Name: non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment
Uploaded: 2022-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) og NIH R01 CA233188 (MB). Vi vil gerne takke AMC Pharmacy for Trastuzumab leveret til disse eksperimenter.

AU565 (HER2+) og MDA-MB-231 brystkræftcellelinjer blev anvendt til denne undersøgelse (se Materialetabel).
1. Forberedelse af tumoraggregater
<ol><li>Forbered AU565 (HER2+) brystkræftcellevækstmedier ved hjælp af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalmedium (+) i L-glutamin suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin (se materialetabel).</li>
	<li>Forbered MDA-MB-231 triple-negative brystkr?...

<ol>
	<li>Sutherland, R., JA, M., Inch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas.">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiscale+model+for+avascular+tumor+growth.">A multiscale model for avascular tumor growth.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).</li><li>Freyei, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+saturation+and+development+of+necrosisin+EMT6/R0+multicellular+spheroids+by+the+glucose+and+oxygen+supply.">Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply.</a> Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).</li><li>Desoize, B., Jardillier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+resistance:+a+paradigm+for+clinical+resistance.">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).</li><li>Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+quiescent+tumour+microregions+for+evaluating+multicellular+resistance+to+chemotherapeutic+drugs.">A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs.</a> British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).</li><li>Roberge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+tumor+aggregate+morphology+and+viability+quantification+at+cellular+resolution,+during+development+and+in+response+to+drug.">Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug.</a> Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).</li><li>Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-image+based+methods+used+for+non-invasive+volume+estimation+of+cancer+spheroids+a+practical+assessing+approach+based+on+entry-level+equipment.">Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer.">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+multicellular+tumor+spheroids+towards+optimized+treatment+for+patients+with+hepatocellular+carcinoma.">Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).</li><li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer.">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+HHS+public+access.">Optical coherence tomography HHS public access.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>Zhong, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+permeability+of+glycerol+with+ultrasound+in+human+normal+and+cancer+breast+tissues+in+vitro+using+optical+coherence+tomography.">Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography.</a> Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).</li><li>Fujimoto, J., Swanson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+commercialization,+and+impact+of+optical+coherence+tomography.">The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+detects+necrotic+regions+and+volumetrically+quantifies+multicellular+tumor+spheroids.">Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).</li><li>Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+complements+confocal+microscopy+for+investigation+of+multicellular+tumour+spheroids.">Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>El-Sadek, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+dynamics+optical+coherence+tomography+for+tumor+spheroid+evaluation.">Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation.</a> Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).</li><li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-based+3D+bioprinting+for+spatial+and+size+control+of+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies.">Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies.</a> Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).</li><li>Absher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocytometer+counting.">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal,+label-free+assessment+of+cell+density+and+viability+in+multicellular+tumor+spheroids+via+optical+coherence+tomography.">Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography.</a> Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).</li><li>Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+morphological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+3D+spheroids+built+with+a+rapid+method+based+on+entry-level+equipment.">Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment.</a> Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).</li><li>Noto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stearoyl-CoA+desaturase-1+is+a+key+factor+for+lung+cancer-initiating+cells.">Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 4 (12), 947 (2013).</li><li>Riffle, S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+cell+adaptations+to+hypoxia+in+multicellular+tumor+spheroids.">Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).</li><li>Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+the+oxygen+consumption+rate+in+multicellular+tumour+spheroids.">A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Pozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+me+halfway:+Are+in+vitro+3D+cancer+models+on+the+way+to+replace+in+vivo+models+for+nanomedicine+development.">Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).</li><li>. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: <a target="_blank" href="https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf">https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf</a> (2015)</li><li>Duchnowska, R., Szczylik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+metastases+in+breast+cancer+patients+administered+trastuzumab.">Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab.</a> Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).</li><li>Zazo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+characterization,+and+maintenance+of+trastuzumab-resistant+HER2++breast+cancer+cell+lines.">Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines.</a> American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).</li></ol>

Betydning Multicellulære tumor sfæroider (MCTS'er) er kraftfulde 3D in vitro-modeller til undersøgelse af tumorprogression og lægemiddelscreening 1,2,3. Fremme af nytten af disse relativt enkle aggregerede modeller er stærkt afhængig af karakteriseringen af deres nøglefunktioner, såsom morfologi og celletæthed, som vides at påvirke både tumormodelprogression og terapeutisk respons. Deres n...

