Name: embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Författarna erkänner Channa Aluvihare och Yonus Gebermicale, ITF, UMD, för insikt och stöd under den inledande fasen av protokollutveckling. Volframnålar var en generös gåva från David O'Brochta, ITF, UMD. Vi är tacksamma mot Dr. Ladislav Simo för att ha testat detta protokoll i I. ricinus och för insiktsfulla diskussioner. Detta projekt finansierades av NIH-NIAID R21AI128393 och Plymouth Hill Foundation, NY till MG-N, startmedel från University of Nevada till AN, National Science Foundation Grant nr 2019609 till MG-N och AN, och ett Peer-to-Peer-bidrag från IGTRCN till AS.

Ixodes scapularis vuxna köptes antingen från Oklahoma State University (OSU) eller uppföddes vid University of Nevada, Reno (UNR) (IACUC-protokoll #21-001-1118).
1. Beredning av kvinnliga fästingar för embryosamling
OBS: För att samla ägg av lämplig ålder är det viktigt att synkronisera äggläggning. Även om äggläggningssignaler i fästingar förblir oklara, under de vanliga insektsförhållandena (27 ° C temperatur och >90% re...

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Detta är det första protokollet som utvecklats för att injicera tidiga fästingembryon framgångsrikt. En överlevnad på ~4%-8% har uppnåtts, vilket är jämförbart med embryoinjektion i andra väletablerade insektsmodeller5.
Eftersom detta är det ursprungliga protokollet förväntas detta protokoll förfinas ytterligare och specialiseras till enskilda fästingarter. I synnerhet kommer injektionstiden att variera från art till art, beroende på embryogenes, sär...

Fästingar är vektorer av medicinsk och veterinär betydelse, som kan överföra en mängd olika virala, bakteriella, protozoa patogener och nematoder 1,2. I östra USA är den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, en viktig vektor av borreliapatogenen (LD), spiroketen Borrelia burgdorferi. Över 400 000 fall av LD rapporteras varje år i USA, vilket gör det till den främsta vektorburna infektionssjukdomen i USA1. Förutom B. burgdorferi överförs sex andra mikroorganismer av I. scapularis- inklusive fyra bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi och Ehrlichia muris eauclarensis), en protozo parasit (Babesia microti) och ett virus (Powassan-virus), vilket gör denna fästingart till ett stort folkhälsoproblem3 . Medan fästingburna sjukdomar har blivit vanligare de senaste åren, har forskning om fästingar hamnat efter andra leddjursvektorer, såsom myggor, på grund av fästingarnas unika biologi och utmaningar i samband med tillämpning av genetiska och funktionella genomiska verktyg 4,5.
Genredigeringstekniker, särskilt CRISPR/Cas9, har nu gjort funktionsgenomikstudier möjliga i icke-modellorganismer. För att skapa ärftliga mutationer i en organism förblir embryoinjektion den föredragna metoden för att leverera konstruktioner för att ändra könslinjen 6,7,8,9. Men fram till nyligen4 ansågs fästingägg vara för svåra eller till och med omöjliga att injicera utan att döda embryot10,11. Ett tjockt vaxlager på ägg, hård korion och högt intra-ovalt tryck var några av de största hindren som förhindrade embryoinjektion i fästingar. Vuxen, blodmatad I. scapularis deponerar en enda koppling på upp till 2,000 ägg12 under 3-4 veckor (cirka 100 ägg / dag). Ägg läggs ensamt och varje ägg beläggs med vax som utsöndras av utsprång eller "horn" av körteln Genés organ13,14,15 av modern. Detta vax skyddar äggen från uttorkning och innehåller antimikrobiella föreningar15. För att framgångsrikt injicera fästingägg är det viktigt att ta bort vaxskiktet, mjuka korionen och torka äggen för att minska det intraovala trycket så att injektionen inte irreversibelt skadar ägget. För att förstå den kritiska betydelsen av embryoinjektioner för framgångsrik bakterietransformation utvecklas ett protokoll för I. scapularis, som kan användas för att leverera en CRISPR / Cas9-konstruktion och generera stabila bakteriemutationer4. Förutom dess bidrag till I. scapularis-forskningen kan detta protokoll också optimeras för andra fästingarter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum silicate capillaries, with filament</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g</td>
			<td>TCI-America</td>
			<td>B0414</td>
			<td>Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>300-101</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Wipes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>88-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Loading the pulled needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>ROE-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides- plain, ground edges</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-100</td>
			<td>Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
			<td>Embryo treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>34-8716-3417-5</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>Post-injection care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm/ Transparent film dressing</td>
			<td>3M Healthcare</td>
			<td>1628</td>
			<td>Embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10130-10</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DNT7ZK3</td>
			<td>Gene`s organ manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>MPC-200</td>
			<td>Embryo injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, ixodes scapularis

