak endokardiyal trabekülleri çıkarın, ardından yaklaşık 3 milimetre endokardiyal dokuyu kesmek için makas kullanın.Kesilmiş doku numunesini, endokardiyal tarafı, kare konumda sabitlenmiş dört adet 0,9 x 70 milimetre 20 gauge iğne kullanarak 2 x 2 santimetrelik bir kauçuk yamaya kadar sabitleyin. Her iğne ucunun çapraz kenarının içe doğru baktığından, fiksasyonu arttırdığından ve miyokardın zarar görmesini önlediğinden emin olun. Bir neşter kullanarak, dört iğne karesinin dışındaki tüm fazla dokuyu kesin.Cımbız kullanarak, fazla dilimleme tamponunu çıkarmak için kesilmiş numuneyi 10 saniye boyunca steril bir doku parçasına yerleştirin. Daha sonra, agaroz şırıngasını su banyosundan çıkarın ve numuneyi agaroza batırın. Agarozun bir soğutma plakasında beş dakika boyunca katılaşmasına izin verin.Numunenin endokardiyal tarafı agarozda görünür olmalıdır. Cımbız kullanarak, agarozda bulunan numunenin epikardiyal tarafını yapıştırılmış alanın üzerine yerleştirin, ardından agaroz içeren numuneyi, agarozu kesmeden veya zarar vermeden künt bir aletle üstten hafifçe bastırın. Tutkalın 1 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.Titreşim genliğini 1 milimetreye, ilk kesme hızını saniyede 0,07 milimetreye ve dilimin kalınlığını 300 mikrona ayarlayın. Yetiştirme sistemini bir bilgisayara bağladıktan sonra, ilgili yazılım programını başlatın. Rocker hızını 60 rpm'ye ayarlayın ve stimülasyon parametrelerini önceden ayarlayın.İnsan kalp dilimleri için, standart stimülasyonu 50 miliamper veya akımla bifazik impulslara ayarlayın 3 milisaniye pozitif akım, 1 milisaniye duraklama ve dakikada 30 atım veya bpm hızında 3 milisaniyelik ters akım darbesinden oluşan bir akım, ardından yazılımın elektrot göstergelerini kontrol edin ve yetiştirme odalarının elektrotlarının doğru çalıştığını doğrulayın. Cımbız kullanarak, agarozu dokudan ayırın. Dokuya dokunmaktan kaçının ve dokuya verilen herhangi bir hasar yetiştiriciliğin başarı oranını azaltacağından dikkatlice kullanın.Bir numuneye iki plastik üçgen takmak için, steril bir Petri kabı kapağına 1 mikrolitre yapıştırıcı yerleştirin. Otoklavlanmış bir plastik üçgeni almak için kancalı bir cımbız kullanın. Üçgenin ön kenarını hızlı bir şekilde yapıştırıcıya batırın ve üçgeni kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak numuneye yapıştırın.Diğer üçgen için bu işlemi tekrarlayın. Bir neşter kullanarak, üçgen genişliğini aşan dokuyu kesin ve iki monte edilmiş üçgenle dilimi, dilimleme tamponu içeren kesme tepsisine geri yerleştirin. Orta dolgulu ekim odasını inkübatörden çıkarın.Hazırlanmış bir dilim seçin ve her pime bir üçgen bağlayarak hazneye yerleştirin. Montaj pimleri arasındaki mesafeyi numune boyutuna göre ayarlayın. Numunenin ortama batırıldığından emin olun.Çanağı rocker'a yerleştirdikten sonra, bilgisayar ekranındaki ilgili grafiğin taban çizgisi artık değişmeyene kadar ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ön yükü azaltın, ardından ayar vidasını saat yönünde çevirerek ön yükü veya gerilimi dikkatlice artırın. Yüksek sertliğe sahip odalar için, grafikteki karşılık gelen taban çizgisi bir milinewton ön yüke karşılık gelen 1.000 ila 1.200 birim artana kadar devam edin. Taze ekim ortamını hazırladıktan sonra, ortamı bir su banyosunda veya sıcak hava inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika önceden ısıtın.Haznede yaklaşık 0,8 mililitre bırakarak ortamı odadan çıkarın, ardından aynı odaya 1,6 mililitre taze ortam ekleyin ve oda başına toplam orta ila 2,4 mililitre hacim yapın. Son olarak, odanın kapağını geri yerleştirin ve yetiştirme odasını kendi konumuna yerleştirin. Tipik bir stimülasyon sırasında beş miyokard diliminin kasılmasının okunması, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter periyodun dört ayrı bölümünden oluşuyordu.Kontrol ile karşılaştırıldığında, kalsiyum antagonistleri, nifedipin ve kalsiseptin ile muamele edilen dilimlerin kasılma kuvveti 10 dakika içinde azaltıldı. Buna karşılık, voltaj kapılı kalsiyum kanal agonisti Bay-K8644, büzülme kuvvetini arttırdı. Kontrol ve tedavi edilen dilimlerin duraklama sonrası potansiyeli, sarkoplazmik retikulumdan hücre içi kalsiyum salınımı açısından değerlendirildi.Denetim dilimi herhangi bir değişiklik göstermedi. Kalsiseptin ve nifedipin varlığında, L-tipi kalsiyum kanallarının inhibisyonu 50 saniyelik bir duraklamadan sonra ilk kasılmanın güçlendirilmesine yol açmıştır ve hücre içi kalsiyum salınımının toplam kontraktiliteye daha yüksek bir göreceli katkısını yansıtmaktadır. Ters etki, hücre dışı kalsiyumun L-tipi kalsiyum kanallarından girişini uyaran Bay-K8644 ile gözlenmiştir.Kuvvet-frekans ilişkisi analizinde kontrol diliminde herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Kalsiseptin tedavisi, tedavi öncesi ve sonrası verileri karşılaştırırken stimülasyon sıklığının artması üzerine dilimin uyaranları takip etme yeteneğini değiştirmedi. Kalsiseptin ile karşılaştırıldığında, nifedipin daha yüksek tempolu oranlarda kontraktilitede bir artışı önledi ve maksimum yakalama oranını 80 bpm'de düşürdü.Bay-K8644 ile çok düşük stimülasyon frekanslarında artan büzülme kuvveti gözlendi. Bununla birlikte, 50 bpm'den daha yüksek frekanslarda, kasılma kuvveti ön işlem durumundan daha düşüktü. Eksize edilen doku hızlı bir şekilde 4 derece kardiyoplejiye aktarılmalıdır.Dilimlemeden sonra, plastik üçgenler lif yönüne dik olarak tutturulmalıdır. Ön yük 1500 milinewtonu geçmemelidir. Biyomimetik dilim kültürü, araştırmacıların yetişkin insan miyokardında rejenerasyon ve onarımı incelemek için genetik manipülasyonların yanı sıra hücre bazlı terapileri kullanmalarına yardımcı olabilir.

