Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

저자는 Channa Aluvihare와 Yonus Gebermicale, ITF, UMD가 프로토콜 개발의 초기 단계에서 통찰력과 지원을 받았다고 인정합니다. 텅스텐 바늘은 David O'Brochta, ITF, UMD의 관대 한 선물이었습니다. 우리는 I. ricinus 에서이 프로토콜을 테스트하고 통찰력있는 토론을 해주신 Ladislav Simo 박사에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH-NIAID R21AI128393 및 Plymouth Hill Foundation, NY에서 MG-N, 네바다 대학에서 AN까지의 스타트 업 자금, MG-N 및 AN에 대한 국립 과학 재단 보조금 번호 2019609, IGTRCN에서 AS로의 피어 투 피어 보조금.

Ixodes 견갑골 성인은 오클라호마 주립 대학 (OSU)에서 구입하거나 네바다 리노 대학 (UNR) (IACUC 프로토콜 # 21-001-1118)에서 자랐습니다.
1. 배아 수집을위한 암컷 진드기의 준비
알림: 적절한 연령의 알을 수집하려면 알을 낳는 것을 동기화하는 것이 중요합니다. 진드기의 알을 낳는 단서는 불분명하지만 표준 곤충 조건 (27 ° C 온도 및 >90 % 상?...

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

이것은 초기 진드기 배아를 성공적으로 주입하기 위해 개발 된 최초의 프로토콜입니다. ~4%-8%의 생존율이 달성되었으며, 이는 다른 잘 확립된곤충 모델의 배아 주입과 비슷합니다5.
이것이 초기 프로토콜이기 때문에이 프로토콜은 개별 진드기 종에 대해 더욱 정제되고 전문화 될 것으로 예상됩니다. 특히, 주사시기는 종마다 다르며, 배아 발생, 특히 세포화?...

틱은 다양한 바이러스, 박테리아, 원생 동물 병원체 및 선충류 1,2를 전염시킬 수있는 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터입니다. 미국 동부에서 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis는 라임 병 (LD) 병원체 인 스피로 헤테 보렐 리아 부르그 도르 페리의 중요한 매개체입니다. 미국에서 매년 400,000건 이상의 LD 사례가 보고되어 미국에서 가장 많이 매개체 매개 전염병이 되었습니다1. B. burgdorferi 외에도 4 개의 박테리아 (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi 및 Ehrlichia muris eauclarensis), 1 개의 원생 동물 기생충 (Babesia microti) 및 1 개의 바이러스 (Powassan 바이러스)를 포함하여 6 개의 다른 미생물이 견갑골에 의해 전염되어이 진드기 종을 주요 공중 보건 문제로 만듭니다3 . 최근 몇 년 동안 진드기 매개 질병이 더 널리 퍼지고 있지만 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학과 유전 및 기능 게놈 도구 4,5 적용과 관련된 문제로 인해 모기와 같은 다른 절지동물 벡터에 뒤쳐져 있습니다.
유전자 편집 기술, 특히 CRISPR / Cas9는 이제 비 모델 유기체에서 기능적 유전체학 연구를 실현 가능하게 만들었습니다. 유기체에서 유전성 돌연변이를 생성하기 위해, 배아 주입은 생식계열 6,7,8,9를 변경하기 위한 구축물을 전달하는 데 선호되는 방법으로 남아 있습니다. 그러나 최근까지4, 진드기 알은 배아10,11을 죽이지 않고 주입하기가 너무 어렵거나 불가능한 것으로 간주되었습니다. 계란의 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력은 진드기에 배아 주입을 방해하는 주요 장애물 중 일부였습니다. 성인, 혈액 공급 I. 견갑골은 3-4 주 (약 100 알 / 일)에 걸쳐 최대 2,000 개의 알12 개로 구성된 단일 클러치를 침착시킵니다. 알은 단독으로 낳고, 각 알은 어머니의 선 Gené의 기관13,14,15의 돌출부 또는 "뿔"에 의해 분비되는 왁스로 코팅됩니다. 이 왁스는 계란을 건조로부터 보호하고 항균 화합물15를 함유하고 있습니다. 진드기 알을 성공적으로 주입하려면 왁스 층을 제거하고 융모막을 부드럽게하고 난자를 건조시켜 타원 내 압력을 낮추어 주입이 난자를 돌이킬 수 없게 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 성공적인 생식계열 형질전환을 위한 배아 주입의 중요성을 이해하고, CRISPR/Cas9 구조를 전달하고 안정적인 생식계열 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있는 I. 견갑골에 대한 프로토콜이 개발되었습니다4. I. scapularis 연구에 대한 기여 외에도이 프로토콜은 다른 진드기 종에도 최적화 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