Forskere har stort set henvendt sig til benchtop 3D-kultur in vitro-systemer for at studere nogle af de vigtigste træk ved tumorprogression. Meget af denne forskning er blevet ledet af genopståelsen af multicellulære tumorfæroider (MCTS'er) og mere komplekse organoider 1,2. Selvom disse modeller er avaskulære, giver de et kraftfuldt værktøj til rekapitulering af fysiologiske og patologiske processer, der forekommer in vivo 3,4,5. Især mellemstore modeller (300-500 μm diameter) kan efterligne nøgletumorfunktioner såsom 3D-struktur, patofysiologiske gradienter og metastatisk signalering på grund af hypoxi i kernen. Det er veldokumenteret, at disse modeller viser de karakteristiske koncentriske lag, der ses i vaskulariserede in vivo-tumorer, nemlig et ydre lag af proliferative celler, et overgangslag af senescente/hvilende celler og celler, der oplever hypoxi i kernen 3,6,7,8,9 . Unik indsigt kan opnås fra disse modeller ved at karakterisere celleadfærd inden for disse lag, under udvikling og som reaktion på lægemidlet. Den nødvendige MCTS-størrelse, der er nødvendig for at udvikle gradienterne, der gør dem til så kraftfulde in vitro-modeller, begrænser imidlertid drastisk de værktøjer, der anvendes til ikke-destruktiv vurdering. Faktisk er en af de største udfordringer med ikke-destruktiv analyse af MTCS'er kvantificering af celleskaladetaljer. Lysfelt- og fasekontrastmikroskopi bruges rutinemæssigt til at vurdere 3D MCTS'er vækst og udvikling ikke-destruktivt. Disse modaliteter er imidlertid begrænset til 2D-fremskrivninger og mangler kapacitet til at visualisere den afgørende 3D-struktur af disse modeller 10,11,12,13. Oplysninger om cytotoksicitet og celleproliferation indsamles typisk gennem fluorescerende billeddannelse (dvs. lysarkmikroskopi, konfokal mikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk farvning 14,15,16. Mens disse tilgange giver værdifuld information i høj opløsning om vævsstruktur, cellulær tæthed og cellulær funktion, kræver de ofte prøveforberedelse såsom optisk rydning, fastgørelse / farvning eller indlejring, der forhindrer langsgående analyser.
Optisk kohærenstomografi (OCT) er en ikke-destruktiv strukturel billeddannelsesmodalitet, der har potentialet til at overvinde nogle af de ovennævnte udfordringer. Det kan prale af cellulær opløsning og et tilstrækkeligt bredt synsfelt (op til 10 mm x 10 mm), der er i stand til at visualisere hele flercellede aggregater 17,18,19. På grund af det anvendte lyss synlige natur er det vigtigt, at denne teknik er fuldstændig ikke-destruktiv og etiketfri17. Prøver kan også afbildes in situ uden at kræve prøveforberedelse, således at prøver kan tages direkte fra inkubatoren, hurtigt scannes med OCT (scanningsvarighed ~ 5-10 min) og derefter returneres til inkubatoren, hvilket muliggør langsgående karakterisering. Mange undersøgelser, der søger at bruge OCT til at analysere tumor sfæroid adfærd er for nylig dukket op. I en af de mest spændende demonstrationer brugte Huang et al. OCT til ikke-destruktivt at detektere nekrotiske kerner inden for store tumorfæroide modeller og bemærkede, at levende og døde celleområder har mærkbare forskelle i optisk dæmpning, som kan bruges til etiketfri levedygtighedsovervågning20. Tilsvarende udførte Hari et al. brydningsindeks (RI) målinger af human tyktarmskræft (HCT116) sfæroider afbildet med OCT for at studere tilstedeværelsen af hypoxi i prøverne21. Deres målinger var ikke tilstrækkelige til direkte slutninger, selvom de observerede lavere RI på steder, der korrelerede med stedet, men ikke størrelsen, af nekrotiske kerner, senere identificeret via konfokal mikroskopi. Abd El-Sadek et al. brugte OCT til at visualisere og kvantificere regional vævslevedygtighed af brystkræfttumormodeller22. De rapporterede to OCT-baserede metoder til visualisering af vævsdynamik og viste en moderat sammenhæng mellem forskelle i disse målinger og mikroskopi-identificerede regioner af levende / døde celler.
