Name: hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

تم دعم هذا العمل بمنح من الوزارة الاتحادية الألمانية للشؤون الاقتصادية والعمل المناخي (ZIM) ومن الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (KMUinnovativ). نشكر شركة FUJIFILM Cellular Dynamics، Inc (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب و Ncardia B.V. (ليدن ، هولندا) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب ، المستخدمة في هذه الدراسة.

ملاحظة: يرد سير العمل لقياس الانقباض والمعاوقة / EFP في الشكل التكميلي 2.
1. طلاء لوحة
<ol><li>افتح العبوة محكمة الغلق وأخرج اللوحة المكونة من 96 بئرا. إجراءات المناولة لألواح 96 بئرا لكلتا الوحدتين هي نفسها. اترك لوحة الانكماش مغطاة بواقي الغشاء المزود بشكل إضافي...

<ol>
	<li>Weaver, R. J., Valentin, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Today's+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+&amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &amp;#34;mind-the-gap&amp;#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li><li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell+(iPSC)-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology:+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization.">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li><li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+Validation+studies+and+best+practice+recommendations.">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).</li><li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells:+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation.">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes.">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment.">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).</li><li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue.">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li><li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cardiac+cell+culture:+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications.">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).</li><li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines.">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li><li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline+cardiotoxicity:+prevalence,+pathogenesis+and+treatment.">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li><li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracycline-induced+cardiotoxicity:+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+(hiPSC-CMs).">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li><li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart.">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li><li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development.">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).</li><li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility.">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li><li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy.">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li><li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings.">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li><li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance.">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li><li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes.">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li><li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Workshop+report:+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms.">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings.">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).</li></ol>

يعد النظام الهجين للمقاومة / EFP / الانقباض منهجية شاملة للتقييم الدوائي والسمي عالي الإنتاجية للالتزامات القلبية لتطوير الأدوية قبل السريرية. يوفر نهجا حديثا لاختبار السلامة قبل السريرية دون استخدام النماذج الحيوانية ، ولكن مع قدرات إنتاجية أعلى تقلل بشكل كبير من الوقت والتكاليف. هذا الن...

