Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Gli autori ringraziano Channa Aluvihare e Yonus Gebermicale, ITF, UMD, per la comprensione e il supporto durante la fase iniziale dello sviluppo del protocollo. Gli aghi di tungsteno sono stati un dono generoso di David O'Brochta, ITF, UMD. Siamo grati al Dr. Ladislav Simo per aver testato questo protocollo in I. ricinus e per le discussioni approfondite. Questo progetto è stato finanziato da NIH-NIAID R21AI128393 e Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondi di avvio dall'Università del Nevada ad AN, il National Science Foundation Grant No. 2019609 a MG-N e AN e una sovvenzione peer-to-peer da IGTRCN a AS.

Gli adulti di Ixodes scapularis sono stati acquistati dalla Oklahoma State University (OSU) o allevati presso l'Università del Nevada, Reno (UNR) (protocollo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparazione di zecche femminili per la raccolta di embrioni
NOTA: Per raccogliere le uova di età appropriata, è importante sincronizzare la deposizione delle uova. Sebbene i segnali di deposizione delle uova nelle zecche rimangano poco chiari, nelle condizion...

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	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
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</ol>

Questo è il primo protocollo sviluppato per iniettare con successo embrioni di zecca precoci. È stato raggiunto un tasso di sopravvivenza di ~ 4% -8%, che è paragonabile all'iniezione di embrioni in altri modelli di insetti ben consolidati5.
Poiché questo è il protocollo iniziale, si prevede che questo protocollo sarà ulteriormente perfezionato e specializzato per le singole specie di zecche. In particolare, i tempi di iniezione varieranno da specie a specie, a se...

Le zecche sono vettori di importanza medica e veterinaria, in grado di trasmettere una varietà di patogeni virali, batterici, protozoari e nematodi 1,2. Negli Stati Uniti orientali, la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis, è un importante vettore del patogeno della malattia di Lyme (LD), la spirocheta Borrelia burgdorferi. Oltre 400.000 casi di LD sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti, rendendola la principale malattia infettiva trasmessa da vettori negli Stati Uniti1. Oltre a B. burgdorferi, altri sei microrganismi sono trasmessi da I. scapularis, tra cui quattro batteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), un protozoo parassita (Babesia microti) e un virus (Powassan virus), rendendo questa specie di zecche un importante problema di salute pubblica3 . Mentre le malattie trasmesse dalle zecche sono diventate più diffuse negli ultimi anni, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ad altri vettori di artropodi, come le zanzare, a causa della biologia unica delle zecche e delle sfide associate all'applicazione di strumenti genomici genetici e funzionali 4,5.
Le tecniche di modifica genetica, in particolare CRISPR / Cas9, hanno ora reso fattibili studi di genomica funzionale in organismi non modello. Per creare mutazioni ereditabili in un organismo, l'iniezione di embrioni rimane il metodo preferito per fornire costrutti per alterare la linea germinale 6,7,8,9. Tuttavia, fino a poco tempo fa4, le uova di zecca erano considerate troppo difficili o addirittura impossibili da iniettare senza uccidere l'embrione10,11. Uno spesso strato di cera sulle uova, corion duro e alta pressione intraovale erano alcuni dei principali ostacoli che impedivano l'iniezione di embrioni nelle zecche. Gli adulti, alimentati con sangue I. scapularis depositano una singola frizione fino a 2.000 uova12 in 3-4 settimane (circa 100 uova / giorno). Le uova vengono deposte singolarmente e ogni uovo è ricoperto di cera secreta da sporgenze o "corna" dell'organo ghiandolare di Gené13,14,15 della madre. Questa cera protegge le uova dall'essiccazione e contiene composti antimicrobici15. Per iniettare con successo le uova di zecca, è importante rimuovere lo strato di cera, ammorbidire il corion e asciugare le uova per ridurre la pressione intraovale in modo che l'iniezione non danneggi irreversibilmente l'uovo. Comprendendo l'importanza critica delle iniezioni embrionali per il successo della trasformazione germinale, viene sviluppato un protocollo per I. scapularis, che può essere utilizzato per fornire un costrutto CRISPR / Cas9 e generare mutazioni germinali stabili4. Oltre al suo contributo alla ricerca su I. scapularis, questo protocollo potrebbe anche essere ottimizzato per altre specie di zecche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

