Name: non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment
Uploaded: 2022-06-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Denna studie stöddes av NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) och NIH R01 CA233188 (MB). Vi vill tacka AMC Pharmacy för Trastuzumab för dessa experiment.

AU565 (HER2+) och MDA-MB-231 bröstcancercellinjer användes för denna studie (se materialtabell).
1. Förbereda tumöraggregat
<ol><li>Förbered AU565 (HER2+) bröstcancercelltillväxtmedier med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalmedium (+) i L-glutamin kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin (se materialtabell).</li>
	<li>Förbered MDA-MB-231 trippelnegativa bröstcancercelltillväxtmedi...

<ol>
	<li>Sutherland, R., JA, M., Inch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas.">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiscale+model+for+avascular+tumor+growth.">A multiscale model for avascular tumor growth.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).</li><li>Freyei, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+growth+saturation+and+development+of+necrosisin+EMT6/R0+multicellular+spheroids+by+the+glucose+and+oxygen+supply.">Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply.</a> Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).</li><li>Desoize, B., Jardillier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+resistance:+a+paradigm+for+clinical+resistance.">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).</li><li>Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+quiescent+tumour+microregions+for+evaluating+multicellular+resistance+to+chemotherapeutic+drugs.">A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs.</a> British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).</li><li>Roberge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+tumor+aggregate+morphology+and+viability+quantification+at+cellular+resolution,+during+development+and+in+response+to+drug.">Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug.</a> Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).</li><li>Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-image+based+methods+used+for+non-invasive+volume+estimation+of+cancer+spheroids+a+practical+assessing+approach+based+on+entry-level+equipment.">Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer.">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+multicellular+tumor+spheroids+towards+optimized+treatment+for+patients+with+hepatocellular+carcinoma.">Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).</li><li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer.">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+HHS+public+access.">Optical coherence tomography HHS public access.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>Zhong, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+permeability+of+glycerol+with+ultrasound+in+human+normal+and+cancer+breast+tissues+in+vitro+using+optical+coherence+tomography.">Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography.</a> Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).</li><li>Fujimoto, J., Swanson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+commercialization,+and+impact+of+optical+coherence+tomography.">The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+detects+necrotic+regions+and+volumetrically+quantifies+multicellular+tumor+spheroids.">Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).</li><li>Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+complements+confocal+microscopy+for+investigation+of+multicellular+tumour+spheroids.">Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li><li>El-Sadek, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+dynamics+optical+coherence+tomography+for+tumor+spheroid+evaluation.">Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation.</a> Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).</li><li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-based+3D+bioprinting+for+spatial+and+size+control+of+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies.">Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies.</a> Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).</li><li>Absher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocytometer+counting.">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal,+label-free+assessment+of+cell+density+and+viability+in+multicellular+tumor+spheroids+via+optical+coherence+tomography.">Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography.</a> Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).</li><li>Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+morphological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+3D+spheroids+built+with+a+rapid+method+based+on+entry-level+equipment.">Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment.</a> Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).</li><li>Noto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stearoyl-CoA+desaturase-1+is+a+key+factor+for+lung+cancer-initiating+cells.">Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells.</a> Cell Death &amp; Disease. 4 (12), 947 (2013).</li><li>Riffle, S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+cell+adaptations+to+hypoxia+in+multicellular+tumor+spheroids.">Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).</li><li>Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+the+oxygen+consumption+rate+in+multicellular+tumour+spheroids.">A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Pozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meet+me+halfway:+Are+in+vitro+3D+cancer+models+on+the+way+to+replace+in+vivo+models+for+nanomedicine+development.">Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).</li><li>. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: <a target="_blank" href="https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf">https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf</a> (2015)</li><li>Duchnowska, R., Szczylik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+metastases+in+breast+cancer+patients+administered+trastuzumab.">Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab.</a> Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).</li><li>Zazo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+characterization,+and+maintenance+of+trastuzumab-resistant+HER2++breast+cancer+cell+lines.">Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines.</a> American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).</li></ol>

Betydelse Flercelliga tumörsfäroider (MCTS) är kraftfulla 3D-in vitro-modeller för att studera tumörprogression och läkemedelsscreening 1,2,3. Att främja nyttan av dessa relativt enkla aggregatmodeller är starkt beroende av karakteriseringen av deras nyckelfunktioner, såsom morfologi och celltäthet, som är kända för att påverka både tumörmodellprogression och terapeutiskt svar. Deras ...

