Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
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लेखक प्रोटोकॉल विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान अंतर्दृष्टि और समर्थन के लिए चन्ना अलुविहारे और योनस गेबरमाइकेल, आईटीएफ, यूएमडी को स्वीकार करते हैं। टंगस्टन सुइयों डेविड ओ'ब्रोचटा, आईटीएफ, यूएमडी से एक उदार उपहार थे। हम आई रिसिनस में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए डॉ लादिस्लाव सिमो के आभारी हैं। इस परियोजना को एनआईएच-एनआईएआईडी आर 21 एआई 128393 और प्लायमाउथ हिल फाउंडेशन, एनवाई से एमजी-एन, नेवादा विश्वविद्यालय से एएन तक स्टार्टअप फंड, एमजी-एन और एएन के लिए नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट नंबर 2019609 और आईजीटीआरसीएन से एएस तक पीयर-टू-पीयर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

इक्सोड्स स्कैपुलारिस वयस्कों को या तो ओक्लाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी (ओएसयू) से खरीदा गया था या नेवादा विश्वविद्यालय, रेनो (यूएनआर) (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल # 21-001-1118) में पाला गया था।
1. भ्रूण संग?...

<ol>
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</ol>

यह प्रारंभिक टिक भ्रूण को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए विकसित पहला प्रोटोकॉल है। ~ 4% -8% की जीवित रहने की दर हासिल की गई है, जो अन्य अच्छी तरह से स्थापित कीट मॉडल 5 में भ्रूण इंजेक्शनके बराबर है?...

टिक चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर हैं, जो विभिन्न प्रकार के वायरल, बैक्टीरियल, प्रोटोजोआ रोगजनकों और नेमाटोड 1,2 को प्रसारित करने में सक्षम हैं। पूर्वी संयुक्त राज्य अमेरिका में, काले पैर वाला टिक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, लाइम रोग (एलडी) रोगज़नक़, स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी का एक महत्वपूर्ण वेक्टर है। संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल एलडी के 400,000 से अधिक मामले सामने आते हैं, जिससे यह अमेरिका में शीर्ष वेक्टर जनित संक्रामक रोगबन जाता है। बी. बर्गडोरफेरी के अलावा, छह अन्य सूक्ष्मजीव आई. स्कैपुलरिस द्वारा प्रेषित होते हैं- जिनमें चार बैक्टीरिया (एनाप्लाज्मा फागोसाइटोफिलम, बी. मायोनी, बी. मियामोटोई, और एर्लिचिया म्यूरिस यूक्लेरेंसिस), एक प्रोटोजोआ परजीवी (बेबेसिया माइक्रोटी), और एक वायरस (पोवासन वायरस) शामिल हैं, जिससे यह टिक प्रजाति एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय बनजाती है। . जबकि हाल के वर्षों में टिक-जनित रोग अधिक प्रचलित हो गए हैं, टिक्स पर शोध अन्य आर्थ्रोपोड वैक्टर, जैसे मच्छरों के पीछे गिर गया है, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान और आनुवंशिक और कार्यात्मक जीनोमिक टूल 4,5 को लागू करने से जुड़ी चुनौतियों के कारण।
जीन-संपादन तकनीक, विशेष रूप से CRISPR / Cas9, ने अब गैर-मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन को संभव बना दिया है। एक जीव में आनुवांशिक उत्परिवर्तन बनाने के लिए, भ्रूण इंजेक्शन जर्मलाइन 6,7,8,9 को बदलने के लिए निर्माण देने के लिए पसंदीदा तरीका बना हुआ है। हालांकि, हाल ही में4 तक, टिक अंडे को भ्रूण10,11 को मारने के बिना इंजेक्शन के लिए बहुत मुश्किल या असंभव माना जाता था। अंडे पर एक मोटी मोम परत, कठोर कोरियोन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव कुछ मुख्य बाधाएं थीं जो टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन को रोकती थीं। स्कैपुलारिस 3-4 सप्ताह (लगभग100 अंडे / दिन) में 2,000 अंडे तक का एक क्लच जमा करता है। अंडे अकेले रखे जाते हैं, और प्रत्येक अंडे को मोम के साथ लेपित किया जाता है जो मां के ग्रंथियों के अंग 13,14,15 के प्रोट्रूशियंस या "सींग" द्वारा स्रावित होता है। यह मोम अंडे को निर्जलीकरण से बचाता है और इसमें रोगाणुरोधी यौगिकहोते हैं। टिक अंडे को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए, मोम की परत को हटाना, कोरियन को नरम करना और इंट्राओवल दबाव को कम करने के लिए अंडे को डिसिकेट करना महत्वपूर्ण है ताकि इंजेक्शन अपरिवर्तनीय रूप से अंडे को नुकसान न पहुंचाए। सफल जर्मलाइन परिवर्तन के लिए भ्रूण इंजेक्शन के महत्वपूर्ण महत्व को समझते हुए, आई स्कैपुलारिस के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, जिसका उपयोग सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 निर्माण देने और स्थिर जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न करनेके लिए किया जा सकता है। स्कैपुलारिस अनुसंधान में इसके योगदान के अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य टिक प्रजातियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