Le zecche possono trasmettere vari patogeni virali, batterici e protozoari e sono quindi considerate vettori di importanza medica e veterinaria. Nonostante il crescente onere delle malattie trasmesse dalle zecche, la ricerca sulle zecche è rimasta indietro rispetto ai vettori di malattie degli insetti a causa delle sfide nell'applicazione di strumenti di trasformazione genetica per studi funzionali alla biologia unica delle zecche. Gli interventi genetici hanno guadagnato attenzione per ridurre le malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, lo sviluppo di tali interventi richiede una trasformazione germinale stabile mediante iniezione di embrioni. Tale tecnica di iniezione di embrioni è carente per i chelicerati, comprese le zecche. Diversi fattori, come uno spesso strato di cera esterno sugli embrioni di zecche, corion duro e alta pressione intraovale, sono alcuni ostacoli che in precedenza impedivano lo sviluppo del protocollo di iniezione embrionale nelle zecche. Il presente lavoro ha superato questi ostacoli e qui è descritta una tecnica di iniezione di embrioni per la zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis.  Questa tecnica può essere utilizzata per fornire componenti, come CRISPR / Cas9, per trasformazioni germinali stabili.

Un protocollo di iniezione embrionale di successo per I. scapularis è descritto in questo articolo. Le femmine che depongono le uova sono state mantenute ad alta umidità per evitare l'essiccazione delle uova parzialmente cerate. Lo strato di cera è stato rimosso per iniettare embrioni di zecca ablando l'organo del gene (ghiandola di cera) della femmina gravida (Figura 1A-E). Abbiamo usato aghi di vetro alluminosilicati con un collo più corto (<s...

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Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare embrioni di zecca. L'iniezione di embrioni è la tecnica preferita per la manipolazione genetica per generare linee transgeniche.

Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Questo è il primo protocollo di iniezione di embrioni per una specie di Chelicerata. La capacità di iniettare embrioni di zecca aprirà molte linee di ricerca, in particolare studi sulla funzione del gene delle zecche e sulle interazioni tra patogeni di zecche. Questa tecnica consente di lavorare in futuro su studi funzionali dei geni delle zecche e fornisce una base per il controllo della popolazione di zecche utilizzando sistemi di gene drive.Questo metodo faciliterà la comprensione dell'interazione tra le zecche e i patogeni che ospitano a livello molecolare. Questo ci permetterà di identificare le proteine che possono essere utilizzate per lo sviluppo di vaccini per la malattia di Lyme e altri agenti patogeni. Mentre diverse aree di ricerca come le interazioni dei patogeni delle zecche e la trasmissione dei patogeni agli ospiti da parte delle zecche durante l'alimentazione trarranno beneficio da questo lavoro.Domande più fondamentali come come le zecche eludono la risposta immunitaria dell'ospite e le differenze nei meccanismi di riparazione del DNA possono anche essere comprese ora. Ci sono alcuni aspetti della biologia delle zecche che devono essere compresi prima di eseguire questa procedura. L'alta pressione interna dell'embrione porta allo scoppio quando viene toccato da un ago.È molto importante preparare gli embrioni per l'iniezione. Per iniziare, trasferire le femmine da quattro gradi Celsius a un'incubatrice di 27 gradi Celsius per l'inizio della deposizione delle uova una settimana prima delle iniezioni. Dopo tre o quattro giorni quando le femmine iniziano a deporre le uova, rimuovere le uova usando un pennello a punta fine mentre si preparano le femmine per l'ablazione dell'organo di Gene.Per svuotare la ghiandola, disporre il segno di spunta gravido su un vetrino al microscopio in modo che le parti della bocca siano visibili su entrambi i lati ventrale e dorsale. Quindi perforare accuratamente l'area dietro le parti della bocca sul lato dorsale e applicare pressione sul lato ventrale usando una pinza. Posizionare il bordo di una salvietta priva di lanugine e rimuovere la cera liquida che fuoriesce dal sito di puntura.In alternativa, invece di svuotare la ghiandola mediante dissezione, è possibile utilizzare colle come l'adesivo tissutale intorno alle parti della bocca della zecca. Quando le femmine iniziano a deporre di nuovo le uova, utilizzare un pennello fine per raccogliere le uova appena depositate e metterle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua al 5% di benzalconio cloruro nel tubo contenente uova da zero a 18 ore.Ruotare delicatamente le uova con il pennello per cinque minuti per evitare che le uova si depositino sul fondo del tubo e rimuovere il surnatante usando una micro pipetta, lasciando le uova nel tubo. Aggiungere circa 200 microlitri di acqua distillata al tubo contenente le uova. Agitare con un pennello e rimuovere l'acqua dal tubo della microcentrifuga usando una micro pipetta.Dopo il lavaggio con acqua distillata, aggiungere circa 200 microlitri di cloruro di sodio al 5% e ruotare delicatamente con un pennello per cinque minuti. Quindi, rimuovere la soluzione dal tubo dopo cinque minuti e lavare le uova due volte con acqua distillata. Quindi, aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio all'1% nella provetta da microcentrifuga contenente uova.In primo luogo, far aderire due vetrini da microscopio di vetro insieme, lasciando uno spazio di circa 0,5 centimetri per supportare l'allineamento delle uova usando un nastro biadesivo, e applicare un pezzo di pellicola trasparente sul nastro biadesivo nello spazio tra i vetrini. Quindi allineare da otto a 10 uova alla volta sulla configurazione della diapositiva usando un pennello. Quindi posizionare il vetrino con le uova allineate sul palco di un microscopio composto e rimuovere la soluzione di cloruro di sodio all'1% usando un pezzo di salvietta priva di lanugine in cui sono conservati.Collegare l'ago per iniezione riempito a un microiniettore collegato a un micromanipolatore. Quindi, aprire l'ago strofinando delicatamente contro la superficie dell'uovo utilizzando un'impostazione ad alta pressione sul microiniettore. Dopo aver aperto l'ago, ridurre la pressione del microiniettore a seconda dell'apertura dell'ago.Quindi iniettare tutte le uova sul vetrino con un angolo da 10 a 15 gradi il più rapidamente possibile, premere rapidamente il pedale e spostare immediatamente il vetrino in condizioni di elevata umidità in una capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido. Dopo cinque-sei ore dal posizionamento del vetrino contenente embrioni iniettati in una grande capsula di Petri rivestita con carta da filtro umida, aggiungere una piccola goccia di acqua distillata alla medicazione trasparente con gli embrioni iniettati attaccati. Quindi, spostare delicatamente le uova usando un pennello.Quindi, trasferire le uova in una piccola piastra di Petri e immergerle in acqua distillata. Tenere le uova immerse in acqua, posizionare la capsula di Petri in una scatola di plastica da sei quarti in un'incubatrice a 27 gradi Celsius a più del 90% di umidità relativa. Quando la larva inizia a schiudersi dagli embrioni iniettati da 21 a 25 giorni dopo l'iniezione, controllarli quotidianamente e trasferire eventuali larve tratteggiate in fiale di vetro con uno schermo in cima.I risultati hanno dimostrato che iniettare le uova all'inizio dell'embriogenesi da 12 a 18 ore e allineare l'asse più lungo dell'uovo perpendicolarmente al bordo del vetrino si traduce in un più alto tasso di sopravvivenza delle uova iniettate. Di tutte le uova iniettate, fino all'8,5% è sopravvissuto e la larva si è schiusa. Prima di iniziare questa procedura, è importante ricordare i passaggi 2.4, rimozione della cera dalla zecca madre e passaggi da 3.1 a 3.4, ammorbidimento del corion dell'embrione con benzalconio cloruro e essiccazione dell'embrione con soluzioni di cloruro di sodio per consentire un'iniezione embrionale di successo.Questo metodo è stato sviluppato principalmente per l'editing del gene delle zecche e questo ci permetterà di fare knockout e knock-in che ci aiuteranno a capire la funzione del gene delle zecche. Questa tecnica consentirà l'uso di strumenti di modifica genetica disponibili per molti altri organismi da applicare alla ricerca sulle zecche. E questo accelererà la ricerca sulla biologia molecolare delle zecche.

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JoVE Journal

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Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

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