Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Channa Aluvihare og Yonus Gebermicale, ITF, UMD, for innsikt og støtte i den innledende fasen av protokollutviklingen. Wolframnåler var en sjenerøs gave fra David O'Brochta, ITF, UMD. Vi er takknemlige til Dr. Ladislav Simo for å teste denne protokollen i I. ricinus og for innsiktsfulle diskusjoner. Dette prosjektet ble finansiert av NIH-NIAID R21AI128393 og Plymouth Hill Foundation, NY til MG-N, oppstartsmidler fra University of Nevada til AN, National Science Foundation Grant No. 2019609 til MG-N og AN, og et Peer-to-Peer Grant fra IGTRCN til AS.

Ixodes scapularis voksne ble enten kjøpt fra Oklahoma State University (OSU) eller oppdrettet ved University of Nevada, Reno (UNR) (IACUC protokoll # 21-001-1118).
1. Forberedelse av kvinnelige flått for embryoinnsamling
MERK: For å samle egg av passende alder, er det viktig å synkronisere egglegging. Selv om eggleggingssignaler i flått forblir uklare, begynner I. scapularis-hunnene å legge egg omtrent 8 dager etter vertsløsni...

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Dette er den første protokollen utviklet for å injisere tidlige flåttembryoer vellykket. En overlevelsesrate på ~ 4% -8% er oppnådd, noe som kan sammenlignes med embryoinjeksjon i andre veletablerte insektmodeller5.
Siden dette er den første protokollen, forventes det at denne protokollen vil bli ytterligere raffinert og spesialisert til individuelle flåttarter. Spesielt vil injeksjonstidspunktet variere fra art til art, avhengig av embryogenese, spesielt tidspun...

Ticks er vektorer av medisinsk og veterinær betydning, som er i stand til å overføre en rekke virale, bakterielle, protozoiske patogener og nematoder 1,2. I det østlige USA er svartbenet kryss, Ixodes scapularis, en viktig vektor av Lyme-sykdommen (LD) patogen, spirochete Borrelia burgdorferi. Over 400 000 tilfeller av LD rapporteres hvert år i USA, noe som gjør den til den beste vektorbårne smittsomme sykdommen i USA1. I tillegg til B. burgdorferi overføres seks andre mikroorganismer av I. scapularis- inkludert fire bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi og Ehrlichia muris eauclarensis), en protozoa parasitt (Babesia microti) og ett virus (Powassan-virus), noe som gjør denne flåttarten til et stort folkehelseproblem3 . Mens flåttbårne sykdommer har blitt mer utbredt de siste årene, har forskning på flått falt bak andre leddyrvektorer, som mygg, på grunn av den unike biologien til flått og utfordringer forbundet med å anvende genetiske og funksjonelle genomiske verktøy 4,5.
Genredigeringsteknikker, spesielt CRISPR / Cas9, har nå gjort funksjonelle genomikkstudier gjennomførbare i ikke-modellorganismer. For å skape arvelige mutasjoner i en organisme, forblir embryoinjeksjon den foretrukne metoden for å levere konstruksjoner for å endre kimlinjen 6,7,8,9. Men inntil nylig4 ble flåttegg ansett som for vanskelig eller umulig å injisere uten å drepe embryoet10,11. Et tykt vokslag på egg, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk var noen av de største hindringene som forhindret embryoinjeksjon i flått. Voksen, blodmatet I. scapularis deponerer en enkelt kobling på opptil 2000 egg12 over 3-4 uker (ca. 100 egg/dag). Egg legges enkeltvis, og hvert egg er belagt med voks som skilles ut ved fremspring eller "horn" av glandular Genés organ13,14,15 av moren. Denne voksen beskytter eggene mot uttørking og inneholder antimikrobielle forbindelser15. For å lykkes med å injisere kryssegg, er det viktig å fjerne vokslaget, myke korionen og tørke eggene for å redusere det intraovale trykket slik at injeksjonen ikke irreversibelt skader egget. For å forstå den kritiske betydningen av embryoinjeksjoner for vellykket germline-transformasjon, utvikles en protokoll for I. scapularis, som kan brukes til å levere en CRISPR / Cas9-konstruksjon og generere stabile germlinemutasjoner4. I tillegg til sitt bidrag til I. scapularis-forskning, kan denne protokollen også optimaliseres for andre flåttarter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