Forskare har till stor del vänt sig till bänkskiva 3D-odling in vitro-system för att studera några av de viktigaste funktionerna i tumörprogression. Mycket av denna forskning har letts av återuppkomsten av flercelliga tumörsfäroider (MCTS) och mer komplexa organoider 1,2. Även om dessa modeller är avaskulära, ger de ett kraftfullt verktyg för att rekapitulera fysiologiska och patologiska processer som uppträder in vivo 3,4,5. I synnerhet kan medelstora modeller (300-500 μm diameter) efterlikna viktiga tumörfunktioner såsom 3D-struktur, patofysiologiska gradienter och metastatisk signalering på grund av hypoxi i kärnan. Det är väl dokumenterat att dessa modeller visar de karakteristiska koncentriska skikten som ses i vaskulära in vivo-tumörer, nämligen ett yttre lager av proliferativa celler, ett övergångsskikt av senescenta / vilande celler och celler som upplever hypoxi i kärnan 3,6,7,8,9 . Unik insikt kan erhållas från dessa modeller genom att karakterisera cellbeteende inom dessa lager, under utveckling och som svar på läkemedlet. Den nödvändiga MCTS-storleken, som är nödvändig för att utveckla gradienterna som gör dem till så kraftfulla in vitro-modeller, begränsar dock drastiskt de verktyg som används för icke-destruktiv bedömning. Faktum är att en av de största utmaningarna med icke-destruktiv analys av MTCS är att kvantifiera detaljer i cellskala. Ljusfälts- och faskontrastmikroskopi används rutinmässigt för att bedöma 3D MCTS tillväxt och utveckling icke-destruktivt. Dessa modaliteter är dock begränsade till 2D-projektioner och saknar kapacitet att visualisera den avgörande 3D-strukturen för dessa modeller 10,11,12,13. Information om cytotoxicitet och cellproliferation samlas vanligtvis in genom fluorescerande avbildning (dvs. ljusplåtmikroskopi, konfokalmikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk färgning 14,15,16. Även om dessa metoder ger värdefull, högupplöst information om vävnadsstruktur, celltäthet och cellulär funktion, kräver de ofta provberedning såsom optisk rensning, fixering / färgning eller inbäddning som förhindrar longitudinella analyser.
Optical Coherence Tomography (OCT) är en icke-destruktiv strukturell bildmodalitet som har potential att övervinna några av de utmaningar som nämns ovan. Den har mobilupplösning och ett tillräckligt brett synfält (upp till 10 mm x 10 mm) som kan visualisera hela flercelliga aggregat 17,18,19. Viktigt, på grund av den synliga karaktären hos det använda ljuset, är denna teknik helt icke-destruktiv och etikettfri17. Prover kan också avbildas på plats utan att kräva provberedning, så att prover kan tas direkt från inkubatorn, snabbt skannas med OCT (skanningstid ~ 5-10 min) och sedan återföras till inkubatorn, vilket möjliggör longitudinell karakterisering. Många studier som försöker använda OCT för att analysera tumörsfäroidbeteende har nyligen dykt upp. använde OCT för att icke-destruktivt detektera nekrotiska kärnor inom stora tumörsfäroidmodeller och noterade att levande och döda cellregioner har märkbara skillnader i optisk dämpning, som kan användas för etikettfri viabilitetsövervakning20. genomförde brytningsindexmätningar (RI) av human tjocktarmscancer (HCT116) sfäroider avbildade med OCT för att studera förekomsten av hypoxi i proverna21. Deras mätningar var inte tillräckliga för direkta slutsatser, även om de observerade lägre RI på platser som korrelerade med platsen, men inte storleken, av nekrotiska kärnor, som senare identifierades via konfokalmikroskopi. använde OCT för att visualisera och kvantifiera regional vävnadsviabilitet hos bröstcancertumörmodeller22. De rapporterade två OCT-baserade metoder för att visualisera vävnadsdynamik och visade en måttlig korrelation mellan skillnader i dessa mätvärden och mikroskopiidentifierade regioner av levande / döda celler.