أحد الأهداف الرئيسية لتطوير الأدوية الحديثة هو تحسين معدل نجاح العلاجات الجديدة في خط أنابيب اكتشاف الأدوية. غالبا ما تكشف الاختبارات الدوائية الآمنة لهذه الأدوية الجديدة عن تفاعلات دوائية ضارة على نظام القلب والأوعية الدموية الذي يمثل ما يقرب من ربع معدل استنزاف الدواء في المراحل قبل السريرية1. يلعب تطوير ودمج منهجيات النهج الجديدة (NAMs) دورا رئيسيا في تحديث التقييم قبل السريري ، ولا سيما أجهزة البطارية الأساسية مثل القلب. نظرا لأن هذه المنهجيات هي نهج خالية من الحيوانات ، فإن استخدام نماذج الخلايا البشرية مثل خلايا عضلة القلب (CMs) من أصل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) أصبح العمود الفقري على مدار العقد الماضي للتقييم الحديث للقضايا الدوائية والسميةللسلامة 2. أنظمة الفحص المستخدمة على نطاق واسع لمثل هذه التحقيقات هي مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) والنهج التجريبية القائمة على الصبغة الحساسة للجهد3.
ومع ذلك ، فإن عدم النضج الظاهري والوظيفي المزعوم لهذا النوع من الخلايا يضع عقبات في طريق نموذج الخلية المثالي القائم على الإنسان ، مع إمكانية تقليل الفجوات الانتقالية بين الدراسات غير السريرية والسريرية4.
تم إجراء أبحاث هائلة على مر السنين لفهم سبب النمط الظاهري الضمني غير الناضج وإيجاد طرق لدفع عملية نضج iPSC-CMs البشرية في المختبر.
تبين أن الافتقار إلى إشارات النضج القلبي مثل أوقات زراعة الخلايا المطولة ، أو عدم وجود أنواع أخرى من الخلايا في المنطقة المجاورة ، أو نقص التحفيز الهرموني يؤثر على عملية النضج5. أيضا ، تم تحديد البيئة غير الفسيولوجية لألواح زراعة الخلايا العادية كسبب مهم يعيق نضوج iPSC-CMs البشرية ، بسبب تصلب الركيزة الفسيولوجية المفقودة لقلب الإنسان الأصلي 5,6.
تم تطوير أنظمة فحص مختلفة مع التركيز على الظروف الفسيولوجية الأصلية لمعالجة هذه المشكلة ، بما في ذلك أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد حيث يتم محاذاة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتشبه بنية القلب الأصلية بدلا من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد النموذجية7. على الرغم من الحصول على نضج محسن باستخدام فحوصات 3D ، فإن الحاجة إلى قوة عاملة ماهرة وإنتاجية منخفضة لهذه الأنظمة تعوق الاستخدام الوفير لهذا في عملية تطوير الأدوية ، حيث يلعب الوقت والتكلفة دورا أساسيا في تقييم العلاجات الجديدة على المستوى المالي8.
قراءات مهمة للسلامة التقييم الدوائي والسمي للعلاجات الجديدة هي تغييرات في الخصائص الوظيفية والهيكلية ل iPSC-CMs البشرية ، لأن التفاعلات الدوائية الضارة التي يسببها المركب لنظام القلب والأوعية الدموية عادة ما تؤثر على أحد هذه الخصائص أو كليهما 1,9. الأمثلة المعروفة لمثل هذه التفاعلات السلبية الواسعة هي الأدوية المضادة للسرطان من عائلة أنثراسيكلين. هنا ، يتم الإبلاغ على نطاق واسع عن الآثار الهيكلية الوظيفية والضارة الخطرة على نظام القلب والأوعية الدموية أثناء وبعد علاج السرطان في المرضى وكذلك مع المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر 10,11.
في هذه الدراسة ، وصفنا منهجية شاملة لتقييم كل من الآثار الجانبية المركبة الوظيفية والهيكلية على hiPSC-CMs. تتضمن المنهجية تحليل قوة انقباض خلايا عضلة القلب وتحليل المعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP). يتم قياس قوة الانقباض في ظل الظروف الميكانيكية الفسيولوجية ، مع الخلايا المستزرعة على ركائز سيليكون ناعمة (33 كيلو باسكال) ، مما يعكس البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب البشرية الأصلية.
تم تجهيز النظام بألواح 96 بئرا لتحليل الإنتاجية العالية ل iPSC-CMs البشرية للدراسات الدوائية والسمية لسلامة القلب قبل السريرية ، وبالتالي يوفر ميزة لنهج 3D المستخدمة حاليا مثل Langendorff القلب أو شرائح القلب12,13.
بالتفصيل ، يتكون النظام الهجين من وحدتين ، إما لتقييم انقباض القلب في ظل الظروف الفسيولوجية أو تحليل السمية الهيكلية الخلوية في الوقت الفعلي 6,14. تعمل كلتا الوحدتين مع لوحات متخصصة عالية الإنتاجية من 96 بئرا للحصول على البيانات بسرعة وفعالية من حيث التكلفة.