Fästingar kan överföra olika virala, bakteriella och protozoa patogener och anses därför vara vektorer av medicinsk och veterinär betydelse. Trots den växande bördan av fästingburna sjukdomar har forskningen om fästingar släpat efter insektssjukdomsvektorer på grund av utmaningar med att tillämpa genetiska omvandlingsverktyg för funktionella studier på fästingarnas unika biologi. Genetiska ingrepp har fått uppmärksamhet för att minska myggburna sjukdomar. Utvecklingen av sådana ingrepp kräver emellertid stabil bakterieomvandling genom injektion av embryon. En sådan embryoinjektionsteknik saknas för chelicerat, inklusive fästingar. Flera faktorer, såsom ett yttre tjockt vaxlager på fästingembryon, hård korion och högt intra-ovalt tryck, är några hinder som tidigare förhindrade embryoinjektionsprotokollutveckling hos fästingar. Det aktuella arbetet har övervunnit dessa hinder, och en embryoinjektionsteknik för den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis, beskrivs här. Denna teknik kan användas för att leverera komponenter, såsom CRISPR/Cas9, för stabila bakterietransformationer.

Ett framgångsrikt embryoinjektionsprotokoll för I. scapularis beskrivs i denna artikel. Äggläggande kvinnor hölls vid hög luftfuktighet för att undvika uttorkning av delvis vaxade ägg. Vaxskiktet avlägsnades för att injicera fästingembryon genom att ablatera genens organ (vaxkörtel) hos den gravida honan (figur 1A-E). Vi använde aluminosilikatglasnålar med kortare hals (figur 2). Denna form var idealisk f?...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis at JoVE.com

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Detta protokoll beskriver en metod för att injicera fästingembryon. Embryoinjektion är den föredragna tekniken för genetisk manipulation för att generera transgena linjer.

