Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
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Los autores agradecen a Channa Aluvihare y Yonus Gebermicale, ITF, UMD, por su conocimiento y apoyo durante la fase inicial del desarrollo del protocolo. Las agujas de tungsteno fueron un generoso regalo de David O'Brochta, ITF, UMD. Estamos agradecidos al Dr. Ladislav Simo por probar este protocolo en I. ricinus y por las discusiones perspicaces. Este proyecto fue financiado por NIH-NIAID R21AI128393 y Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondos iniciales de la Universidad de Nevada a AN, la Subvención No. 2019609 de la Fundación Nacional de Ciencias a MG-N y AN, y una subvención Peer-to-Peer de IGTRCN a AS.

Los adultos de Ixodes scapularis fueron comprados en la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU) o criados en la Universidad de Nevada, Reno (UNR) (protocolo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparación de garrapatas hembras para la recolección de embriones
NOTA: Para recolectar huevos de edad apropiada, es importante sincronizar la puesta de huevos. Aunque las señales de puesta de huevos en las garrapatas siguen sin estar claras, bajo las condicione...

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Este es el primer protocolo desarrollado para inyectar embriones tempranos de garrapatas con éxito. Se ha logrado una tasa de supervivencia de ~4%-8%, que es comparable a la inyección de embriones en otros modelos de insectos bien establecidos5.
Como este es el protocolo inicial, se anticipa que este protocolo se perfeccionará y especializará aún más para las especies individuales de garrapatas. En particular, el momento de la inyección variará de una especie a ...

Las garrapatas son vectores de importancia médica y veterinaria, capaces de transmitir una variedad de patógenos virales, bacterianos, protozoarios y nematodos 1,2. En el este de los Estados Unidos, la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis, es un vector importante del patógeno de la enfermedad de Lyme (LD), la espiroqueta Borrelia burgdorferi. Más de 400,000 casos de LD se reportan cada año en los Estados Unidos, lo que la convierte en la principal enfermedad infecciosa transmitida por vectores en los Estados Unidos1. Además de B. burgdorferi, otros seis microorganismos son transmitidos por I. scapularis, incluidas cuatro bacterias (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamoto y Ehrlichia muris eauclarensis), un parásito protozoario (Babesia microti) y un virus (virus Powassan), lo que hace que esta especie de garrapata sea un importante problema de salud pública3 . Mientras que las enfermedades transmitidas por garrapatas se han vuelto más prevalentes en los últimos años, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de otros artrópodos vectores, como los mosquitos, debido a la biología única de las garrapatas y los desafíos asociados con la aplicación de herramientas genómicas genéticas y funcionales 4,5.
Las técnicas de edición de genes, particularmente CRISPR / Cas9, ahora han hecho factibles los estudios de genómica funcional en organismos no modelo. Para crear mutaciones hereditarias en un organismo, la inyección de embriones sigue siendo el método preferido para entregar constructos para alterar la línea germinal 6,7,8,9. Sin embargo, hasta hace poco4, los huevos de garrapatas se consideraban demasiado difíciles o incluso imposibles de inyectar sin matar el embrión10,11. Una gruesa capa de cera en los huevos, corion duro y alta presión intraovalada fueron algunos de los principales obstáculos que impidieron la inyección de embriones en garrapatas. I. scapularis adulto, alimentado con sangre, deposita una sola nidada de hasta 2.000 huevos12 durante 3-4 semanas (aproximadamente 100 huevos/día). Los huevos se ponen individualmente, y cada huevo está cubierto con cera que es secretada por protuberancias o "cuernos" del órgano glandular de Gené13,14,15 de la madre. Esta cera protege los huevos de la desecación y contiene compuestos antimicrobianos15. Para inyectar con éxito los huevos de garrapata, es importante quitar la capa de cera, ablandar el corion y desecar los huevos para disminuir la presión intraovalada para que la inyección no dañe irreversiblemente el huevo. Entendiendo la importancia crítica de las inyecciones de embriones para una transformación exitosa de la línea germinal, se desarrolla un protocolo para I. scapularis, que se puede utilizar para administrar una construcción CRISPR / Cas9 y generar mutaciones estables de la línea germinal4. Además de su contribución a la investigación de I. scapularis, este protocolo también podría optimizarse para otras especies de garrapatas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