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Endotel Keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Tıp

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

Yenidoğan Domuzların Lenf Bağırsak Lenf Trunk ve Koleksiyonu Uzun Vadeli Kateterizasyon

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

Domuz uzun süreli Kardiyovasküler Egzersiz Testi için Kateter Cerrahi Yerleştirme

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. Indeed, research focusing on the discovery of new potential therapeutic targets using genetically altered mice requires a reliable, long-term assessment of the systemic arterial pressure variation. Currently, the gold standard for obtaining long-term measurements of blood pressure in ambulatory mice uses implantable radio-transmitters, which require&#160;artery cannulation. This technique eliminates the need for tethering, restraining, or anesthetizing the animals which introduce stress and artifacts during data sampling. However, arterial blood pressure monitoring in mice via catheterization can be rather challenging due to the small size of the arteries. Here we present a step-by-step guide to illustrate the crucial key passages for a successful subcutaneous implantation of radio-transmitters and carotid artery cannulation in mice. We also include examples of long-term blood pressure activity taken from freely moving mice after a period of post-surgery recovery. Following this procedure will allow reliable direct blood pressure recordings from multiple animals simultaneously.

The goal of this protocol is to assess systemic blood pressure in conscious freely moving mice using implantable radio-telemetry devices.

Telemetri kullanarak Serbestçe Hareketli Fare Uzun süreli Tansiyon Ölçümü

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Tüm kalp Miyokard Doku Analizi

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

Kapalı göğüs domuz miyokard infarktüsü manken standardizasyon doku ve kan örnekleme prosedürleri tarafından geliştirilmesi

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Farelerde Aritmileri Tespit Etmek için Uzun Süreli Elektrokardiyografi Kayıtlarının Analizi

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).