Vårt publicerade arbete med OCT byggde på denna tidigare litteratur för att etablera ett kvantitativt, icke-destruktivt tillvägagångssätt för att mäta 3D-morfologin och cellantalet inom MCTSs bröstcancermodeller under utveckling10,23. Med hjälp av Imaris 3D-renderingsprogram för bildanalys för att räkna antalet cellstora objekt (dvs. fläckar) som avbildades i OCT-volymskanningarna mättes cellantalet icke-destruktivt i MCTS som statistiskt liknade de som bestämdes via hemocytometer vid aggregerad dissociation. På grund av OCT: s strukturella natur kan emellertid cellmembran som fortfarande finns efter celldöd genom nekros felaktigt räknas som levande celler. Dessutom utvidgades denna karakterisering till att icke-destruktivt spåra cellviabilitet inom enskilda aggregat som utsattes för en läkemedelsregim med lovande framgång10. Viktigt var att det noterades att liknande cellviabilitet rapporterades från vår OCT-Imaris-metod med vad som jämfördes i dessa prover vid dissociation. Denna icke-destruktiva och etikettfria cellmetod gör det möjligt att räkna celler inom 3D-konstruktioner och täta aggregat i längdriktningen utan att offra konstruktionen / aggregatstrukturen.
Det aktuella arbetet rapporterar ett förbättrat tillvägagångssätt för att direkt kvantifiera regional celltäthet inom täta aggregat genom att utnyttja OCT-Imaris förmåga att mäta både 3D-aggregatmorfologi och cellnummer. Detta metodologiska framsteg ger en mer detaljerad bild av cellernas rumsliga fördelning och spridning inom de karakteristiska koncentriska skikten i MCTS-modeller. I stället för att bara beräkna en total genomsnittlig aggregerad celltäthet kan sådana lokala densitetsmätningar avslöja celldensitetsgradienter, såsom de som är associerade med komprimering. Denna regionala bedömning tillämpas också på aggregat som behandlas med en kemoterapeutisk för att bedöma regionalt läkemedelssvar, mätt genom förändringar i lokal celltäthet. Denna kombination av OCT och avancerade avbildningsanalysmetoder ger kvantifiering av regional cellviabilitet, som kan användas för att utforska läkemedelspenetration baserat på vilka regioner som upplever minskningar i celltäthet. Detta är den första rapporten för att icke-destruktivt kvantifiera regional celltäthet och livskraft som svar på läkemedlet i täta cellulära vävnader och mäta det longitudinellt. Sådan karakterisering av tredimensionell celltäthet och rumslig fördelning genom hela MCTS kan bidra till att optimera läkemedelsleverans vid cancerbehandling och förbättra förståelsen för cancermodellprogression.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>650970</td>
			<td>CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AU565 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>open-source</td>
			<td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Current version 9.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z1 AxioVision</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-0002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Domain Optical Coherence Tomography</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TEL220C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 cell culture flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-destructive evaluation of regional cell density within tumor aggregates following drug treatment