Vores offentliggjorte arbejde ved hjælp af OCT byggede på denne tidligere litteratur for at etablere en kvantitativ, ikke-destruktiv tilgang til måling af 3D-morfologien og celletallet inden for MCTS'er brystkræftmodeller under udvikling10,23. Ved hjælp af Imaris 3D-gengivelsesbilledanalysesoftware til at tælle antallet af objekter i cellestørrelse (dvs. pletter) afbildet inden for OCT-volumenscanningerne blev celletællingerne ikke-destruktivt målt i MCTS'er, der statistisk lignede dem, der blev bestemt via hæmocytometer ved samlet dissociation. På grund af OCT's strukturelle karakter kan cellemembraner, der stadig er til stede efter celledød ved nekrose, imidlertid fejlagtigt tælles som levende celler. Desuden blev denne karakterisering udvidet til ikke-destruktivt at spore cellelevedygtighed inden for individuelle aggregater, der blev udsat for et lægemiddelregime med lovende succes10. Det er vigtigt, at det blev bemærket, at lignende cellelevedygtighed blev rapporteret fra vores OCT-Imaris-tilgang med det, der blev benchmarket inden for disse prøver ved dissociation. Denne ikke-destruktive og etiketfrie celletilgang gør det muligt at tælle celler inden for 3D-konstruktioner og tætte aggregater i længderetningen uden at ofre konstruktionen / aggregatstrukturen.
Dette arbejde rapporterer om en forbedret tilgang til direkte kvantificering af regional celletæthed inden for tætte aggregater ved at udnytte OCT-Imaris evne til at måle både 3D-aggregeret morfologi og celleantal. Dette metodologiske fremskridt giver et mere detaljeret billede af cellernes rumlige fordeling og spredning inden for de karakteristiske koncentriske lag af MCTS-modeller. I stedet for blot at beregne en samlet gennemsnitlig samlet celletæthed kan sådanne lokale densitetsmålinger afsløre celletæthedsgradienter, såsom dem, der er forbundet med komprimering. Denne regionale vurdering anvendes også på aggregater behandlet med kemoterapeutisk til vurdering af regionalt lægemiddelrespons målt ved ændringer i lokal celletæthed. Denne kombination af OCT og avancerede billedanalysemetoder giver kvantificering af regional cellelevedygtighed, som kan bruges til at undersøge lægemiddelindtrængning baseret på hvilke regioner der oplever fald i celletæthed. Dette er den første rapport til ikke-destruktiv kvantificering af regional celletæthed og levedygtighed som reaktion på lægemidlet i tætte cellulære væv og måler det i længderetningen. En sådan karakterisering af tredimensionel celletæthed og rumlig fordeling gennem hele MCTS'er kan hjælpe med at optimere lægemiddelafgivelse i kræftbehandling og forbedre forståelsen af kræftmodelprogression.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>650970</td>
			<td>CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AU565 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Current version 9.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z1 AxioVision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-0002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Domain Optical Coherence Tomography</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TEL220C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment

Multicellulære tumor spheroid (MCTS'er) modeller har vist stigende nytteværdi for in vitro undersøgelse af kræftprogression og lægemiddelopdagelse. Disse relativt enkle avaskulære konstruktioner efterligner nøgleaspekter af in vivo tumorer, såsom 3D-struktur og patofysiologiske gradienter. MCTS-modeller kan give indsigt i kræftcelleadfærd under sfæroidudvikling og som reaktion på lægemidler; deres nødvendige størrelse begrænser imidlertid drastisk de værktøjer, der anvendes til ikke-destruktiv vurdering. Optisk kohærens Tomografi strukturel billeddannelse og Imaris 3D-analysesoftware udforskes til hurtig, ikke-destruktiv og etiketfri måling af regional celletæthed inden for MCTS'er. Denne tilgang anvendes til at vurdere MCTS'er over en 4-dages modningstid og gennem en forlænget 5-dages behandling med Trastuzumab, et klinisk relevant anti-HER2-lægemiddel. Kort fortalt blev AU565 HER2+ brystkræft-MCTS'er skabt via flydende overlay med eller uden tilsætning af Matrigel (en kældermembranmatrix) for at udforske aggregater af forskellige morfologier (henholdsvis tykkere, disklignende 2.5D-aggregater eller flade 2D-aggregater). Celletæthed inden for det ydre område, overgangsregionen og den indre kerne blev karakteriseret i modne MCTS'er, hvilket afslørede en celletæthedsgradient med højere celletætheder i kerneområder sammenlignet med ydre lag. Matrixtilsætningen omfordelte celletætheden og forbedrede denne gradient, hvilket reducerede ydre zonetæthed og øgede cellekomprimeringen i kernerne. Celletætheden blev kvantificeret efter lægemiddelbehandling (0 timer, 24 timer, 5 dage) inden for gradvist dybere 100 μm zoner for at vurdere potentielle regionale forskelle i lægemiddelrespons. På det endelige tidspunkt syntes næsten al celledød at være begrænset til de ydre 200 μm af hvert aggregat, mens celler dybere i aggregatet syntes stort set upåvirket, hvilket illustrerer regionale forskelle i lægemiddelresponset, muligvis på grund af begrænsninger i lægemiddelindtrængning. Den nuværende protokol giver en unik teknik til ikke-destruktivt at kvantificere regional celletæthed i tætte cellulære væv og måle den i længderetningen.