بدون الحاجة إلى بناء 3D ، تستخدم وحدة الانقباض لوحات خاصة تحتوي على أغشية سيليكون مرنة كركيزة للخلايا بدلا من الزجاج الصلب أو البلاستيك الذي تتكون منه عادة لوحات زراعة الخلايا العادية. تعكس الأغشية خصائص القلب الميكانيكية الحيوية البشرية النموذجية ، وبالتالي تحاكي الظروف في الجسم الحي بطريقة إنتاجية عالية. في حين أن iPSC-CMs البشرية غالبا ما تفشل في إظهار سلوك خلايا عضلة القلب البالغة فيما يتعلق بتقلص التقلص العضلي الإيجابي الناجم عن المركب في المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا14 ، يمكن تقييم تفاعل أكثر شبها بالبالغين عندما يتم استزراع الخلايا على ألواح وحدة الانقباض. في الدراسات السابقة ، ثبت أن iPSC-CMs تظهر تأثيرات مؤثرة في التقلص العضلي إيجابية عند العلاج بمركبات مثل الأيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil 6,15. هنا ، يمكن تقييم معلمات انقباض متعددة ، مثل المعلمات الأولية مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ، ومدة الضرب ، ومعدل الضرب ، بالإضافة إلى المعلمات الثانوية لدورة الانكماش مثل المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، والانكماش ، ومنحدرات الاسترخاء ، وتغيرات معدل الضرب ، وعدم انتظام ضربات القلب (الشكل التكميلي 1)16 . يتم تقييم التغيرات التي يسببها الدواء في جميع المعلمات بشكل غير جراحي بواسطة استشعار المسافة بالسعة. يتم تحليل البيانات الأولية لاحقا بواسطة برامج متخصصة.
تضيف وحدة السمية الهيكلية معاوقة فريدة ومعلمات EFP كقراءة للسمية الخلوية الهيكلية وتحليل الخصائص الفيزيولوجية الكهربية17,18. تكشف تقنية التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية عن التغيرات التي يسببها المركب في كثافة الخلايا أو سلامة الخلية والطبقة الأحادية التي يتم رصدها في الوقت الفعلي ، كما هو موضح مع iPSC-CMs البشرية المعالجة بمركبات سامة للقلبمعروفة 13. مع قراءات المعاوقة على ترددات مختلفة (1-100 كيلو هرتز) ، من الممكن تشريح الاستجابة الفسيولوجية بشكل أكبر ، وبالتالي يمكن الكشف عن التغييرات في تضاريس الغشاء أو تقاطعات الخلية الخلوية أو مصفوفة الخلية. يتيح تسجيل EFP الإضافي ل iPSC-CMs البشرية تحليل التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية الناتجة عن المعالجة المركبة ، كما هو موضح في ضوء دراسة CiPA17,19.
في هذه الدراسة ، تم استخدام iPSC-CMs البشرية ، وعولجوا ب epirubicin و doxorubicin ، وكلاهما موصوف جيدا بأنه أنثراسيكلين سام للقلب ، و erlotinib ، مثبط التيروزين كيناز (TKI) مع خطر منخفض إلى حد ما من سمية القلب والأوعية الدموية. تم إجراء تقييم مزمن باستخدام epirubicin و doxorubicin و erlotinib لمدة 5 أيام. تظهر النتيجة تغيرات طفيفة في الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجة الخلايا ب erlotinib ، ولكن انخفاض السمية المعتمدة على الوقت والجرعة في سعة الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجتها ب epirubicin و doxorubicin على التوالي. تم إجراء القياسات الحادة باستخدام نيفيديبين حاصرات قنوات الكالسيوم وأظهرت انخفاضا في سعة الانقباض ومدة جهد المجال ومقاومة القاعدة ، مما يدل على الآثار الجانبية السمية للقلب لهذا المركب على المستويات الوظيفية والهيكلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes&#160;</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (50 mL tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15878722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel adjustable pipette (100-1250 &#956;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>GE Healthcare HyClone</td>
			<td>SH304264.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A43075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EHS gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extracellular Matrix Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device</td>
			<td>Nanion Technologies&#160;</td>
			<td>19 1004 1005</td>
			<td>Hybrid cell analysis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium</td>
			<td>FCDI</td>
			<td>R1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51032678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent</td>
			<td>Nanion Technologies</td>
			<td>20 1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1250&#181;L)</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>94420813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>8096-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (e.g. 25 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16440901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum aspiration system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15567479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: VIAFLO ASSIST</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>4500</td>
			<td>Lab automation Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15365877</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid cell analysis system to assess structural and contractile changes of human ipsc-derived cardiomyocytes for preclinical cardiac risk evaluation

