Name: non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment
Uploaded: 2022-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) en NIH R01 CA233188 (MB). We willen AMC Apotheek bedanken voor de Trastuzumab die voor deze experimenten is geleverd.

AU565 (HER2+) en MDA-MB-231 borstkankercellijnen werden gebruikt voor deze studie (zie Materiaaltabel).
1. Tumoraggregaten voorbereiden
<ol><li>Bereid AU565 (HER2+) groeimedia voor borstkankercellen met behulp van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basaal medium (+) in L-glutamine aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid MDA-MB-231 triple-negatieve groeimedia ...

<ol>
	<li>Sutherland, R., JA, M., Inch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas.">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiscale+model+for+avascular+tumor+growth.">A multiscale model for avascular tumor growth.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).</li><li>Freyei, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+saturation+and+development+of+necrosisin+EMT6/R0+multicellular+spheroids+by+the+glucose+and+oxygen+supply.">Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply.</a> Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).</li><li>Desoize, B., Jardillier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+resistance:+a+paradigm+for+clinical+resistance.">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).</li><li>Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+quiescent+tumour+microregions+for+evaluating+multicellular+resistance+to+chemotherapeutic+drugs.">A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs.</a> British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).</li><li>Roberge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+tumor+aggregate+morphology+and+viability+quantification+at+cellular+resolution,+during+development+and+in+response+to+drug.">Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug.</a> Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).</li><li>Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-image+based+methods+used+for+non-invasive+volume+estimation+of+cancer+spheroids+a+practical+assessing+approach+based+on+entry-level+equipment.">Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer.">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+multicellular+tumor+spheroids+towards+optimized+treatment+for+patients+with+hepatocellular+carcinoma.">Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).</li><li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer.">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+HHS+public+access.">Optical coherence tomography HHS public access.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>Zhong, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+permeability+of+glycerol+with+ultrasound+in+human+normal+and+cancer+breast+tissues+in+vitro+using+optical+coherence+tomography.">Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography.</a> Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).</li><li>Fujimoto, J., Swanson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+commercialization,+and+impact+of+optical+coherence+tomography.">The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+detects+necrotic+regions+and+volumetrically+quantifies+multicellular+tumor+spheroids.">Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).</li><li>Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+complements+confocal+microscopy+for+investigation+of+multicellular+tumour+spheroids.">Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>El-Sadek, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+dynamics+optical+coherence+tomography+for+tumor+spheroid+evaluation.">Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation.</a> Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).</li><li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-based+3D+bioprinting+for+spatial+and+size+control+of+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies.">Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies.</a> Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).</li><li>Absher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocytometer+counting.">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal,+label-free+assessment+of+cell+density+and+viability+in+multicellular+tumor+spheroids+via+optical+coherence+tomography.">Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography.</a> Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).</li><li>Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+morphological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+3D+spheroids+built+with+a+rapid+method+based+on+entry-level+equipment.">Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment.</a> Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).</li><li>Noto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stearoyl-CoA+desaturase-1+is+a+key+factor+for+lung+cancer-initiating+cells.">Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 4 (12), 947 (2013).</li><li>Riffle, S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+cell+adaptations+to+hypoxia+in+multicellular+tumor+spheroids.">Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).</li><li>Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+the+oxygen+consumption+rate+in+multicellular+tumour+spheroids.">A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Pozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+me+halfway:+Are+in+vitro+3D+cancer+models+on+the+way+to+replace+in+vivo+models+for+nanomedicine+development.">Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).</li><li>. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: <a target="_blank" href="https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf">https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf</a> (2015)</li><li>Duchnowska, R., Szczylik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+metastases+in+breast+cancer+patients+administered+trastuzumab.">Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab.</a> Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).</li><li>Zazo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+characterization,+and+maintenance+of+trastuzumab-resistant+HER2++breast+cancer+cell+lines.">Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines.</a> American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).</li></ol>

Betekenis Meercellige tumorsferoïden (MCTS'en) zijn krachtige 3D in vitro modellen voor het bestuderen van tumorprogressie en medicijnscreening 1,2,3. Het bevorderen van het nut van deze relatief eenvoudige geaggregeerde modellen is sterk afhankelijk van de karakterisering van hun belangrijkste kenmerken, zoals morfologie en celdichtheid, waarvan bekend is dat ze zowel de progressie van tumormodelle...