Las garrapatas pueden transmitir varios patógenos virales, bacterianos y protozoarios y, por lo tanto, se consideran vectores de importancia médica y veterinaria. A pesar de la creciente carga de enfermedades transmitidas por garrapatas, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de los vectores de enfermedades de insectos debido a los desafíos en la aplicación de herramientas de transformación genética para estudios funcionales a la biología única de las garrapatas. Las intervenciones genéticas han ido ganando atención para reducir las enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, el desarrollo de tales intervenciones requiere una transformación estable de la línea germinal mediante la inyección de embriones. Tal técnica de inyección de embriones es deficiente para los quelicerados, incluidas las garrapatas. Varios factores, como una capa externa de cera gruesa en embriones de garrapatas, corion duro y alta presión intraovalada, son algunos obstáculos que anteriormente impedían el desarrollo del protocolo de inyección de embriones en garrapatas. El presente trabajo ha superado estos obstáculos, y aquí se describe una técnica de inyección de embriones para la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis . Esta técnica se puede utilizar para administrar componentes, como CRISPR / Cas9, para transformaciones estables de la línea germinal.

En este artículo se describe un protocolo exitoso de inyección de embriones para I. scapularis. Las hembras ponedoras de huevos se mantuvieron a alta humedad para evitar la desecación de los huevos parcialmente encerados. La capa de cera se eliminó para inyectar embriones de garrapatas mediante la ablación del órgano del gen (glándula de cera) de la hembra grávida (Figura 1A-E). Se utilizaron agujas de vidrio de aluminosilicato con un cuello...

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Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

El presente protocolo describe un método para inyectar embriones de garrapata. La inyección de embriones es la técnica preferida para la manipulación genética para generar líneas transgénicas.

Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Este es el primer protocolo de inyección de embriones para una especie de Chelicerata. La capacidad de inyectar embriones de garrapatas abrirá muchas líneas de investigación, en particular, estudios sobre la función del gen de la garrapata y las interacciones de patógenos de garrapatas. Esta técnica permite el trabajo futuro en estudios funcionales de genes de garrapatas y proporciona una base para el control de la población de garrapatas mediante el uso de sistemas de impulsores genéticos.Este método facilitará la comprensión de la interacción entre las garrapatas y los patógenos que albergan a nivel molecular. Esto nos permitirá identificar proteínas que pueden usarse para el desarrollo de vacunas para la enfermedad de Lyme y otros patógenos. Mientras que varias áreas de investigación, como las interacciones de patógenos de garrapatas y la transmisión de patógenos a los huéspedes por garrapata durante la alimentación, se beneficiarán de este trabajo.Preguntas más fundamentales, como cómo evaden las garrapatas la respuesta inmune del huésped, y las diferencias en los mecanismos de reparación del ADN también se pueden entender ahora. Hay algunos aspectos de la biología de las garrapatas que deben entenderse antes de llevar a cabo este procedimiento. La alta presión interna del embrión conduce a estallar cuando se toca con una aguja.Es muy importante preparar los embriones para la inyección. Para comenzar, transfiera a las hembras de cuatro grados centígrados a una incubadora de 27 grados centígrados para el inicio de la puesta de huevos una semana antes de las inyecciones. Después de tres o cuatro días, cuando las hembras comiencen a poner huevos, retire los huevos con un pincel de punta fina mientras prepara a las hembras para la ablación de órganos de Gene.Para vaciar la glándula, coloque la garrapata grávida en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de manera que las partes de la boca sean visibles tanto en el lado ventral como en el dorsal. Luego perfore cuidadosamente el área detrás de las partes de la boca en el lado dorsal y aplique presión en el lado ventral con fórceps. Coloque el borde de una toallita sin pelusa y retire la cera líquida que sale del sitio de punción.Alternativamente, en lugar de vaciar la glándula por disección, se pueden usar pegamentos como adhesivo tisular alrededor de las partes de la boca de la garrapata. Cuando las hembras comiencen a poner huevos nuevamente, use un pincel fino para recolectar los huevos recién depositados y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua de cloruro de benzalconio al 5% en el tubo que contiene huevos de cero a 18 horas de edad.Agite suavemente los huevos con el pincel durante cinco minutos para evitar que los huevos se depositen en el fondo del tubo, y retire el sobrenadante con una micropipeta, dejando los huevos en el tubo. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua destilada al tubo que contiene huevos. Revuelva con un pincel y retire el agua del tubo de microcentrífuga con una micropipeta.Después de lavar con agua destilada, agregue aproximadamente 200 microlitros de cloruro de sodio al 5% y agite suavemente con un pincel durante cinco minutos. Luego, retire la solución del tubo después de cinco minutos y lave los huevos dos veces con agua destilada. A continuación, agregue aproximadamente 100 microlitros de solución de cloruro de sodio al 1% en el tubo de microcentrífuga que contiene huevos.Primero, adhiera dos portaobjetos de microscopio de vidrio juntos, dejando un espacio de aproximadamente 0,5 centímetros para apoyar la alineación de los huevos con una cinta de doble cara, y aplique un trozo de apósito de película transparente en la cinta de doble cara en el espacio entre los portaobjetos. Luego alinee de ocho a 10 huevos a la vez en la configuración de la diapositiva con un pincel. Luego coloque el portaobjetos con huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto y retire la solución de cloruro de sodio al 1% con un trozo de toallita sin pelusa en la que se almacenan.Conecte la aguja de inyección llena a un microinyector conectado a un micromanipulador. A continuación, abra la aguja frotándola suavemente contra la superficie del huevo utilizando un ajuste de alta presión en el microinyector. Después de abrir la aguja, reduzca la presión del microinyector dependiendo de la abertura de la aguja.Luego inyecte todos los huevos en el portaobjetos en un ángulo de 10 a 15 grados lo más rápido posible, presione rápidamente el pedal e inmediatamente mueva el tobogán a condiciones de alta humedad en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda. Después de cinco a seis horas de colocar el portaobjetos que contiene embriones inyectados en una placa de Petri grande forrada con papel de filtro húmedo, agregue una pequeña gota de agua destilada al aderezo de película transparente con embriones inyectados adheridos. Luego, desplaza suavemente los huevos con un pincel.A continuación, transfiera los huevos a una pequeña placa de Petri y sumérjalos en agua destilada. Mantenga los huevos sumergidos en agua, coloque la placa de Petri en una caja de plástico de seis cuartos en una incubadora a 27 grados centígrados a más del 90% de humedad relativa. Cuando la larva comience a eclosionar de los embriones inyectados de 21 a 25 días después de la inyección, verifíquelos diariamente y transfiera las larvas eclosionadas a viales de vidrio con una pantalla en la parte superior.Los resultados demostraron que inyectar los óvulos temprano en la embriogénesis de 12 a 18 horas de edad, y alinear el eje más largo del huevo perpendicular al borde de la diapositiva da como resultado una mayor tasa de supervivencia de los óvulos inyectados. De todos los huevos inyectados, hasta el 8,5% sobrevivieron y la larva eclosionó. Antes de comenzar este procedimiento, es importante recordar los pasos 2.4, eliminación de la cera de la garrapata madre, y los pasos 3.1 a 3.4, ablandamiento del corion del embrión con cloruro de benzalconio y desecación del embrión con soluciones de cloruro de sodio para permitir una inyección exitosa del embrión.Este método fue desarrollado principalmente para la edición de genes de garrapatas, y esto nos permitirá hacer knockouts y knock-ins que nos ayudarán a comprender la función del gen de la garrapata. Esta técnica permitirá el uso de herramientas de edición de genes disponibles para muchos otros organismos que se aplicarán a la investigación de garrapatas. Y esto acelerará la investigación de la biología molecular de las garrapatas.

Research

JoVE Journal

Biology

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

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