يعد تقييم انقباض القلب ذا أهمية كبيرة لتطوير علاجات جديدة وانتقالها الآمن إلى المراحل السريرية. في حين أن الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) تبشر بأن تكون بمثابة نموذج ذي صلة بالإنسان في المراحل قبل السريرية لاكتشاف الأدوية وسلامة الصيدلة ، إلا أن نضجها لا يزال مثيرا للجدل في المجتمع العلمي وقيد التطوير المستمر. نقدم تقنية الانقباض الهجين والمعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP) ، مما يضيف ميزات مهمة مؤيدة للنضج إلى منصة 96 بئرا متوافقة مع معايير الصناعة.
يراقب نظام المعاوقة / EFP الوظائف الخلوية في الوقت الفعلي. إلى جانب معدل ضربات الخلايا المقلصة ، تكتشف قراءات التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية التغيرات المورفولوجية التي يسببها المركب مثل كثافة الخلية وسلامة الطبقة الخلوية الأحادية. في المكون الآخر لنظام تحليل الخلايا الهجينة ، يتم استزراع الخلايا على أغشية متوافقة حيويا تحاكي البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب الحقيقية. تدعم هذه البيئة الفسيولوجية نضوج hiPSC-CMs في المختبر ، مما يؤدي إلى استجابات انقباضية تشبه البالغين بما في ذلك التأثيرات المؤثرة في التقلص العضلي الإيجابية بعد العلاج بالإيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil. كما تكشف معلمات مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ومدة النبض عن تأثيرات المصب للمركبات ذات التأثير على الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ومعالجة الكالسيوم.
يوفر النظام الهجين الأداة المثالية لتحليل الخلايا الشامل ، مما يسمح بتقييم مخاطر القلب قبل السريرية بما يتجاوز المنظورات الحالية للمقايسات القائمة على الخلايا ذات الصلة بالإنسان.