Flått kan overføre forskjellige virale, bakterielle og protozoiske patogener og betraktes derfor som vektorer av medisinsk og veterinær betydning. Til tross for den økende byrden av flåttbårne sykdommer, har forskning på flått ligget bak insektsykdomsvektorer på grunn av utfordringer med å anvende genetiske transformasjonsverktøy for funksjonelle studier til den unike biologien til flått. Genetiske inngrep har fått oppmerksomhet for å redusere myggbårne sykdommer. Utviklingen av slike inngrep krever imidlertid stabil kimlinjetransformasjon ved å injisere embryoer. En slik embryoinjeksjonsteknikk mangler for chelicerates, inkludert flått. Flere faktorer, for eksempel et eksternt tykt vokslag på flåttembryoer, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk, er noen hindringer som tidligere forhindret embryoinjeksjonsprotokollutvikling i flått. Det foreliggende arbeidet har overvunnet disse hindringene, og en embryoinjeksjonsteknikk for svartbenet flått, Ixodes scapularis, er beskrevet her. Denne teknikken kan brukes til å levere komponenter, for eksempel CRISPR / Cas9, for stabile germline transformasjoner.

En vellykket embryoinjeksjonsprotokoll for I. scapularis er beskrevet i denne artikkelen. Eggleggende hunner ble holdt ved høy luftfuktighet for å unngå uttørking av delvis voksede egg. Vokslaget ble fjernet for å injisere flåttembryoer ved å forkaste genets organ (vokskjertel) hos den gravide kvinnen (figur 1A-E). Vi brukte aluminiuminosilikatglassnåler med kortere hals (figur 2). Denne formen var ideell for fl...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Denne protokollen beskriver en metode for injeksjon av flåttembryoer. Embryoinjeksjon er den foretrukne teknikken for genetisk manipulasjon for å generere transgene linjer.