Onderzoekers hebben zich grotendeels gewend tot benchtop 3D-cultuur in vitro systemen om enkele van de belangrijkste kenmerken van tumorprogressie te bestuderen. Veel van dit onderzoek is geleid door de heropleving van meercellige tumorsferoïden (MCTS'en) en complexere organoïden 1,2. Hoewel deze modellen avasculair zijn, bieden ze een krachtig hulpmiddel voor het samenvatten van fysiologische en pathologische processen die in vivo plaatsvinden 3,4,5. Met name middelgrote modellen (diameter 300-500 μm) kunnen belangrijke tumorkenmerken nabootsen, zoals 3D-structuur, pathofysiologische gradiënten en gemetastaseerde signalering als gevolg van hypoxie in de kern. Het is goed gedocumenteerd dat deze modellen de karakteristieke concentrische lagen vertonen die worden gezien in gevasculariseerde in vivo tumoren, namelijk een buitenste laag proliferatieve cellen, een overgangslaag van senescente / rustende cellen en cellen met hypoxie in de kern 3,6,7,8,9 . Uniek inzicht kan worden verkregen uit deze modellen door celgedrag binnen deze lagen, tijdens de ontwikkeling en in reactie op het medicijn te karakteriseren. De vereiste MCTS-grootte, die nodig is om de gradiënten te ontwikkelen die ze zulke krachtige in vitro modellen maken, beperkt echter drastisch de hulpmiddelen die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Inderdaad, een van de grootste uitdagingen met niet-destructieve analyse van MTCS'en is het kwantificeren van details op celschaal. Bright-field en fasecontrastmicroscopie worden routinematig gebruikt om de groei en ontwikkeling van 3D MCTSs niet-destructief te beoordelen. Deze modaliteiten zijn echter beperkt tot 2D-projecties en missen de capaciteit om de cruciale 3D-structuur van deze modellen te visualiseren 10,11,12,13. Informatie over cytotoxiciteit en celproliferatie wordt doorgaans verzameld via fluorescerende beeldvorming (d.w.z. light-sheet microscopie, confocale microscopie) of ex vivo immunohistologische kleuring 14,15,16. Hoewel deze benaderingen waardevolle informatie met hoge resolutie bieden over weefselstructuur, cellulaire dichtheid en cellulaire functie, vereisen ze vaak monstervoorbereiding zoals optische clearing, fixatie / kleuring of inbedding die longitudinale analyses voorkomt.
Optical Coherence Tomography (OCT) is een niet-destructieve structurele beeldvormingsmodaliteit die het potentieel heeft om enkele van de bovengenoemde uitdagingen te overwinnen. Het beschikt over cellulaire resolutie en een voldoende breed gezichtsveld (tot 10 mm x 10 mm) dat in staat is om volledige meercellige aggregaten 17,18,19 te visualiseren. Belangrijk is dat vanwege de zichtbare aard van het gebruikte licht, deze techniek volledig niet-destructief en labelvrij is17. Ook kunnen monsters in situ worden afgebeeld zonder monstervoorbereiding, zodat monsters rechtstreeks uit de incubator kunnen worden genomen, snel kunnen worden gescand met OCT (scanduur ~ 5-10 min) en vervolgens kunnen worden teruggebracht naar de incubator, waardoor longitudinale karakterisering mogelijk is. Veel studies die OCT willen gebruiken om het gedrag van tumorsferoïden te analyseren, zijn onlangs naar voren gekomen. In een van de meest opwindende demonstraties gebruikten Huang et al. OCT om niet-destructief necrotische kernen te detecteren in grote tumorsferoïde modellen, waarbij ze opmerkten dat levende en dode celgebieden waarneembare verschillen in optische verzwakking hebben, die kunnen worden gebruikt voor labelvrije levensvatbaarheidsmonitoring20. Evenzo voerden Hari et al. refractieve index (RI) metingen uit van menselijke darmkanker (HCT116) sferoïden afgebeeld met OCT om de aanwezigheid van hypoxie in de monsters te bestuderen21. Hun metingen waren niet voldoende voor directe gevolgtrekkingen, hoewel ze wel een lagere RI waarnamen op locaties die correleerden met de site, hoewel niet de grootte, van necrotische kernen, later geïdentificeerd via confocale microscopie. Abd El-Sadek et al. gebruikten OCT om de regionale levensvatbaarheid van borstkankertumormodellen te visualiseren en te kwantificeren22. Ze rapporteerden twee OCT-gebaseerde methoden voor het visualiseren van weefseldynamica en toonden een matige correlatie tussen verschillen in deze statistieken en microscopie-geïdentificeerde regio's van levende / dode cellen.