Multicellulära tumörsfäroidmodeller (MCTS) har visat ökande användbarhet för in vitro-studier av cancerprogression och läkemedelsupptäckt. Dessa relativt enkla avaskulära konstruktioner efterliknar viktiga aspekter av in vivo-tumörer , såsom 3D-struktur och patofysiologiska gradienter. MCTS-modeller kan ge insikter om cancercellsbeteende under sfäroidutveckling och som svar på läkemedel; deras erforderliga storlek begränsar dock drastiskt de verktyg som används för icke-destruktiv bedömning. Optisk koherenstomografi strukturell avbildning och Imaris 3D-analysprogramvara utforskas för snabb, icke-destruktiv och etikettfri mätning av regional celltäthet inom MCTS. Detta tillvägagångssätt används för att bedöma MCTS under en 4-dagars mognadsperiod och under en förlängd 5-dagars behandling med Trastuzumab, ett kliniskt relevant anti-HER2-läkemedel. Kortfattat skapades AU565 HER2 + bröstcancer MCTS via flytande överlägg med eller utan tillsats av Matrigel (en källarmembranmatris) för att utforska aggregat av olika morfologier (tjockare, skivliknande 2.5D-aggregat respektive platta 2D-aggregat). Celldensitet inom den yttre regionen, övergångsregionen och den inre kärnan karakteriserades i mogna MCTS, vilket avslöjade en celldensitetsgradient med högre celltäthet i kärnregioner jämfört med yttre lager. Matrisadditionen omfördelade celltätheten och förbättrade denna gradient, vilket minskade den yttre zondensiteten och ökade cellkomprimeringen i kärnorna. Celltäthet kvantifierades efter läkemedelsbehandling (0 timmar, 24 timmar, 5 dagar) inom gradvis djupare 100 μm zoner för att bedöma potentiella regionala skillnader i läkemedelssvar. Vid den sista tidpunkten verkade nästan all celldöd vara begränsad till de yttre 200 μm av varje aggregat, medan celler djupare i aggregatet verkade i stort sett opåverkade, vilket illustrerar regionala skillnader i läkemedelssvaret, möjligen på grund av begränsningar i läkemedelspenetration. Det nuvarande protokollet ger en unik teknik för att icke-destruktivt kvantifiera regional celltäthet i täta cellulära vävnader och mäta den i längdriktningen.