टिक विभिन्न वायरल, बैक्टीरियल और प्रोटोजोआ रोगजनकों को प्रसारित कर सकते हैं और इसलिए उन्हें चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर माना जाता है। टिक-जनित रोगों के बढ़ते बोझ के बावजूद, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान के लिए कार्यात्मक अध्ययन के लिए आनुवंशिक परिवर्तन उपकरणों को लागू करने में चुनौतियों के कारण टिक्स पर शोध कीट रोग वैक्टर से पिछड़ गया है। मच्छर जनित बीमारियों को कम करने के लिए आनुवंशिक हस्तक्षेप ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। हालांकि, इस तरह के हस्तक्षेप के विकास के लिए भ्रूण को इंजेक्ट करके स्थिर जर्मलाइन परिवर्तन की आवश्यकता होती है। इस तरह के भ्रूण इंजेक्शन तकनीक में टिक्स सहित कोलिसेरेट की कमी है। कई कारक, जैसे कि टिक भ्रूण पर एक बाहरी मोटी मोम परत, हार्ड कोरियन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव, कुछ बाधाएं हैं जो पहले टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकास को रोकती थीं। वर्तमान काम ने इन बाधाओं को दूर कर दिया है, और काले पैर वाले टिक के लिए एक भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, यहां वर्णित है। इस तकनीक का उपयोग स्थिर जर्मलाइन परिवर्तनों के लिए CRISPR / Cas9 जैसे घटकों को वितरित करने के लिए किया जा सकता है।

स्कैपुलारिस के लिए एक सफल भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल इस लेख में वर्णित है। अंडे देने वाली मादाओं को आंशिक रूप से मोम वाले अंडों के निर्जलीकरण से बचने के लिए उच्च आर्द्रता पर रखा गया था। ग्रेविड मादा ?...

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Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

वर्तमान प्रोटोकॉल टिक भ्रूण को इंजेक्ट करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। ट्रांसजेनिक लाइनों को उत्पन्न करने के लिए आनुवंशिक हेरफेर के लिए भ्रूण इंजेक्शन पसंदीदा तकनीक है।

ब्लैक-लेग्ड टिक में जीन संपादन के लिए भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