I en tidligere publikation blev der etableret en metode til ikke-destruktiv måling af global celletæthed inden for cellulære aggregater ved hjælp af OCT10. Heri udvides denne teknik til at vurdere den regionale celletæthed af udviklende celleaggregater. Figur 1 viser en skematisk oversigt over denne udvidelse, hvor celletætheden kan evalueres i koncentriske lag af en sfæroid eller mere lokalt ved i stedet at se på små (100 μm diameter) sfæriske stik, betegn...

Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Den nuværende protokol udvikler en billedbaseret teknik til hurtig, ikke-destruktiv og etiketfri regional celletæthed og levedygtighedsmåling inden for 3D-tumoraggregater. Resultaterne afslørede en celletæthedsgradient med højere celletætheder i kerneområder end ydre lag i udviklingsaggregater og overvejende perifer celledød i HER2+ aggregater behandlet med Trastuzumab.

Ikke-destruktiv evaluering af regional celletæthed inden for tumoraggregater efter lægemiddelbehandling

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Denne protokol giver information om tumormodelprogression på en ikke-destruktiv måde. Det giver også indikationer på terapeutisk respons gennem hele lægemiddelregimer inden for ental aggregater snarere end at stole på aldersmatchprøver. Konventionelle metoder til opnåelse af celletæthed og levedygtighed inden for aggregater kræver prøvefiksering og sektionering, mens vores leverer data ikke-destruktivt.Så ændringer kan spores inden for et enkelt aggregat over tid. Denne teknik forventes at forbedre vores forståelse af lægemiddelrespons inden for diskrete regioner af aggregerede modeller med konsekvenser for, hvor godt disse modeller afspejler in vivo-respons og lægemiddelscreeningsapplikationer. Til at begynde med skal du forberede 70 til 90% sammenløbscellekulturer af de ønskede cellelinjer under standardbetingelser.Løsrevne cellemonolag fra deres kulturkolber efter standard trypsiniseringsmetoden og tilsæt cellesuspensionen i et centrifugerør. Tilsæt 10 mikroliter af cellesuspensionen til et hæmocytometer og tæl via mikroskopi for at bestemme antallet af celler i suspensionen. Pelletceller via centrifugering og resuspendceller i medier ved den ønskede koncentration på 2,5 gange 10 til de femte celler pr. Milliliter.For suspensioner fremstillet med kældermembranmatrixen fjernes matrixhætteglasset fra minus 20 grader Celsius opbevaring og anbringes i køleskabet for at optø natten over. Forbered en beholder med vækstmedier og afkøles i 10 minutter for at køle af. Ved hjælp af en frossen pipettespids tilsættes matrixen til kølemedier, således at den endelige koncentration af denne opløsning er 5%Tilsæt 50 mikroliter af dette medie til hver brønd i en rundbundet, ikke-klæbende 96-brøndplade, således at den endelige koncentration af matrix i disse brønde vil være 2,5% efter tilsætning af cellesuspension.For suspensioner fremstillet uden matrix tilsættes 50 mikroliter almindeligt vækstmedie til hver brønd. Dispenser 50 mikroliter cellesuspension i hver brønd. Pladerne centrifugeres ved 123 G i 10 minutter ved stuetemperatur umiddelbart efter såning for at sikre opsamling af en cellepellet i bunden af hver brønd.Brug et OCT-system til strukturel billeddannelse. Indstil A-scanningshastigheden til 5,5 kilohertz for billedsamling i høj opløsning. Brydningsindekset indstilles til 1,33 for prøver i et flydende medium.I vinduet med billedparametre i højre side af skærmen skal du indstille synsfeltet ved at indtaste X-, Y- og Z-værdier, så prøven er omfattet af dette interesseområde. Klik på 3D Acquisition Mode, og klik derefter på Record for at indsamle 3D-volumenscanningen af prøven. For at oprette volumenrekonstruktion skal du åbne Imaris og navigere til den konverterede TIF-fil inden for deres arena.Gå til redigering, klik derefter på Billedegenskaber, og indtast voxelstørrelsen fra OCT-billedet i de tilsvarende XYZ-felter. Klik derefter på OK. Klik på Tilføj nye overflader over objekttræet. I menuen under træet skal du klikke på Spring automatisk oprettelse over og redigere manuelt.I displayjusteringsvinduet skal du manuelt skubbe de røde og sorte pile for at forbedre kontrasten mellem prøven og baggrunden og forbedre eksempelvisualiseringen. Juster udsnitspositionen til udsnittet i den ene kant af prøven. Brug escape-tasten til at ændre musen fra navigationstilstand til valgtilstand, og klik derefter på Tegn.Spor manuelt omridset af det område, der viser signalet. Fremskynd udsnitspositionen ved at indtaste den næste placering i indtastningsfeltet. Denne næste position skal være mindre end eller lig med 100 skiver længere inde i prøven end den foregående.Spor manuelt det område, der viser signalet. Dette trin gentages gennem prøvens tykkelse, indtil den modsatte kant af prøven er nået. Klik derefter på Opret overflade og venstre menu for at sy disse skiver sammen.Til sidst skal du klikke på Rediger, derefter klikke på Maskevalg og derefter klikke på OK for at fuldføre volumenrekonstruktionen. Hvis du vil opnå prøvens samlede celletæthed, skal du vælge Tilføj nye pletter. I menuen algoritmeindstillinger skal du fravælge alle felter.Klik på den blå pil for at flytte til kildekanalskærmen. Fra rullemenuen, der vises, skal du vælge Maskeret kanal. Indtast den gennemsnitlige cellediameter for prøven i boksen med XY-diameter.Sørg for, at