I en tidigare publikation etablerades en metod för icke-destruktiv mätning av global celltäthet inom cellulära aggregat med oct10. Häri utvidgas denna teknik för att bedöma den regionala celltätheten hos utvecklande cellaggregat. Figur 1 visar ett schema över denna förlängning, där celltätheten kan utvärderas i koncentriska lager av en sfäroid eller mer lokalt genom att istället titta på små (100 μm diameter) sfäriska pluggar, betecknade med de gul...

Watch this Scientific Journal Video about Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment at JoVE.com

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Det nuvarande protokollet utvecklar en bildbaserad teknik för snabb, icke-destruktiv och etikettfri regional celldensitets- och viabilitetsmätning inom 3D-tumöraggregat. Resultaten avslöjade en celldensitetsgradient, med högre celltäthet i kärnregioner än yttre lager vid utveckling av aggregat och övervägande perifer celldöd i HER2 + -aggregat behandlade med Trastuzumab.

Icke-destruktiv utvärdering av regional celltäthet inom tumöraggregat efter läkemedelsbehandling

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Detta protokoll ger information om tumörmodellprogression på ett icke-destruktivt sätt. Det ger också indikationer på terapeutiskt svar genom hela läkemedelsregimer inom enstaka aggregat snarare än att förlita sig på åldersmatchningsprover. Konventionella metoder för att erhålla celltäthet och viabilitet inom aggregat kräver provfixering och sektionering, medan våra tillhandahåller data icke-destruktivt.Så ändringar kan spåras inom en enda aggregat över tid. Denna teknik förväntas förbättra vår förståelse av läkemedelssvar inom diskreta regioner av aggregerade modeller, med konsekvenser för hur väl dessa modeller återspeglar in vivo-svar och läkemedelsscreeningstillämpningar. Börja med att förbereda 70 till 90% sammanflödescellkulturer av de önskade cellinjerna under standardförhållanden.Fristående cellmonolager från sina odlingskolvar enligt standardtrypsiniseringsmetoden och tillsätt cellsuspensionen i ett centrifugrör. Tillsätt 10 mikroliter av cellsuspensionen till en hemocytometer och räkna via mikroskopi för att bestämma antalet celler i suspensionen. Pelletsceller via centrifugering och återsuspenderande celler i media vid den önskade koncentrationen av 2,5 gånger 10 till de femte cellerna per milliliter.För suspensioner beredda med källarmembranmatrisen, ta bort matrisflaskan från minus 20 grader Celsius förvaring och placeras i kylskåpet för att tina över natten. Förbered en behållare med tillväxtmedia och kyl i 10 minuter för att kyla. Använd en frusen pipettspets tillsätt matrisen till kylda medier så att den slutliga koncentrationen av denna lösning är 5% Tillsätt 50 mikroliter av detta medium till varje brunn på en rund botten, icke-vidhäftande 96-brunnsplatta så att den slutliga koncentrationen av matris i dessa brunnar blir 2,5% efter tillsats av cellsuspension.För suspensioner framställda utan matris, tillsätt 50 mikroliter av vanligt tillväxtmedium till varje brunn. Dispensera 50 mikroliter cellsuspension i varje brunn. Centrifugera plattorna vid 123 G i 10 minuter vid rumstemperatur omedelbart efter sådd för att säkerställa uppsamling av en cellpellets i botten av varje brunn.Använd ett OCT-system för strukturell avbildning. Ställ in A-skanningshastigheten till 5,5 kilohertz för högupplöst bildinsamling. Ställ in brytningsindexet till 1,33 för prover i ett flytande medium.I fönstret för bildparametrar till höger på skärmen ställer du in synfältet genom att mata in X-, Y- och Z-värden så att provet omfattas av detta intresseområde. Klicka på 3D-förvärvsläge och klicka sedan på Spela in för att samla in 3D-volymsökningen av provet. För att skapa volymrekonstruktion, öppna Imaris och navigera till den konverterade TIF-filen i deras arena.Gå till redigera, klicka sedan på Bildegenskaper och mata in voxelstorleken från OCT-bilden i motsvarande XYZ-rutor. Klicka sedan på OK. Klicka på Lägg till nya ytor ovanför objektträdet. I menyn under trädet klickar du på Hoppa över automatisk skapande och redigerar manuellt.I fönstret för visningsjustering skjuter du de röda och svarta pilarna manuellt för att förbättra kontrasten mellan provet och bakgrunden och förbättra provvisualiseringen. Justera segmentets position till segmentet vid ena kanten av provet. Använd escape-tangenten för att ändra musen från navigeringsläget till väljläget och klicka sedan på Rita.Spåra konturen för regionen som visar signalen manuellt. Flytta fram segmentpositionen genom att ange nästa position i inmatningsrutan. Denna nästa position bör vara mindre än eller lika med 100 skivor längre in i provet än den föregående.Spåra regionen som visar signalen manuellt. Upprepa detta steg genom provets tjocklek tills provets motsatta kant har uppnåtts. Klicka sedan på Skapa yta och vänster meny för att sy ihop dessa skivor.Klicka slutligen på Redigera, klicka sedan på Maskval och klicka sedan på OK för att slutföra volymrekonstruktionen. Om du vill hämta provets totala celltäthet väljer du Lägg till nya fläckar. I algoritminställningsmenyn avmarkerar du alla rutor.Klicka på den blå pilen för att gå till källkanalskärmen. I rullgardinsmenyn som visas väljer du Maskerad kanal. Mata in den genomsnittliga celldiametern för provet i rutan med XY-diameter.Se till att