Embryoinjektionsteknik för genredigering i den svartbenta fästingen, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Detta är det första embryoinjektionsprotokollet för en Chelicerata-art. Förmågan att injicera fästingembryon kommer att öppna många forskningslinjer, särskilt studier av fästinggenens funktion och fästingpatogeninteraktioner. Denna teknik möjliggör framtida arbete med funktionella studier av fästinggener och ger en grund för fästingpopulationskontroll genom att använda gendrivsystem.Denna metod kommer att underlätta förståelsen av interaktionen mellan fästingar och de patogener som de har på molekylär nivå. Detta gör det möjligt för oss att identifiera proteiner som kan användas för utveckling av vacciner mot borrelia och andra patogener. Medan flera forskningsområden som fästingpatogeninteraktioner och patogenöverföring till värdar med fästing under utfodring kommer att dra nytta av detta arbete.Mer grundläggande frågor som hur fästingar undviker värdens immunsvar och skillnader i DNA-reparationsmekanismer kan också förstås nu. Det finns några aspekter av fästingbiologi som måste förstås innan du utför denna procedur. Embryots höga inre tryck leder till sprängning när det berörs av en nål.Det är mycket viktigt att förbereda embryon för injektion. Börja med att överföra kvinnor från fyra grader Celsius till en 27 grader Celsius inkubator för initiering av äggläggning en vecka före injektioner. Efter tre till fyra dagar när honorna börjar lägga ägg, ta bort eventuella ägg med en fin spetsad pensel medan du förbereder honorna för Gene organablation.För att tömma körteln, ordna gravidfästingen på en glasskiva under ett mikroskop på ett sätt som mundelar är synliga på både ventrala och dorsala sidor. Punktera sedan försiktigt området bakom mundelarna på dorsalsidan och applicera tryck på den ventrala sidan med pincett. Placera kanten på en luddfri torkduk och ta bort det flytande vaxet som kommer ut från punkteringsstället.Alternativt, istället för att tömma körteln genom dissektion, kan lim som vävnadslim användas runt fästmunens delar. När honorna börjar lägga ägg igen, använd en fin pensel för att samla nyligen deponerade ägg och placera dem i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt cirka 200 mikroliter 5% bensalkoniumkloridvatten i röret som innehåller noll till 18 timmar gamla ägg.Virvla försiktigt äggen med penseln i fem minuter för att undvika att äggen sätter sig i botten av röret och ta bort supernatanten med en mikropipett och lämna äggen kvar i röret. Tillsätt cirka 200 mikroliter destillerat vatten till röret som innehåller ägg. Virvla med en pensel och ta bort vattnet från mikrocentrifugröret med en mikropipett.Efter tvättning med destillerat vatten, tillsätt cirka 200 mikroliter 5% natriumklorid och virvla försiktigt med en pensel i fem minuter. Ta sedan bort lösningen från röret efter fem minuter och tvätta äggen två gånger med destillerat vatten. Tillsätt sedan cirka 100 mikroliter 1% natriumkloridlösning i mikrocentrifugröret innehållande ägg.Fäst först två glasmikroskopglas tillsammans och lämna ett mellanrum på cirka 0,5 centimeter för att stödja inriktning av ägg med en dubbelsidig tejp och applicera en bit transparent filmförband på den dubbelsidiga tejpen i gapet mellan bilderna. Rikta sedan in åtta till 10 ägg åt gången på bildinställningen med en pensel. Placera sedan bilden med inriktade ägg på scenen i ett sammansatt mikroskop och ta bort 1% natriumkloridlösningen med en bit luddfri torkning där de lagras.Fäst den fyllda injektionsnålen på en mikroinjektor ansluten till en mikromanipulator. Öppna sedan nålen genom att försiktigt gnugga den mot äggytan med en högtrycksinställning på mikroinjektorn. När nålen har öppnats, minska trycket på mikroinjektorn beroende på nålens öppning.Injicera sedan alla ägg på bilden i 10 till 15 graders vinkel så snabbt som möjligt, tryck snabbt på fotpedalen och flytta omedelbart bilden till hög luftfuktighet i en petriskål med en fuktig pappershandduk. Efter fem till sex timmars placering av bilden som innehåller injicerade embryon i en stor petriskål fodrad med fuktigt filterpapper, tillsätt en liten droppe destillerat vatten till den transparenta filmförbandet med injicerade embryon fästa. Flytta sedan äggen försiktigt med en pensel.Överför sedan äggen till en liten petriskål och sänk ner dem i destillerat vatten. Håll äggen nedsänkta i vatten, placera petriskålen i en sex liter plastlåda i en inkubator vid 27 grader Celsius vid mer än 90% relativ fuktighet. När larven börjar kläckas från de injicerade embryona 21 till 25 dagar efter injektionen, kontrollera dem dagligen och överför eventuella kläckta larver till glasflaskor med en skärm ovanpå.Resultaten visade att injektion av äggen tidigt i embryogenesen 12 till 18 timmar gammal, och justering av äggets längre axel vinkelrätt mot kanten av bilden resulterar i en högre överlevnad av de injicerade äggen. Av alla injicerade ägg överlevde upp till 8,5% och larven kläcktes. Innan du börjar denna procedur är det viktigt att komma ihåg steg 2.4, avlägsnande av vaxet från moderfästingen och steg 3.1 till 3.4, mjukning av embryots korion med bensalkoniumklorid och uttorkning av embryot med natriumkloridlösningar för att möjliggöra framgångsrik embryoinjektion.Denna metod utvecklades främst för redigering av fästinggener, och detta gör att vi kan göra knockouts och knock-ins som hjälper oss att förstå fästinggenens funktion. Denna teknik kommer att göra det möjligt att använda genredigeringsverktyg som är tillgängliga för många andra organismer för att tillämpas på fästingforskning. Och detta kommer att påskynda den molekylärbiologiska forskningen om fästingar.

Research

JoVE Journal

Biology

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay för Neural induktion i Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofysiologiska Inspelning i Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion och testning av Hypoxi i cellodling

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Spårning Deformationer Morphogenetic Tissue i tidig Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

En enkel och effektiv metod för In Vivo hjärt-specifik gen Manipulation av Intramyocardial injektion i möss

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal och vuxna injektioner för RNAi och CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...