Ons gepubliceerde werk met oct bouwde voort op deze eerdere literatuur om een kwantitatieve, niet-destructieve benadering vast te stellen om de 3D-morfologie en celtelling binnen MCTSs borstkankermodellen te meten tijdens de ontwikkeling10,23. Met behulp van Imaris 3D rendering beeldanalysesoftware om het aantal objecten ter grootte van een cel (d.w.z. vlekken) te tellen dat in beeld werd gebracht binnen de OCT-volumescans, werden de celtellingen niet-destructief gemeten in MCTS'en die statistisch vergelijkbaar waren met die bepaald via hemocytometer bij geaggregeerde dissociatie. Vanwege de structurele aard van OCT kunnen celmembranen die nog steeds aanwezig zijn na celdood door necrose echter ten onrechte worden geteld als levende cellen. Bovendien werd deze karakterisering uitgebreid tot het niet-destructief volgen van de levensvatbaarheid van cellen binnen individuele aggregaten onderworpen aan een medicijnregime met veelbelovend succes10. Belangrijk is dat werd opgemerkt dat vergelijkbare levensvatbaarheid van cellen werd gerapporteerd vanuit onze OCT-Imaris-benadering met wat werd gebenchmarkt in deze monsters bij dissociatie. Deze niet-destructieve en labelvrije celbenadering maakt het mogelijk om cellen te tellen binnen 3D-constructies en dichte aggregaten in de lengterichting zonder de construct / aggregaatstructuur op te offeren.
Het huidige werk rapporteert een verbeterde aanpak om de regionale celdichtheid binnen dichte aggregaten direct te kwantificeren door gebruik te maken van het vermogen van OCT-Imaris om zowel de morfologie van 3D-aggregaten als het celgetal te meten. Deze methodologische vooruitgang biedt een gedetailleerder beeld van de ruimtelijke verdeling en proliferatie van cellen binnen de karakteristieke concentrische lagen van MCTSs-modellen. In plaats van simpelweg een totale gemiddelde geaggregeerde celdichtheid te berekenen, kunnen dergelijke lokale dichtheidsmetingen celdichtheidsgradiënten onthullen, zoals die geassocieerd met verdichting. Deze regionale beoordeling wordt ook toegepast op aggregaten die worden behandeld met een chemotherapeuticum om de regionale geneesmiddelrespons te beoordelen, zoals gemeten door veranderingen in de lokale celdichtheid. Deze combinatie van OCT- en geavanceerde beeldvormingsanalysemethoden biedt kwantificering van de levensvatbaarheid van regionale cellen, die kan worden gebruikt om de penetratie van geneesmiddelen te onderzoeken op basis van welke regio's een afname van de celdichtheid ervaren. Dit is het eerste rapport dat de regionale celdichtheid en levensvatbaarheid niet-destructief kwantificeert als reactie op het medicijn in dichte cellulaire weefsels en het longitudinaal meet. Een dergelijke karakterisering van driedimensionale celdichtheid en ruimtelijke verdeling door hele MCTS'en kan helpen de medicijnafgifte bij de behandeling van kanker te optimaliseren en het begrip van de progressie van het kankermodel te verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>650970</td>
			<td>CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AU565 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Current version 9.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z1 AxioVision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-0002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Domain Optical Coherence Tomography</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TEL220C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment

Meercellige tumorsferoïde (MCTSs) modellen hebben een toenemend nut aangetoond voor in vitro studie van kankerprogressie en medicijnontdekking. Deze relatief eenvoudige avasculaire constructies bootsen belangrijke aspecten van in vivo tumoren na, zoals 3D-structuur en pathofysiologische gradiënten. MCTSS-modellen kunnen inzicht geven in het gedrag van kankercellen tijdens de ontwikkeling van sferoïden en als reactie op geneesmiddelen; hun vereiste omvang beperkt echter drastisch de instrumenten die worden gebruikt voor niet-destructieve beoordeling. Optische coherentie Tomografie structurele beeldvorming en Imaris 3D-analysesoftware worden onderzocht voor snelle, niet-destructieve en labelvrije meting van regionale celdichtheid binnen MCTS'en. Deze aanpak wordt gebruikt om MCTS'en te beoordelen gedurende een rijpingsperiode van 4 dagen en gedurende een verlengde 5-daagse behandeling met Trastuzumab, een klinisch relevant anti-HER2-medicijn. In het kort werden AU565 HER2 + borstkanker MCTS'en gemaakt via vloeibare overlay met of zonder de toevoeging van Matrigel (een keldermembraanmatrix) om aggregaten van verschillende morfologieën te onderzoeken (respectievelijk dikkere, schijfachtige 2,5D-aggregaten of platte 2D-aggregaten). Celdichtheid binnen het buitenste gebied, overgangsgebied en binnenkern werd gekarakteriseerd in gerijpte MCTS'en, wat een celdichtheidsgradiënt onthult met hogere celdichtheden in kerngebieden in vergelijking met buitenste lagen. De matrixtoevoeging herverdeelde de celdichtheid en verbeterde deze gradiënt, waardoor de buitenste zonedichtheid afnam en de celverdichting in de kernen toenam. De celdichtheid werd gekwantificeerd na medicamenteuze behandeling (0 h, 24 h, 5 dagen) binnen progressief diepere zones van 100 μm om potentiële regionale verschillen in geneesmiddelrespons te beoordelen. Tegen het laatste tijdspunt leek bijna alle celdood beperkt te zijn tot de buitenste 200 μm van elk aggregaat, terwijl cellen dieper in het aggregaat grotendeels onaangetast leken, wat regionale verschillen in de geneesmiddelrespons illustreert, mogelijk als gevolg van beperkingen in medicijnpenetratie. Het huidige protocol biedt een unieke techniek om de regionale celdichtheid in dichte cellulaire weefsels niet-destructief te kwantificeren en longitudinaal te meten.