bakgrunds subtraktion är markerad. Klicka på den blå pilen för att gå till skärmen klassificera plats. I diagrammet längst ned på menyn klickar du på och drar den vänstra kanten av den gula tröskeln till diagrammets vänstra kant så att alla objekt inkluderas i den gula skuggade tröskeln.Klicka sedan på den gröna pilen för att slutföra skapandet av platsen. Få antalet objekt som identifieras genom att klicka på Statistik. Klicka sedan på Övergripande och slutligen på Totalt antal platser.Klicka på den skapade ytan och navigera till fliken ytstilkvalitet. Ändra markeringen till mittpunkt och ändra pixelbredden till mindre än lika med 20 för bästa synlighet. Navigera till Statistik.Klicka sedan på Detaljerad, följt av Position och spela in platsen på mittplatsen. Välj Lägg till ny referensram på menyn ovanför objektträdet. Markera de synliga och fasta rutorna bredvid X, Y i menyn.Klicka och dra i mitten av referensramsikonen så att den är i linje med mittpunkten. Avmarkera rutorna XY synlig och åtgärda rutorna och markera dem för XZ. Återigen klickar du och drar mitten av referensramikonen så att den är i linje med mittpunkten. Slutligen, upprepa detta för YZ-planet, alternerande mellan dessa tre fasta plan tills referensramen är perfekt i linje med mittpunkten.Dubbelklicka på referensramen i objektträdet och byt namn på den till mitten eller liknande. Klicka på de platser som skapats och navigera till Statistik. Klicka sedan på Detaljerad, följt av Position referensram.Klicka på position X-referensramen tills den sorterar från högsta till lägsta värde. Registrera det högsta värdet för att få aggregatens radie. Utför manuella beräkningar för att bestämma ytterligare platser av intresse.För att göra detta, lägg till 100 mikrometer till X-mittvärdet och använd sedan Y- och Z-värdena för mittpunkten för att definiera den första platsen längs mittaxeln. Välj Lägg till nya platser. Välj sedan Hoppa över automatisk skapande Redigera manuellt.Håll ned skiftknappen på tangentbordet och klicka var som helst på skärmen för att placera en ny plats. Ange XYZ-positionsvärdena för den första platsen av intresse. Välj sedan Lägg till ny referensram och justera den över platsen.Lägg till 100 mikrometer till varje sekventiell X-plats. Placera den sista referensramen mindre än lika med 50 mikrometer från provets yttre radie. Klicka på de platser som skapats och navigera till Statistik.I det nedre högra hörnet av menyn klickar du på Exportera all statistik till fil och sparar data i ett kalkylblad. Öppna kalkylbladet. Navigera till fliken Avstånd från referensramen för origo.Använd mod-funktionen för att numeriskt tilldela varje avstånd till motsvarande referensram. Filtrera värdena i den här kolumnen för att arbeta med avstånden i varje referensram. För var och en av referensramarna beräknar du antalet objekt inom 50 mikrometer från ramen med funktionen COUNTIF.Det resulterande värdet motsvarar antalet celler i den regionala kontakten. Dela detta värde med volymen på 100 mikrometerpluggen för att få celldensitet. Studentens T-testning avslöjade signifikant högre celltäthet i sfäroidkärnan än i övergångs- och yttre lager för MDA-MB-231-sfäroidmodeller.Resultatet indikerar komprimering i denna sfäroidkärna efter fyra dagar. Inom både AU565- och MDA-MB-231-aggregatmodeller verkar tillsatsen av matrisen inte påverka volymen eller cellantalet och verkar därför ha försumbar påverkan på cellproliferation. Snarare verkar matrisaddition omfördela celltäthet som främjar signifikant kärnkomprimering och minskar celldensiteten i de yttre skikten.Dessa fynd ger värdefull inblick i de fysiska mekanismer genom vilka matrisen möjliggör aggregering av celler i olika bröstcancercellinjer. Om man tittar därefter på AU565-tumörer sfäroid framställd med matris, behandlades mogna aggregat med trastuzumab och regional celltäthet utvärderades genom en fem dagars läkemedelsregim. Pluggar sattes var 100: e mikrometer genom aggregatets tjocklek.Mindre fluktuationer i celltäthet observerades över tid inom de inre 500 mikrometer av varje aggregat vilket indikerar minimal celldöd. Visualiseringen av celldöd som indikativt läkemedelssvar mestadels i de yttre skikten av tumörsfäroider överensstämmer med läkemedelspenetrationsproblem av trastuzumab. Vi kan nu icke-destruktivt mäta cellviabilitet i aggregat utan att offra strukturen.Detta möjliggör bedömning av longitudinellt läkemedelssvar i enstaka tumöraggregat för att identifiera temporala och penetrationsegenskaper hos läkemedelskandidater mot cancer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Prov utvinning och samtidiga kromatografiska kvantitering av Doxorubicin och Mitomycin C efter drogen kombination leverans i nanopartiklar till tumör-bärande möss

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Utvärdering av genomförbarhet, säkerhet och noggrannhet av en intraoperativ högintensiva fokuserat ultraljud enhet för behandling av levermetastaser

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofila extracellulära fällor som genereras av låg densitet neutrofiler erhållits från Peritoneal Lavage vätska medla tumör celltillväxt och fastsättning

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal inokulering av skivepitelcancer celler i möss för tumör immun profilering och svar bedömning

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...