진드기는 다양한 바이러스, 박테리아 및 원생동물 병원체를 전염시킬 수 있으므로 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터로 간주됩니다. 진드기 매개 질병의 부담이 커지고 있음에도 불구하고 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학에 기능 연구를 위한 유전자 변형 도구를 적용하는 데 어려움이 있기 때문에 곤충 질병 벡터에 뒤쳐져 있습니다. 모기 매개 질병을 줄이기 위해 유전 적 개입이 주목 받고 있습니다. 그러나 이러한 개입의 개발에는 배아 주입에 의한 안정적인 생식선 변형이 필요합니다. 이러한 배아 주입 기술은 진드기를 포함한 킬리 세레이트에 부족합니다. 진드기 배아의 외부 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력과 같은 몇 가지 요인은 이전에 진드기에서 배아 주입 프로토콜 개발을 방해했던 몇 가지 장애물입니다. 현재의 연구는 이러한 장애물을 극복했으며 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis 에 대한 배아 주입 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 안정적인 생식계열 변형을 위해 CRISPR/Cas9와 같은 구성 요소를 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

I. 견갑골에 대한 성공적인 배아 주입 프로토콜은이 기사에서 설명합니다. 알을 낳는 암컷은 부분적으로 왁스 칠한 알의 건조를 피하기 위해 높은 습도에서 보관되었습니다. 왁스 층을 제거하여 중력 암컷의 유전자 기관(왁스 샘)을 절제하여 진드기 배아를 주입했습니다(그림 1A-E). 목이 짧은 알루미노실리케이트 유리 바늘을 사용했습니다(<st...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.