In een eerdere publicatie werd een methode vastgesteld voor de niet-destructieve meting van de wereldwijde celdichtheid binnen cellulaire aggregaten met behulp van OCT10. Hierin wordt deze techniek uitgebreid om de regionale celdichtheid van ontwikkelende celaggregaten te beoordelen. Figuur 1 toont een schema van deze uitbreiding, waarbij de celdichtheid kan worden geëvalueerd in concentrische lagen van een sferoïde of meer lokaal door in plaats daarvan te kijken na...

Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Het huidige protocol ontwikkelt een beeldgebaseerde techniek voor snelle, niet-destructieve en labelvrije regionale celdichtheids- en levensvatbaarheidsmeting binnen 3D-tumoraggregaten. Bevindingen onthulden een celdichtheidsgradiënt, met hogere celdichtheden in kerngebieden dan buitenste lagen in ontwikkelende aggregaten en overwegend perifere celdood in HER2 + aggregaten behandeld met Trastuzumab.

Niet-destructieve evaluatie van regionale celdichtheid binnen tumoraggregaten na medicamenteuze behandeling

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Dit protocol geeft informatie over de progressie van tumormodellen op een niet-destructieve manier. Het geeft ook aanwijzingen voor therapeutische respons door hele medicijnregimes binnen enkelvoudige aggregaten in plaats van te vertrouwen op leeftijdsmatchmonsters. Conventionele methoden voor het verkrijgen van celdichtheid en levensvatbaarheid binnen aggregaten vereisen monsterfixatie en secties, terwijl de onze gegevens niet-destructief levert.Wijzigingen kunnen dus in de loop van de tijd binnen één aggregaat worden bijgehouden. Deze techniek zal naar verwachting ons begrip van geneesmiddelrespons binnen discrete regio's van geaggregeerde modellen verbeteren, met implicaties voor hoe goed deze modellen in vivo reacties en medicijnscreeningtoepassingen weerspiegelen. Bereid om te beginnen 70 tot 90% confluentiecelculturen van de gewenste cellijnen voor in standaardomstandigheden.Maak celmonolagen los van hun kweekkolven volgens de standaard trypsinisatiemethode en voeg de celsuspensie toe aan een centrifugebuis. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan een hemocytometer en tel via microscopie om het aantal cellen in de suspensie te bepalen. Pelletcellen via centrifugatie en resuspensiecellen in media in de gewenste concentratie van 2,5 maal 10 tot de vijfde cellen per milliliter.Voor suspensies bereid met de keldermembraanmatrix, verwijdert u de matrixflacon uit min 20 graden Celsius-opslag en plaatst u deze in de koelkast om een nacht te ontdooien. Bereid een container met groeimedia en laat 10 minuten in de koelkast afkoelen. Voeg met behulp van een bevroren pipetpunt de matrix toe aan gekoelde media, zodat de uiteindelijke concentratie van deze oplossing 5% is Voeg 50 microliter van dit medium toe aan elke put van een ronde bodem, niet-hechtende 96-well plaat, zodat de uiteindelijke concentratie van matrix in deze putten 2,5% zal zijn na toevoeging van celsuspensie.Voeg voor suspensies bereid zonder matrix 50 microliter gewone groeimedia toe aan elk putje. Doseer 50 microliter celsuspensie in elke put. Centrifugeer de platen bij 123 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onmiddellijk na het zaaien om ervoor te zorgen dat een celpellet op de bodem van elke put wordt verzameld.Gebruik een OCT-systeem voor structurele beeldvorming. Stel de A-scansnelheid in op 5,5 kilohertz voor het verzamelen van afbeeldingen met een hoge resolutie. Stel de brekingsindex in op 1,33 voor monsters in een vloeibaar medium.Stel in het venster met afbeeldingsparameters aan de rechterkant van het scherm het gezichtsveld in door X-, Y- en Z-waarden in te voeren, zodat het voorbeeld binnen dit interessegebied valt. Klik op 3D-acquisitiemodus en klik vervolgens op Opnemen om de 3D-volumescan van het monster te verzamelen. Als u een volumereconstructie wilt maken, opent u Imaris en navigeert u naar het geconverteerde TIF-bestand in hun arena.Ga naar bewerken, klik vervolgens op Afbeeldingseigenschappen en voer de voxelgrootte van de OCT-afbeelding in de overeenkomstige XYZ-vakken in. Klik vervolgens op OK. Klik op Nieuwe oppervlakken toevoegen boven de objectenstructuur. Klik in het menu onder de boomstructuur op Automatisch maken overslaan en handmatig bewerken.Schuif in het weergaveaanpassingsvenster handmatig met de rode en zwarte pijlen om het contrast tussen het voorbeeld en de achtergrond te verbeteren en de voorbeeldvisualisatie te verbeteren. Pas de segmentpositie aan op het segment aan de ene rand van het monster. Gebruik de escape-toets om de muis van de navigatiemodus naar de selectiemodus te wijzigen en klik vervolgens op Tekenen.Traceer handmatig de omtrek van het gebied waarin het signaal wordt weergegeven. Vervroeg de segmentpositie door de volgende positie in het invoervak in te voeren. Deze volgende positie moet kleiner zijn dan of gelijk zijn aan 100 plakjes verder in het monster dan de vorige.Traceer handmatig het gebied waarin het signaal wordt weergegeven. Herhaal deze stap door de dikte van het monster totdat de tegenoverliggende rand van het monster is bereikt. Klik vervolgens op Surface maken en het linkermenu om deze segmenten samen te voegen.Klik ten slotte op Bewerken, klik vervolgens op Maskerselectie en klik vervolgens op OK om de volumereconstructie te voltooien. Als u de totale celdichtheid van het monster wilt verkrijgen, selecteert u Nieuwe vlekken toevoegen. Schakel in het menu algoritme-instellingen alle vakken uit.Klik op de blauwe pijl om naar het bronkanaalscherm te gaan. Selecteer in het vervolgkeuzemenu dat verschijnt het gemaskeerde kanaal. Voer de gemiddelde