يوضح الشكل 1 تأثيرات مثبط الكيناز erlotinib على انقباض hiPSC-CMs. تمت معالجة الخلايا بتركيزات تتراوح من 10 نانومتر إلى 10 ميكرومتر لمدة 5 أيام وتم تسجيل معلمات النبض يوميا. كان ل Erlotinib ، وهو EGFR (مستقبل عامل نمو البشرة) ومثبط التيروزين كيناز مع مخاطر منخفضة نسبيا للسمية القلبية ، جرعة طف?...

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation at JoVE.

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

يعد تحليل التغيرات في وظيفة الانقباض والسلامة الخلوية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC ذا أهمية كبيرة لتطوير الأدوية غير السريرية. يعالج نظام تحليل الخلايا الهجين المكون من 96 بئرا كلا المعلمتين في الوقت الفعلي وبطريقة فسيولوجية للحصول على نتائج موثوقة وذات صلة بالإنسان ، وهي ضرورية للانتقال الآمن إلى المراحل السريرية.

نظام تحليل الخلايا الهجينة لتقييم التغيرات الهيكلية والمقلصة لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لتقييم مخاطر القلب قبل السريرية

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

يمكن أن تساعد الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بسلامة القلب والسمية قبل السريرية باستخدام بيانات حقيقية قائمة على الإنسان من أجل الانتقال الآمن للأدوية الجديدة المرشحة إلى المراحل السريرية. بدلا من استخدام مجموعة من التقنيات المختلفة في المختبر وفي الجسم الحي ، فإن الميزة الرئيسية لهذا النظام الهجين هي التقييم المتزامن لعضلة القلب البشرية المشتقة من iPC ، ومعلمات الفيزيولوجيا الكهربية والجدوى ، وتحليل خصائص الانقباض في ظل الظروف الفسيولوجية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لاكتشاف الأدوية لأنها تغطي التغيرات الفيزيولوجية الكهربية والهيكلية والانقباضية لخلايا عضلة القلب ونظام إنتاجية أعلى يسمح باختبار 69 بئرا في وقت واحد.لبدء طلاء اللوحة ، اترك الجزء السفلي من لوحة الانكماش مغطى بواقي الغشاء المزود بشكل إضافي حتى القياس في وحدة الانقباض. لبذر خلايا عضلة القلب ، قم بإعداد محلول طلاء جل EHS المخفف عن طريق نقل 2.75 ملليلتر من محلول EHS الجاهز للاستخدام و 8.25 ملليلتر من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم في أنبوب طرد مركزي معقم. ثم خلط الحل.قم بإزالة واقي الغشاء من لوحة الانكماش. انقل محلول الطلاء المحضر إلى خزان كاشف معقم في روبوت أتمتة المختبر. استخدم البرنامج ، وأضف 100 ميكرولتر باستخدام روبوت أتمتة المختبر وأضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل بئر.ثم ضع الغطاء مرة أخرى على لوحة 96 بئر واحتضانها لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد إذابة الخلايا وعدها ، اضبط الخلايا في وسط الطلاء الموصى به وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للخلية ، مما ينتج عنه 11 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل 11 ملليلتر لبذر لوحة كاملة من 96 بئرا. استخدم البرنامج لإزالة 100 ميكرولتر لإزالة محلول جل EHS من الآبار باستخدام روبوت أتمتة المختبر.بعد ذلك ، انقل 11 ملليلترا من معلق الخلية إلى خزان كاشف معقم يوضع في روبوت أتمتة المختبر ، وزرع الخلايا ب 100 ميكرولتر من المعلق لكل بئر. باستخدام البرنامج ، تضيف الخلايا 100 ميكرولتر. مباشرة بعد بذر الخلية ، انقل اللوحة المرنة المكونة من 96 بئرا إلى الحاضنة التي يتم التحكم فيها بالرطوبة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، واترك الخلايا تستقر طوال الليل.قم بتسخين 22 ملليلتر من وسط صيانة خلايا عضلة القلب لإضافتها إلى كل لوحة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. بعد 18 إلى 24 ساعة من بذر الألواح ، انقل الوسط الطازج إلى خزان كاشف معقم واتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. ثم قم بإجراء إزالة متوسطة مع البرنامج ، وإزالة 100 ميكرولتر.بعد ذلك ، ضع خزان الكاشف الذي يحتوي على الوسط الطازج في روبوت أتمتة المختبر وقم بتوزيع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل بئر مع البرنامج ، أضف 100 ميكرولتر. نفذ هذه الخطوة مرتين للوصول إلى 200 ميكرولتر لكل بئر. مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة إلى الحاضنة.قم بإجراء تبادل متوسط كل يوم حتى إضافة مركب. قبل أربع إلى ست ساعات من إضافة المركب ، قم بإجراء تغيير متوسط نهائي عن طريق نقل 22 ملليلترا من مخزن الفحص الطازج والدافئ إلى خزان كاشف معقم وتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة المرنة مرة أخرى إلى الحاضنة.قبل ساعة واحدة من قياس خط الأساس ، انقل اللوحة إلى جهاز القياس المعني. في برنامج التحكم ، افتح بروتوكول التحرير وحدد وضع القياس أو الموقع المرن أو EFP المعاوقة. حدد مدة المسح أو طول قياس واحد إلى 30 ثانية وفاصل التكرار إلى 10 دقائق قبل حفظ رقم البروتوكول.ثم حدد بدء البروتوكول واستمر في ملء الحقول المطلوبة. عند تعيين المعلمات، حدد بدء القياس. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاثة قياسات أساسية في فواصل زمنية مدتها خمس دقائق قبل وقت قصير من إضافة المركب.قم بإزالة 50 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت من كل بئر دون إزالة لوحة 96 بئر المرنة من جهاز القياس ، تليها إضافة 50 ميكرولتر من محلول المركب المركز أربع مرات في كل بئر من اللوحة وفقا لخطة القياس. بعد إضافة المركب ، حدد إضافة علامة كاشف لتحديد تخطيط اللوحة المركبة وحجم المحلول المركب. ثم حدد متابعة القياس القياسي أو تابع سلسلة القياس وفقا للخطة التجريبية.يظهر التحليل التمثيلي آثار مثبط الكيناز Erlotinib على انقباض خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC. عند أدنى تركيز ، تسبب Erlotinib في انخفاض غير ذي دلالة إحصائية في السعة ، بينما أظهرت تركيزات micromolar من Erlotinib تأثيرات سمية قلبية تعتمد على الوقت والجرعة. شوهدت بداية التأثير من 96 ساعة مع ميكرومولار واحد Erlotinib ، في حين أن العلاج ب 10 ميكرومولار Erlotinib أدى إلى انخفاض كبير بعد 24 ساعة من إضافة المركب.بعد تطبيق 10 ميكرومولار Epirubicin ، توقفت الخلايا عن الضرب في غضون 24 ساعة. مع تطبيق Epirubicin ميكرومولار واحد ، تبع انخفاض حاد في السعة بعد 24 ساعة توقف كامل للنبض حتى 48 ساعة. عند 100 نانومولار ، لوحظ انخفاض يعتمد على الوقت في سعة النبض.عند أدنى تركيز 10 نانومولار ، تذبذبت السعة بشكل مطرد ، مما يؤكد أن تأثير Epirubicin كان يعتمد فقط على الجرعة. العلاج مع دوكسوروبيسين ونيفيديبين لمدة 24 ساعة يقلل من صلاحية الخلية بطريقة تعتمد على التركيز والوقت. عند تطبيق تركيزات النيفيديبين المتزايدة ، تكشف تسجيلات الجهد الميداني على الخلايا عن تقصير يعتمد على التركيز في مدة الحقل الطبيعية.كما أظهر تقييم نيفيديبين فيما يتعلق بانقباض القلب انخفاضا كبيرا في السعة المعتمدة على التركيز عند القياس الحاد بتركيزات 10 نانومولار و 13 نانومولار. من المهم أن تتذكر أن الخلايا حساسة بشكل عام للمعلمات البيئية مثل تغيرات درجة الحرارة ودرجة الحموضة بالإضافة إلى المحاكاة الميكانيكية المدعومة بشكل خاص على ألواح الانكماش.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

تغليف الخلايا العضلية في هيدروجيل الفايبرين للهندسة الأنسجة القلبية

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

بروتوكول لنقل ميكرورنا إلى المشتقة من نخاع العظام المكونة للدم الخلايا الجذعية البالغة لتمكينها هندسة الخلايا جنبا إلى جنب مع استهداف المغناطيسي

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

شبكات خلايا القلب المستمدة من iPSC البشرية على صفائف متعدد الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتسجيلات المحتملة للعمل المتكرر

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

تقييم الكهربائيات القلبية قبل الاحتكين بواسطة الجهد المزدوج ورسم الخرائط البصرية الكالسيوم لشرائح القلب العضوية البشرية

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...