검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

이것은 Chelicerata 종에 대한 최초의 배아 주입 프로토콜입니다. 진드기 배아를 주입하는 능력은 많은 연구 라인, 특히 진드기 유전자 기능과 진드기 병원체 상호 작용에 대한 연구를 열 것입니다. 이 기술은 진드기 유전자의 기능 연구에 대한 향후 작업을 허용하고 유전자 구동 시스템을 사용하여 진드기 개체군 제어의 기초를 제공합니다.이 방법은 진드기와 진드기가 분자 수준에서 보유하고있는 병원체 사이의 상호 작용에 대한 이해를 용이하게합니다. 이를 통해 라임 병 및 기타 병원체에 대한 백신 개발에 사용할 수있는 단백질을 식별 할 수 있습니다. 진드기 병원체 상호 작용 및 먹이를 먹는 동안 진드기에 의한 숙주로의 병원체 전파와 같은 여러 연구 분야가이 연구의 이점을 누릴 것입니다.진드기가 숙주의 면역 반응을 피하는 방법과 DNA 복구 메커니즘의 차이와 같은보다 근본적인 질문도 이제 이해할 수 있습니다. 이 절차를 수행하기 전에 이해해야 할 진드기 생물학의 몇 가지 측면이 있습니다. 배아의 높은 내부 압력은 바늘로 만질 때 파열로 이어집니다.주사를 위해 배아를 준비하는 것은 매우 중요합니다. 시작하려면 암컷을 섭씨 4도에서 섭씨 27도 인큐베이터로 옮겨 주사 일주일 전에 알을 낳습니다. 암컷이 알을 낳기 시작하는 3-4 일 후, Gene의 장기 절제를 위해 암컷을 준비하는 동안 끝이 가늘고 붓을 사용하여 알을 제거하십시오.글 랜드를 비우려면 입 부분이 복부와 등쪽 모두에서 보이도록 현미경으로 유리 슬라이드에 중력 진드기를 배열하십시오. 그런 다음 등 쪽의 입 부분 뒤의 영역을 조심스럽게 뚫고 집게를 사용하여 복부 쪽에 압력을가하십시오. 보푸라기가없는 물티슈의 가장자리를 놓고 펑크 부위에서 나오는 액체 왁스를 제거하십시오.또는 해부로 글 랜드를 비우는 대신 진드기 입 부분 주위에 조직 접착제와 같은 접착제를 사용할 수 있습니다. 암컷이 다시 알을 낳기 시작하면 가는 붓을 사용하여 갓 퇴적된 알을 모아 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 0-18시간 된 계란이 들어 있는 튜브에 약 200마이크로리터의 5% 벤잘코늄 클로라이드 물을 추가합니다.계란이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 붓으로 계란을 5분 동안 부드럽게 휘젓고 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 계란을 튜브에 남겨둡니다. 계란이 들어있는 튜브에 약 200 마이크로 리터의 증류수를 첨가하십시오. 붓으로 소용돌이치며 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 물을 제거합니다.증류수로 세척 한 후 약 200 마이크로 리터의 5 % 염화나트륨을 넣고 붓으로 5 분 동안 부드럽게 소용돌이 치십시오. 그런 다음 5 분 후에 튜브에서 용액을 제거하고 계란을 증류수로 두 번 씻으십시오. 다음으로, 계란이 들어있는 마이크로 원심 분리기 튜브에 약 100 마이크로 리터의 1 % 염화나트륨 용액을 첨가하십시오.먼저 양면 테이프를 사용하여 계란 정렬을 지원하기 위해 약 0.5cm의 간격을 두고 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 함께 접착하고 슬라이드 사이의 간격에 있는 양면 테이프에 투명 필름 드레싱 조각을 적용합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 슬라이드 설정에서 한 번에 8-10개의 계란을 정렬합니다. 그런 다음 정렬된 계란이 있는 슬라이드를 복합 현미경 스테이지에 놓고 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 1% 염화나트륨 용액을 제거합니다.채워진 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마이크로 인젝터에 부착합니다. 다음으로, 마이크로 인젝터의 고압 설정을 사용하여 계란 표면에 부드럽게 문질러 바늘을 엽니다. 바늘을 연 후 바늘의 열림에 따라 마이크로 인젝터의 압력을 줄이십시오.그런 다음 슬라이드의 모든 계란을 가능한 한 빨리 10-15도 각도로 주입하고 풋 페달을 빠르게 밟은 다음 젖은 종이 타월로 페트리 접시에 슬라이드를 습도가 높은 조건으로 즉시 옮깁니다. 주입된 배아가 들어 있는 슬라이드를 축축한 여과지가 깔린 큰 페트리 접시에 5-6시간 동안 넣은 후, 주입된 배아가 부착된 투명 필름 드레싱에 증류수 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 붓을 사용하여 계란을 부드럽게 옮깁니다.다음으로 계란을 작은 페트리 접시에 옮기고 증류수에 담그십시오. 계란을 물에 담그고 페트리 접시를 6쿼트 플라스틱 상자에 담아 섭씨 27도 이상의 인큐베이터에 넣고 상대 습도 90% 이상에서 놓습니다. 유충이 주사 후 21 일에서 25 일 사이에 주입 된 배아에서 부화하기 시작하면 매일 확인하고 부화 한 유충을 스크린이있는 유리 병으로 옮깁니다.결과는 12 시간에서 18 시간 사이의 배아 발생 초기에 난자를 주입하고 난자의 긴 축을 슬라이드 가장자리에 수직으로 정렬하면 주입 된 난자의 생존율이 높아진다는 것을 입증했습니다. 주입 된 모든 알 중 최대 8.5 %생존하고 유충이 부화했습니다. 이 절차를 시작하기 전에 2.4단계, 어미 진드기에서 왁스 제거, 3.1-3.4단계, 염화벤잘코늄으로 배아 융모막을 연화하고 염화나트륨 용액으로 배아를 건조시켜 성공적인 배아 주입을 가능하게 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 방법은 주로 진드기 유전자 편집을 위해 개발되었으며,이를 통해 진드기 유전자 기능을 이해하는 데 도움이되는 녹아웃 및 녹인을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 진드기 연구에 적용될 수있는 다른 많은 유기체에 사용할 수있는 유전자 편집 도구의 사용을 허용합니다. 그리고 이것은 진드기 분자 생물학 연구를 가속화 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...