celdiameter voor het monster in het vak XY-diameter in.Zorg ervoor dat achtergrondaftrek is aangevinkt. Klik op de blauwe pijl om naar het scherm van de classify spot te gaan. Klik in de grafiek onder aan het menu op de linkerrand van de gele drempel en sleep deze naar de linkerrand van de grafiek, zodat alle objecten worden opgenomen in de geel gearceerde drempel.Klik vervolgens op de groene pijl om de spotcreatie te voltooien. Verkrijg het aantal geïdentificeerde objecten door op Statistieken te klikken. Klik vervolgens op Algemeen en klik ten slotte op Totaal aantal vlekken.Klik op het gemaakte oppervlak en navigeer naar het tabblad Opmaakkwaliteit van oppervlakken. Wijzig de selectie in middelpunt en wijzig de pixelbreedte in minder dan gelijk aan 20 voor de beste zichtbaarheid. Navigeer naar Statistieken.Klik vervolgens op Gedetailleerd, gevolgd door Positie en noteer de locatie op de middelste plek. Selecteer Nieuw referentiekader toevoegen in het menu boven de objectstructuur. Vink de zichtbare en vaste vakjes aan naast de X, Y in het menu.Klik en sleep het midden van het referentiekaderpictogram zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Schakel de selectievakjes XY zichtbaar en fix uit en selecteer deze voor XZ. Klik nogmaals op het midden van het referentiekaderpictogram en sleep het zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Herhaal dit ten slotte voor het YZ-vlak, afwisselend tussen deze drie vaste vlakken totdat het referentiekader perfect uitlijnt met de middelste plek.Dubbelklik op het referentiekader in de objectstructuur en wijzig de naam van het referentiekader of iets dergelijks. Klik op de gemaakte spots en navigeer naar Statistieken. Klik vervolgens op Gedetailleerd, gevolgd door Positie referentiekader.Klik op positie X referentiekader totdat het sorteert van de hoogste naar de laagste waarde. Noteer de hoogste waarde om de straal van de aggregaten te verkrijgen. Voer handmatige berekeningen uit om extra interessante locaties te bepalen.Voeg hiervoor 100 micrometer toe aan de X-centrumwaarde en gebruik vervolgens de Y- en Z-waarden van het middelpunt om de eerste locatie langs de middenas te definiëren. Selecteer Nieuwe spots toevoegen. Selecteer vervolgens Automatisch handmatig maken overslaan.Houd de Shift-knop op het toetsenbord ingedrukt en klik ergens op het scherm om een nieuwe plek te plaatsen. Voer de XYZ-positiewaarden in voor de eerste interessante locatie. Selecteer vervolgens Nieuw referentiekader toevoegen en lijn het uit op de plek.Voeg 100 micrometer toe aan elke opeenvolgende X-locatie. Plaats het laatste referentiekader op minder dan 50 micrometer afstand van de buitenradius van het monster. Klik op de gemaakte spots en navigeer naar Statistieken.Klik in de rechterbenedenhoek van het menu op Alle statistieken exporteren naar bestand en sla gegevens op in een spreadsheet. Open de spreadsheet. Navigeer naar het tabblad Van het referentiekader voor oorsprong.Gebruik de mod-functie om elke afstand numeriek toe te wijzen aan het bijbehorende referentiekader. Filter de waarden in deze kolom om te werken met de afstanden in elk referentiekader. Bereken voor elk van de referentiekaders het aantal objecten binnen 50 micrometer van het frame met behulp van de functie COUNTIF.De resulterende waarde komt overeen met het aantal cellen in die regionale plug. Deel deze waarde door het volume van de 100 micrometer plug om de celdichtheid te verkrijgen. De T-tests van studenten onthulden een significant hogere celdichtheid in de sferoïde kern dan in de overgangs- en buitenlagen voor MDA-MB-231 sferoïde modellen.Het resultaat duidt op verdichting in deze sferoïde kern na vier dagen. Binnen zowel AU565 als MDA-MB-231 aggregaatmodellen lijkt de toevoeging van de matrix geen invloed te hebben op het volume of het celgetal en lijkt dus een verwaarloosbare invloed te hebben op de celproliferatie. Integendeel, matrixtoevoeging lijkt de celdichtheid te herverdelen, waardoor een significante kernverdichting en afnemende celdichtheid in de buitenste lagen wordt bevorderd.Deze bevindingen geven waardevol inzicht in de fysische mechanismen waarmee de matrix celaggregatie in verschillende borstkankercellijnen mogelijk maakt. Vervolgens kijkend naar AU565-tumoren sferoïde bereid met matrix, werden gerijpte aggregaten behandeld met trastuzumab en regionale celdichtheid werd geëvalueerd via een vijfdaags medicijnregime. Pluggen werden om de 100 micrometer geplaatst over de dikte van de aggregaten.Kleine fluctuaties in celdichtheid werden in de loop van de tijd waargenomen binnen de binnenste 500 micrometer van elk aggregaat, wat wijst op minimale celdood. De visualisatie van celdood als indicatieve geneesmiddelrespons, meestal in de buitenste lagen van tumorsferoïden, is consistent met geneesmiddelenpenetratieproblemen van trastuzumab. We kunnen nu niet-destructief de levensvatbaarheid van cellen in aggregaten meten zonder de structuur op te offeren.Dit maakt de beoordeling van longitudinale geneesmiddelrespons in enkelvoudige tumoraggregaten mogelijk om temporele en penetratiekwaliteiten van kandidaat-geneesmiddelen tegen kanker te identificeren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Monster extractie en gelijktijdige chromatografische kwantificatie van Doxorubicine en mitomycine C na Drug Delivery van de combinatie in nanopartikels met Tumor-dragende muizen

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Evaluatie van de haalbaarheid, veiligheid en nauwkeurigheid van een intraoperatieve High-intensity gericht echografie apparaat voor de behandeling van lever metastasen

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...