Embryoinjeksjonsteknikk for genredigering i svartbenet flått, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Dette er den første embryoinjeksjonsprotokollen for en Chelicerata-art. Evnen til å injisere flåttembryoer vil åpne for mange forskningslinjer, spesielt studier av flåttgenfunksjon og flåttpatogeninteraksjoner. Denne teknikken tillater fremtidig arbeid med funksjonelle studier av flåttgener og gir grunnlag for flåttpopulasjonskontroll ved hjelp av gendriftsystemer.Denne metoden vil lette forståelsen av samspillet mellom flått og patogenene de har på molekylært nivå. Dette vil tillate oss å identifisere proteiner som kan brukes til utvikling av vaksiner for Lyme sykdom og andre patogener. Mens flere forskningsområder som flåttpatogeninteraksjoner og patogenoverføring til verter ved kryss under fôring vil ha nytte av dette arbeidet.Mer grunnleggende spørsmål som hvordan flått unngår immunresponsen til verten, og forskjeller i DNA-reparasjonsmekanismer kan også forstås nå. Det er noen aspekter av kryssbiologi som må forstås før du utfører denne prosedyren. Det høye indre trykket i embryoet fører til sprengning når det berøres av en nål.Det er svært viktig å forberede embryoer til injeksjon. For å begynne, overfør kvinner fra fire grader Celsius til en 27 grader Celsius inkubator for initiering av egglegging en uke før injeksjoner. Etter tre til fire dager når hunnene begynner å legge egg, fjern egg med en fin tippet pensel mens du forbereder hunnene på Genes organablasjon.For å tømme kjertelen, ordne gravid tick på et glassglass under et mikroskop på en måte som munndeler er synlige på både ventrale og dorsale sider. Punkter deretter forsiktig området bak munndelene på dorsalsiden, og trykk på ventralsiden ved hjelp av tang. Plasser kanten på en lofri våtserviett og fjern den flytende voksen som kommer ut av stikkstedet.Alternativt, i stedet for å tømme kjertelen ved disseksjon, kan lim som vevslim brukes rundt flåttmunndelene. Når hunnene begynner å legge egg igjen, bruk en fin pensel for å samle nydeponerte egg og legg dem i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Tilsett ca. 200 mikroliter 5% benzalkoniumkloridvann i røret som inneholder null til 18 timer gamle egg.Virvle eggene forsiktig med penselen i fem minutter for å unngå at eggene legger seg i bunnen av røret, og fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipette, og la eggene ligge igjen i røret. Tilsett ca. 200 mikroliter destillert vann til røret som inneholder egg. Virvle med en pensel og fjern vannet fra mikrosentrifugerøret ved hjelp av en mikropipette.Etter vask med destillert vann, tilsett ca. 200 mikroliter 5% natriumklorid og virvle forsiktig med en pensel i fem minutter. Fjern deretter løsningen fra røret etter fem minutter, og vask eggene to ganger med destillert vann. Deretter tilsettes ca. 100 mikroliter 1% natriumkloridoppløsning i mikrosentrifugerøret som inneholder egg.Først holder du to glassmikroskop lysbilder sammen, og etterlater et gap på ca. 0,5 centimeter for å støtte justering av egg ved hjelp av et dobbeltsidig tape, og påfør et stykke gjennomsiktig filmdressing på dobbeltsidig tape i gapet mellom lysbildene. Juster deretter åtte til 10 egg om gangen på lysbildeoppsettet ved hjelp av en pensel. Legg deretter lysbildet med justerte egg på scenen av et sammensatt mikroskop og fjern 1% natriumkloridoppløsningen ved hjelp av et stykke lofri klut der de er lagret.Fest den fylte kanylen til en mikroinjektor koblet til en mikromanipulator. Deretter åpner du nålen ved å gni den forsiktig mot eggoverflaten ved hjelp av en høytrykksinnstilling på mikroinjektoren. Etter at nålen er åpnet, reduser trykket på mikroinjektoren avhengig av åpningen av nålen.Injiser deretter alle eggene på lysbildet i en 10 til 15 graders vinkel så raskt som mulig, trykk raskt på fotpedalen, og flytt deretter lysbildet til høy luftfuktighet i en petriskål med et fuktig papirhåndkle. Etter fem til seks timer med å plassere lysbildet som inneholder injiserte embryoer i en stor petriskål foret med fuktig filterpapir, tilsett en liten dråpe destillert vann til den gjennomsiktige filmdressingen med injiserte embryoer festet. Plasser deretter eggene forsiktig med en pensel.Overfør deretter eggene til en liten petriskål og senk dem ned i destillert vann. Hold eggene nedsenket i vann, legg petriskålen i en seks liters plastboks i en inkubator ved 27 grader Celsius ved mer enn 90% relativ fuktighet. Når larven begynner å klekkes fra de injiserte embryoene 21 til 25 dager etter injeksjonen, kontroller dem daglig og overfør eventuelle klekkede larver til glassflasker med en skjerm på toppen.Resultatene viste at injeksjon av eggene tidlig i embryogenese 12 til 18 timer gammel, og justering av eggets lengre akse vinkelrett på kanten av lysbildet, resulterer i en høyere overlevelsesrate for de injiserte eggene. Av alle de injiserte eggene overlevde opptil 8,5% og larven klekket. Før du begynner denne prosedyren, er det viktig å huske trinn 2.4, fjerning av voksen fra moderkrysset og trinn 3.1 til 3.4, mykning av korionen av embryoet med benzalkoniumklorid og uttørking av embryoet med natriumkloridløsninger for å muliggjøre vellykket embryoinjeksjon.Denne metoden ble utviklet primært for flåttgenredigering, og dette vil tillate oss å gjøre knockouts og knock-ins som vil hjelpe oss å forstå flåttgenfunksjonen. Denne teknikken vil tillate bruk av genredigeringsverktøy tilgjengelig for mange andre organismer som skal brukes til flåttforskning. Og dette vil akselerere flåttmolekylærbiologiforskningen.

Research

JoVE Journal

Biology

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

En enkel og effektiv metode i Vivo hjerte-spesifikke Gene manipulering av Intramyocardial injeksjon i mus

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal og voksen injeksjoner for RNAi og CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...