यह एक कोलिसेराटा प्रजाति के लिए पहला भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल है। टिक भ्रूण को इंजेक्ट करने की क्षमता अनुसंधान की कई लाइनों को खोल देगी, विशेष रूप से, टिक जीन फ़ंक्शन और टिक रोगज़नक़ इंटरैक्शन में अध्ययन। यह तकनीक टिक जीन के कार्यात्मक अध्ययन पर भविष्य के काम की अनुमति देती है और जीन ड्राइव सिस्टम का उपयोग करके टिक जनसंख्या नियंत्रण के लिए एक आधार प्रदान करती है।यह विधि टिक्स और रोगजनकों के बीच बातचीत की समझ की सुविधा प्रदान करेगी जो वे आणविक स्तर पर आश्रय देते हैं। यह हमें प्रोटीन की पहचान करने की अनुमति देगा जिसका उपयोग लाइम रोग और अन्य रोगजनकों के लिए टीकों के विकास के लिए किया जा सकता है। जबकि कई शोध क्षेत्रों जैसे कि टिक रोगज़नक़ इंटरैक्शन और भोजन के दौरान टिक द्वारा मेजबानों को रोगज़नक़ संचरण इस काम से लाभान्वित होंगे।अधिक मौलिक प्रश्न जैसे कि टिक्स मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से कैसे बचते हैं, और डीएनए मरम्मत तंत्र में अंतर को भी अब समझा जा सकता है। टिक जीव विज्ञान के कुछ पहलू हैं जिन्हें इस प्रक्रिया को पूरा करने से पहले समझने की आवश्यकता है। सुई से छूने पर भ्रूण का उच्च आंतरिक दबाव फट जाता है।इंजेक्शन के लिए भ्रूण तैयार करना बहुत जरूरी है। शुरू करने के लिए, इंजेक्शन से एक सप्ताह पहले अंडे देने की शुरुआत के लिए मादाओं को चार डिग्री सेल्सियस से 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। तीन से चार दिनों के बाद जब मादाएं अंडे देना शुरू करती हैं, तो जीन के अंग पृथक्करण के लिए मादाओं को तैयार करते समय एक बारीक पेंटब्रश का उपयोग करके किसी भी अंडे को हटा दें।ग्रंथि को खाली करने के लिए, ग्रेविड टिक को माइक्रोस्कोप के नीचे ग्लास स्लाइड पर इस तरह से व्यवस्थित करें कि मुंह के हिस्से उदर और पृष्ठीय दोनों पक्षों पर दिखाई दें। फिर पृष्ठीय पक्ष पर मुंह के हिस्सों के पीछे के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक पंचर करें, और बल का उपयोग करके उदर पक्ष पर दबाव लागू करें। एक लिंट-फ्री वाइप के किनारे रखें और पंचर साइट से निकलने वाले तरल मोम को हटा दें।वैकल्पिक रूप से, विच्छेदन द्वारा ग्रंथि को खाली करने के बजाय, टिक मुंह के हिस्सों के आसपास ऊतक चिपकने वाले जैसे गोंद का उपयोग किया जा सकता है। जब मादाएं फिर से अंडे देना शुरू करती हैं, तो ताजा जमा अंडे इकट्ठा करने के लिए एक महीन पेंटब्रश का उपयोग करें और उन्हें 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। शून्य से 18 घंटे पुराने अंडे वाली ट्यूब में 5% बेंजाल्कोनियम क्लोराइड पानी के लगभग 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।ट्यूब के तल में बसने वाले अंडों से बचने के लिए पेंटब्रश के साथ धीरे से अंडे को पांच मिनट तक घुमाएं, और ट्यूब में अंडे को पीछे छोड़ते हुए माइक्रो पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें। अंडे युक्त ट्यूब में आसुत जल के लगभग 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। पेंटब्रश के साथ घूमें और माइक्रो पिपेट का उपयोग करके माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से पानी निकालें।आसुत जल से धोने के बाद, 5% सोडियम क्लोराइड के लगभग 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से पांच मिनट के लिए पेंटब्रश के साथ घुमाएं। फिर, पांच मिनट के बाद ट्यूब से घोल निकालें, और अंडे को आसुत पानी से दो बार धोएं। इसके बाद, अंडे युक्त माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1% सोडियम क्लोराइड समाधान के लगभग 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।