baggrundsstraktion er markeret. Klik på den blå pil for at gå til klassificerstedets skærm. I grafen nederst i menuen skal du klikke og trække venstre kant af den gule tærskel til venstre kant af grafen, så alle objekter er inkluderet i den gule skraverede tærskel.Klik derefter på den grønne pil for at fuldføre oprettelsen af stedet. Få antallet af identificerede objekter ved at klikke på Statistik. Klik derefter på Samlet og klik til sidst på Samlet antal pletter.Klik på den oprettede overflade, og naviger til fanen overfladestilkvalitet. Skift markering til Midtpunkt, og skift pixelbredde til mindre end lig med 20 for at opnå den bedste synlighed. Naviger til Statistik.Klik derefter på Detaljeret efterfulgt af Position og registrer placeringen på det midterste sted. Vælg Tilføj ny referenceramme i menuen over objekttræet. Marker de synlige og faste felter ved siden af X, Y i menuen.Klik og træk midten af referencerammeikonet, så det er på linje med midtpunktet. Fravælg XY synlige og rette felter, og vælg dem til XZ. Klik igen og træk midten af referencerammeikonet, så det er på linje med midtpunktet. Til sidst gentages dette for YZ-planet, skiftevis mellem disse tre faste planer, indtil referencerammen passer perfekt til midtpunktet.Dobbeltklik på referencerammen i objekttræet og omdøb den til midten eller lignende. Klik på de oprettede spots, og naviger til Statistik. Klik derefter på Detaljeret efterfulgt af Positionsreferenceramme.Klik på position X referenceramme, indtil den sorterer fra højeste til laveste værdi. Registrer den højeste værdi for at opnå aggregaternes radius. Udfør manuelle beregninger for at bestemme yderligere steder af interesse.For at gøre dette skal du tilføje 100 mikrometer til X-centerværdien og derefter bruge Y- og Z-værdierne for midtpunktet til at definere den første placering langs midteraksen. Vælg Tilføj nye pletter. Vælg derefter Spring automatisk oprettelse over rediger manuelt.Hold skift-knappen på tastaturet nede, og klik et vilkårligt sted på skærmen for at placere et nyt sted. Indtast XYZ-positionsværdierne for den første placering af interesse. Vælg derefter Tilføj ny referenceramme, og juster den over stedet.Tilføj 100 mikrometer til hver sekventiel X-placering. Den sidste referenceramme anbringes mindre end 50 mikrometer væk fra prøvens ydre radius. Klik på de oprettede spots, og naviger til Statistik.I nederste højre hjørne af menuen skal du klikke på Eksporter alle statistikker til fil og gemme data i et regneark. Åbn regnearket. Naviger til fanen Afstand fra oprindelsesreferenceramme.Brug modfunktionen til numerisk at tildele hver afstand til den tilsvarende referenceramme. Filtrer værdierne i denne kolonne for at arbejde med afstandene i hver referenceramme. For hver af referencerammerne beregnes antallet af objekter inden for 50 mikrometer fra rammen ved hjælp af funktionen COUNTIF.Den resulterende værdi svarer til antallet af celler i det regionale stik. Divider denne værdi med volumenet af 100 mikrometerproppen for at opnå celletæthed. Studentens T-test afslørede signifikant højere celletæthed i den sfæroide kerne end i overgangs- og ydre lag for MDA-MB-231 sfæroidmodeller.Resultatet indikerer komprimering i denne sfæroide kerne efter fire dage. Inden for både AU565- og MDA-MB-231-aggregerede modeller synes tilføjelsen af matrixen ikke at påvirke volumenet eller celletallet og synes således at have ubetydelig indflydelse på celleproliferation. Snarere ser matrixtilsætning ud til at omfordele celletæthed, der fremmer signifikant kernekomprimering og faldende celletæthed i de ydre lag.Disse resultater giver værdifuld indsigt i de fysiske mekanismer, hvormed matrixen muliggør celleaggregering i forskellige brystkræftcellelinjer. Ser man derefter på AU565 tumorer sfæroid fremstillet med matrix, blev modne aggregater behandlet med trastuzumab, og regional celletæthed blev evalueret gennem et fem dages lægemiddelregime. Stik blev indstillet hver 100 mikrometer i hele aggregaternes tykkelse.Mindre udsving i celletæthed blev observeret over tid inden for de indre 500 mikrometer af hvert aggregat, hvilket indikerer minimal celledød. Visualiseringen af celledød som vejledende lægemiddelrespons hovedsagelig i de ydre lag af tumorsfæroider er i overensstemmelse med lægemiddelindtrængningsproblemer med trastuzumab. Vi kan nu ikke-destruktivt måle cellelevedygtighed i aggregater uden at ofre struktur.Dette muliggør vurdering af langsgående lægemiddelrespons i ental tumoraggregater for at identificere tidsmæssige og penetrationskvaliteter af kandidat-kræftlægemidler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Prøven udvinding og samtidige kromatografiske kvantitering af Doxorubicin og Mitomycin C efter narkotika kombination levering i nanopartikler til Tumor-bærende mus

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Vurdering af gennemførlighed, sikkerhed og nøjagtighed af et intraoperativ højintensive fokuseret ultralyd enhed til behandling af lever metastaser

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofile ekstracellulære fælder genereret af Low Density neutrofiler fremstillet af Peritoneal Lavage væske mægle tumorcellevækst og vedhæftet fil

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus til Tumor immun profilering og behandling svar vurdering

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...