सबसे पहले, दो ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइडों का एक साथ पालन करें, एक डबल-साइडेड टेप का उपयोग करके अंडे को संरेखित करने का समर्थन करने के लिए लगभग 0.5 सेंटीमीटर का अंतर छोड़ दें, और स्लाइड के बीच के अंतर में डबल-साइडेड टेप पर पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग का एक टुकड़ा लागू करें। फिर पेंटब्रश का उपयोग करके स्लाइड सेटअप पर एक समय में आठ से 10 अंडे संरेखित करें। फिर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के चरण पर संरेखित अंडे के साथ स्लाइड रखें और लिंट-फ्री वाइप के एक टुकड़े का उपयोग करके 1% सोडियम क्लोराइड समाधान को हटा दें जिसमें वे संग्रहीत होते हैं।भरी हुई इंजेक्शन सुई को माइक्रो मैनिपुलेटर से जुड़े माइक्रो इंजेक्टर से जोड़ें। इसके बाद, माइक्रो इंजेक्टर पर उच्च दबाव सेटिंग का उपयोग करके अंडे की सतह के खिलाफ धीरे से रगड़कर सुई खोलें। सुई खुलने के बाद, सुई के खुलने के आधार पर माइक्रो इंजेक्टर का दबाव कम करें।फिर जितनी जल्दी हो सके 10 से 15 डिग्री कोण पर स्लाइड पर सभी अंडों को इंजेक्ट करें, जल्दी से पैर पैडल दबाएं, और तुरंत स्लाइड को नम पेपर तौलिया के साथ पेट्री डिश में उच्च आर्द्रता की स्थिति में ले जाएं। नम फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक बड़े पेट्री डिश में इंजेक्शन भ्रूण युक्त स्लाइड रखने के पांच से छह घंटे बाद, इंजेक्शन वाले भ्रूण के साथ पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग में आसुत जल की एक छोटी बूंद जोड़ें। फिर, पेंटब्रश का उपयोग करके अंडे को धीरे से विस्थापित करें।इसके बाद, अंडे को एक छोटे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें आसुत पानी में डुबो दें। अंडे को पानी में डुबोकर रखें, पेट्री डिश को छह क्वार्ट प्लास्टिक बॉक्स में एक इनक्यूबेटर में 27 डिग्री सेल्सियस पर 90% से अधिक सापेक्ष आर्द्रता पर रखें। जब इंजेक्शन के 21 से 25 दिनों के बाद इंजेक्शन वाले भ्रूण से लार्वा निकलना शुरू हो जाता है, तो उन्हें दैनिक जांचें और किसी भी हैच लार्वा को शीर्ष पर स्क्रीन के साथ कांच की शीशियों में स्थानांतरित करें।परिणामों से पता चला कि 12 से 18 घंटे पुराने भ्रूणजनन में अंडे को जल्दी इंजेक्ट करना, और स्लाइड के किनारे के लंबवत अंडे की लंबी धुरी को संरेखित करने से इंजेक्शन वाले अंडे की उच्च जीवित रहने की दर होती है। सभी इंजेक्शन वाले अंडे में से, 8.5% तक बच गए और लार्वा निकला। इस प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, चरण 2.4 को याद रखना महत्वपूर्ण है, मदर टिक से मोम को हटाना, और चरण 3.1 से 3.4 तक, बेंजाल्कोनियम क्लोराइड के साथ भ्रूण के कोरियन को नरम करना, और सफल भ्रूण इंजेक्शन को सक्षम करने के लिए सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ भ्रूण का निर्जलीकरण।यह विधि मुख्य रूप से टिक जीन संपादन के लिए विकसित की गई थी, और यह हमें नॉकआउट और नॉक-इन करने की अनुमति देगा जो हमें टिक जीन फ़ंक्शन को समझने में मदद करेगा। यह तकनीक टिक अनुसंधान के लिए लागू होने वाले कई अन्य जीवों के लिए उपलब्ध जीन संपादन उपकरणों के उपयोग की अनुमति देगी। और यह टिक आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में तेजी लाएगा।

Research

JoVE Journal

Biology

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

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Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

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प्रारंभिक चिकी भ्रूण में Morphogenetic ऊतक विरुपणों ट्रैकिंग

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

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Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

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नासोनिया विट्रिपेनिस में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...